Dlk1蛋白胞外剪切部分的制药用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及创面治疗领域，更具体的是，本发明涉及DLK1蛋白胞外剪切部分在制 备促进创面愈合的药物中的用途。
【背景技术】
[0002] 外伤性创面、烧伤创面、糖尿病足、静脉瘀滞性溃疡、压力性溃疡以及感染、肿瘤切 除导致的各种急慢创面在临床上常见，对患者生活质量和劳动能力影响极大，并且给家庭 和社会带来了严重负担。近年来随着我国交通、建设的飞速发展及人口老龄化的加剧，各类 创面的发病率也有不断增高趋势。
[0003]瘢痕是各种创伤后所引起的正常皮肤组织的外观形态和组织病理学改变的统称， 它是人体创伤修复过程中必然的产物。从广义上说，没有瘢痕组织也就没有创伤的愈合。但 瘢痕生长超过一定的限度，就会发生各种并发症，诸如外形的破坏及功能活动障碍等，给患 者带来巨大的肉体痛苦和精神痛苦，尤其是烧伤、烫伤、严重外伤后遗留的瘢痕。
[0004] 目前临床上应用的创面治疗方案可分为手术及非手术治疗。手术治疗主要指清创 换药、植皮或皮瓣移植，主要适用于外伤性创面及烧伤创面或者压力性溃疡。对于各种不适 用手术治疗的创面，如小创面或者全身情况较差患者的较大创面，或者局部情况不佳的创 面，治疗以清创换药及局部外用药物为主。但是目前可用的外用促进创面愈合药物非常有 限，主要是生长因子类药物。而生长因子往往半衰期仅数分钟，效果不能让人满意，而且分 子量极小，容易吸收入血，长期大量使用对未成年人发育可能造成影响。因此，开发新的促 进创面愈合药物仍然非常必要。
[0005] 创面愈合过程的调节非常复杂，目前仍不完全清楚。但是目前已经证明局部微环 境中的部分非结构蛋白在创面愈合过程中起到了非常重要的调节作用。这些蛋白可能对上 皮细胞增殖、迁移、分化，成纤维细胞募集、增殖、激活、凋亡，炎症细胞浸润、细胞因子分泌 及胶原沉积、细胞外基质重塑起到重要影响。
[0006] Delta_likelhomolog(DLKl，又名 fetal antigenl，FA1 或 preadipocyte factorl， Pref-1)是一种跨膜蛋白，定位于人染色体14q32,为父系表达的印迹基因，由于其蛋白结 构和氨基酸序列与果蝇Notch配基Delta的对应结构有着高度同源性，因而得名。人DLK1 基因（GeneBank Access No. BC007741,)全长 1557bp，CDS 含有 1152 核苷酸，编码 383 个氨 基酸残基。DLK1蛋白是一种跨膜蛋白，包含细胞内信号肽，中间跨膜区及细胞外区。其胞 外结构域包含6个表皮生长因子结构，并且其胞外结构域可以被ADAM metallopeptidase domainl7剪切后形成一个可溶性的细胞外基质蛋白。目前研究已发现该剪切蛋白对多种细 胞分化和增殖有明显影响，并且DLK1蛋白在发育过程中起到重要作用。
[0007] DLK1，属于人类印迹基因的一种，国家人类基因组南方研究中心研究发现属于一 种促肝癌新基因，对肝癌的形成起到重大促进作用。
[0008] 也有通过对食管癌组织中Dlk-1蛋白表达的观察，探讨其临床意义，对食管癌及 癌旁正常组织两组中Dlk-1蛋白的表达以免疫组织化学方法进行检测，并对Dlk-1蛋白表 达与肿瘤分级及临床病理分期之间的相关性进行分析。结果Dlk-1蛋白在食管癌组的表 达与其在癌旁正常组织中的表达两者间存在显著的统计学差异（P〈〇. 01)。食管癌组织中 Dlk-1蛋白阳性表达与肿瘤临床病理分期呈正相关（P〈0.01)，与食管癌组织学分级负相关 (P〈0. 01)。结论Dlk-1蛋白的表达与食管癌的发生发展可能密切相关，将为食管癌的临床 治疗及预后分析等提供新的思路。（参见胡钦勇，黄卫彬，"食管癌组织中Dlk-1蛋白的表达 及其意义"，《中国实验诊断学》，2012年第8期）
[0009] 目前为止，DLK1在创面愈合中的作用还没有报导过。
【发明内容】
[0010] 本发明的一个目的是提供DLK1的新的制药用途。
[0011] 本发明的目的是通过下列构思来实现的：
[0012] 本发明的一个方面涉及DLK1蛋白胞外剪切部分在制备减少瘢痕形成的药物中的 用途。
[0013] 本发明的另一方面涉及DLK1蛋白胞外剪切部分在制备促进创面愈合的药物中的 用途。
