物：5，CGC GGA TCC CTG GCC CTC GGT GAG GAG3，
[0050] 上游引物加的是Nhe I酶切位点；
[0051] 下游引物加的是BamH I酶切位点。
[0052] 斜体部分为保护性碱基，斜体加粗体部分为酶切位点，红色碱基是为了保证和 V152的读码框一致而增加的碱基，扩增FA1DNA片段长度为840bp。
[0053]b.PCR扩增目的基因片段
[0054] 按以下成分分别依次加入PCR管内加以混合
[0055] 成分体积（|Lll) 终浓度 10X Buffer for KOD-Plus 5 IX 2mM dNTPs 5 0.2mM 25mM MgS04 2 1.0 mM 10pmol/)diD丨物 1.5 0.3 ,uM 10pm〇j/|u.l.jri?引物 1.5 0.3jiM 模板DNA 1.5 50ng/^l KOD-Plus多聚i)梅（1 .OU/jd) 1 1.0U/50,ul 双蒸水 .个.50,ul N/A
[0056] 使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的基因DNA片段。
[0057] ③目的基因和质粒的酶切和连接
[0058] a?酶切
[0059] 双酶切反应体系成分体积 NEB buffer 4# 5(il BSA 100X 0.5^1 Nhe I l|ul BamH I 0.5(.il 质粒/目的基因DNA 3^g 双蒸水 .个.50|ul
[0060] 轻弹管壁混匀，离心数秒，使得液体积于管底。然后置于37°C水浴箱水浴4小时。 65°C水浴作用10分钟终止酶切反应。酶切反应液直接进行凝胶电泳并回收，具体操作见前 文。
[0061] b?连接
[0062] 经限制性内切酶处理后的载体及目的基因片段进行相互连接，体积按下列方法在 PCR管中建立20ul的连接反应体系：
[0063] 成分 质粒酶切产物 25ng 目的基因酶切产物 l〇ng
[0064] NEB T4缓冲液 2^1 NEB T4连接酶 10 双蒸水个:20pl
[0065] c.向转化混合物中加入900 ill不含抗生素的LB培养基并混合摇匀，置于37°C摇 床150rpm，转振菌培养45分钟；
[0066] d?室温4000rpm离心3分钟；
[0067] e.留底部150 ill培养液，并用枪头使细菌重悬于LB培养液中；
[0068] f.将适量体积已经转化的感受态细菌转移到含抗生素的LB琼脂平板上，用无菌L 棒轻轻涂布均匀，将平板置于室温直至液体被吸收。倒置平皿于37°C恒温箱培养过夜。15 小时后观察出现的菌落。
[0069] ③接菌
[0070] a.挑取白色单个菌落，置入5ml含氨苄青霉素的LB液体培养基(含氨苄青霉素 5iil)中；
[0071] b. 37°C摇床260rpm，16小时振菌培养过夜；
[0072] c.培养菌液取出后留取200 iil，加入200iil40%甘油对半稀释，_80°C冰箱保存留 种，其余菌液送上海生工公司测序。
[0073] 3)重组质粒的抽提
[0074] ①重组质粒的转化扩增
[0075] V152-FA1质粒转化菌液经测序证实重组成功后，取留种菌液重悬后涂板培养，菌 落形成后，挑取单个菌落摇菌培养，具体操作见前文。
[0076] ②重组质粒抽提
[0077] 使用质粒小提试剂盒抽提V152-FA1质粒，具体步骤如下：
[0078] a?柱平衡步骤：向吸附CP3 (吸附柱放入收集管中）加入500iU的平衡液BL， 12, OOOrpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
[0079]b.取1~5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12, OOOrpm 离心1分钟，尽量吸除上清；
[0080] C.向留有菌体沉淀的离心管中加入250 ill溶液P1，使用移液器彻底悬浮细菌沉 淀；
[0081] d.向离心管中加入250i!1溶液P2,温和地上下翻转6~8次，使菌体充分裂解， 避免剧烈震荡，以免打断基因DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片段；
[0082] e.向离心管中加入350 ii 1溶液P3,立即吻合地上下翻转6~8次，充分混匀，此 时将出现白色絮状沉淀，12, OOOrpm离心10分钟，此时在离心管底部形成沉淀；
[0083] f.将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）， 注意尽量不要吸出沉淀。12, OOOrpm离心30~60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3 放入收集管中；