[0014] DLK1蛋白是一种跨膜蛋白，包含细胞内信号肽，中间跨膜区及细胞外区。其胞 外结构域包含6个表皮生长因子结构，并且其胞外结构域可以被ADAMmetallopeptidase domainl7剪切后形成一个可溶性的细胞外基质蛋白，据此得到了本发明中使用的DLK1蛋 白胞外剪切部分。本发明中使用的DLK1蛋白胞外剪切部分具有如下的重组蛋白序列（280 个氨基酸）：AECFPACNPQNGFCEDDNVCRCQPGWQGPLCDQCVTSPGCLHGLCGEPGQCICTDGWDGELCDRDVR ACSS APCANNGTCVSLDDGLYECSCAPGYSGKDCQKKDGPCVINGSPCQHGGTCVDDEGRASHASCLCPPGFSGN F CEIVANSCTPNPCENDGVCTDIGGDFRCRCPAGFIDKTCSRPVTNCASSPCQNGGTCLQHTQVSYECLCK PEFTGLT CVKKRALSPQQVTRLPSGYGLAYRLTPGVHELPVQQPEHRILKVSMKELNKKTPLLTEGQ〇
[0015] 本文中所述的创面包括，但不限于，外伤性创面、烧伤创面、糖尿病足、静脉瘀滞性 溃疡、压力性溃疡以及感染、肿瘤切除导致的各种急慢创面。
[0016] 下文中使用的术语"DLK1"特指本发明使用的DLK1蛋白胞外剪切部分
【附图说明】
[0017] 图1A为正常人皮肤、人增生期瘢痕及人成熟期瘢痕DLK1免疫组织化学染色代表 性图片。
[0018] 图1B为DLK1在正常人皮肤、人增生期瘢痕及人成熟期瘢痕表皮及真皮中表达水 平的免疫组化结果定量。
[0019] 图1C为小鼠创面组织DLK1表达的免疫组化代表性图片。
[0020] 图1D为小鼠创面组织DLK1免疫组化表达情况的定量结果。
[0021] 图2A为DLK1蛋白的结构图。
[0022] 图2B为构建之蛋白表达载体不意图。
[0023] 图2C为表达并纯化的蛋白通过Western blot抗DLK1及抗strip- II抗体鉴定的 图谱。
[0024]图3A是显示实施例5中的Balb/c小鼠创面愈合的模型图。
[0025] 图3B是显示实施例5中的小鼠创面面积对时间的柱形图。
[0026] 图4A和4C是Masson三色染色图。
[0027] 图4B是给予或不给予DLK1所形成的瘢痕厚度的柱形图。
[0028] 图5A是显示角质形成细胞迁移的示意图。
[0029] 图5B是时间对迁移面积的柱形图。
[0030] 图5C是时间对HaCaT细胞增殖的柱形图
[0031] 图是时间对HDF细胞增殖的柱形图。
[0032] 图6是本发明所使用的DLKlmRNA的序列图。
[0033] 图7是V152质粒图。
【具体实施方式】
[0034] 下面基于下列具体实施例对本发明作进一步详细的阐述。
[0035] 实施例1 :免疫组化步骤
[0036] 人正常皮肤及增殖期瘢痕组织、成熟瘢痕组织及小鼠创面组织多聚甲醛固定，石 蜡包埋，切片，脱蜡至水；柠檬酸钠缓冲液水浴抗原修复；〇. 3%过氧化氢灭活内源性过氧化 物酶活性；10%BSA室温封闭1小时；兔抗小鼠DLK1-抗（Abcam(ab21682)，Cambridge，MA)4 度摇床孵育过夜，PBS清洗3次；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗室温摇床孵育1小时， PBS清洗3次；DAB发色，自来水洗10分钟；苏木素复染5分钟，自来水洗10分钟后盐酸乙 醇分化5秒，自来水洗10分钟；脱水透明后封片。
[0037] 实施例2 :人源性DLK1蛋白胞外剪切部分表达载体的构建及重组蛋白的表达、纯 化：
[0038] 1)DLK1蛋白胞外剪切部分过表达慢病毒载体构建
[0039] ①工具载体及目的基因
[0040] 载体名称：V152
[0041]质粒大小：9752bp
[0042]克隆位点：Nhe I/BamH I
[0043] 载体构建示意图：见图2B
[0044] 目的基因：DLK1，0RF全长840bp (基因序列详见图6)
[0045] ②DLK1基因的克隆
[0046] a.PCR引物的设计
[0047] 依据DLK1基因的cDNA片段序列（NM_003836. 5)设计引物，引物包含两段与模板 两端互补的寡核苷酸序列，引物由上海生工公司合成。
[0048]上游引物：5 'CTA GCT AGC AGC TGA ATG CTT CCC GGC CTG3'
[0049]下游引