[0084] g.向吸附柱CP3中加入500 ill去蛋白液H)，12, OOOrpm离心30~60秒，倒掉收 集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中；
[0085] h.向吸附柱CP3中加入600 ill漂洗液PW，12, OOOrpm离心30~60秒，倒掉收集 管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中；
[0086] i.重复操作步骤h ;
[0087] j.将吸附柱CP3放入收集管中，12,OOOrpm离心2分钟，目的是将吸附柱中残余的 漂洗液去除，将吸附柱CP3开盖，置于室温放置20分钟，以彻底晾干吸附材料中残余漂洗液 中的乙醇；
[0088] k.将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50~ 100 yl洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟，12, OOOrpm离心2分钟，将质粒溶液收集到离心管 中；
[0089] 1.回收得到的重组质粒用紫外分光光度计检测浓度和纯度后，置-20°C保存。
[0090] 4) V152-FA1表达蛋白载体转染EBNA-293细胞
[0091] ①准备细胞：EBNA-293细胞使用含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、0? lmg/ml链霉 素的DMEM培养基，于5%C02、37°C恒温培养箱中培养，转染前一天细胞消化传代至6孔培养 皿中，生长过夜至70~90%的覆盖度；
[0092]②准备转染复合物：
[0093] a. 100 ill无血清培养基或Opti-MEM I培养基；
[0094] b?加入 3 ~6 ii 1X-tremeGENEOTNA转染试剂；
[0095] c.短暂轻柔漩涡(不超过10秒）；
[0096] d?加入 1-2ii gV152-FA1 重组质粒；
[0097] e?短暂轻柔漩涡；
[0098] f ?室温孵育15~30分钟（15至25 °C )。
[0099] ③将转染复合物逐滴均匀加入到EBNA-293细胞中，转染48小时后细胞换液，改用 含有2 y g/ml puromycin的DMEM全培液培养筛选细胞；
[0100] ④细胞puromycin筛选4~5天后，传代至2~3个10cm培养皿。长满后一部分 冻存，另一部分传代至多个l〇cm培养皿，长至60~70%覆盖度，更换新鲜培养基，分别在第 2、4和6天收集培养液，离心去除细胞碎片后，冻存至-20°C，以备抽提纯化蛋白。
[0101] 5)亲和层析法纯化蛋白
[0102] ①清洗柱子：柱子储存于4~8°C，将柱子上面的帽子拧开，用2CVs的缓冲液W清 洗Strep-Tactin柱。注意重力沉降过程中不要使柱子干燥；
[0103] ②样品上柱：样品上柱体积在0. 5~lOCVs。上样体积过大或浓度过稀可能会造 成得率下降；
[0104] ③洗柱：等样品完全进柱后，用5CV的缓冲液W(对于重力沉降来说，应该5次分批 加入）洗柱，并收集每部分的洗脱液；
[0105] ④目的蛋白的洗脱：加入6倍的0. 5CVS的缓冲液E并在每段（0. 5CV)收集。收集 每一部分并各取20 iiL SDS-PAGE鉴定，融合标签蛋白通常在2nd到5nd部分；
[0106] ⑤柱子再生：首先，用15CVs的缓冲液R去除D-脱硫生物素(分3次加入)。缓冲 液R上柱后显示红色，若整个柱子完全变为红色，则依此来判断D-脱硫生物素去除完全(若 仍然没有完全变红，则需要加入更多的缓冲液R)。最后再用8CVs缓冲液W洗柱子，洗过之 后，可以做下次纯化。
[0107] 6)纯化蛋白的鉴定
[0108] 层析洗脱液用紫外分光光度计检测蛋白浓度和纯度，并分别使用目的蛋白DLK1 抗体及标签蛋白Strep II -tag抗体，Western blot免疫印记法鉴定抽提纯化的FA1蛋白 (图 2C)。
[0109]DLK1蛋白胞外剪切部分重组蛋白序列（280个氨基酸）：AECFPACNPQNGFCEDDNVCRC QPGWQGPLCDQCVTSPGCLHGLCGEPGQCICTDGWDGELCDRDVRACSS APCANNGTCVSLDDGLYECSCAPGYSGK DCQKKDGPCVINGSPCQHGGTCVDDEGRASHASCLCPPGFSGN