用浓度，石油 醚提取物溶液终浓度为 50(^g /ml，25(^g /ml，125Pg /ml，62.5Pg /ml，31.25Pg /ml， 15. 63Pg /ml和L 8Mg /ml。每个处理设置5个重复孔。
[0020] 对照组：非小细胞肺癌A549的培养孔内加入DMS0,每孔加入?μL，然后再向每个培 养孔中补加100K1RPMI-1640完全培养基，一共设置5个DMSO阴性对照孔。
[0021] 将上述培养板置于37°C，5%C02的培养箱内继续培养72h。
[0022] 72h后向每孔加入2〇μ1新鲜配制的浓度为5mg/ml的四甲基偶氮唑盐（MTT)溶液， 并在37°C，5%C0 2的条件下继续培养4h，小心吸除上清；每孔加入10〇μ1的DMS0,室温下震 荡10min，在多功能酶标仪上测定各孔在490nm处的吸光值（0D值)，按公式计算癌细胞生长 抑制率：癌细胞增殖抑制率=(对照孔测定的平均OD值-加药组测定的平均OD值)/对照 孔测定的平均OD值X 100%。
[0023] 利用GraphPad Prism 5软件对结果进行分析处理，得到灰灰菜全株植物石油醚相 提取物对非小细胞肺癌A549作用72h后的半数抑制浓度（IC5tl),结果如下表1所示：表1
灰灰菜全株植物的石油醚提取物对A549细胞分别作用24h，48h，72h后生长抑制的剂 量-效应柱形图如图1所示；结果显示随着提取物处理细胞浓度的增加及作用时间的延长， 其对A549细胞的生长抑制明显的增加，呈现明显的剂量-时间依赖效应。
[0024] 细胞克隆形成试验 A549细胞进入对数生长期后，加入0. 25%的EDTA-胰蛋白酶溶液消化细胞。用RPMI 1640培养液将细胞稀释成密度为200个/ml的细胞悬液，加入6孔细胞培养板中，每孔加 入Iml肿瘤细胞悬液。接种细胞后继续培养24h加入向每个孔中各加入10 μ 1终浓度为 7. 81，15. 63, 31. 25,62. 5和125Pg/ml石油醚相提取物，对照组加入10 μ 1的DMSO,再向每 个孔补加 Iml的RPMI1640培养基，继续培养12天后弃培养基，4%多聚甲醇固定，结晶紫染 色，显微镜下观察，计算细胞数大于50的细胞克隆数；结果如图2所示，随着提取物浓度的 增加，形成的细胞克隆数目明显的减少，提取物对细胞的毒性呈现明显的剂量依赖性。
[0025] Hoechst33342 染色试验： A549细胞进入对数生长期后，加入0. 25%的EDTA-胰蛋白酶溶液消化细胞。用RPMI 1640培养液将细胞稀释成密度为IX IO5个/ml的细胞悬液，加入24孔细胞培养板中，每孔 加入1ml肿瘤细胞悬液。细胞接种后继续培养24h加入向每个孔中各加入10 μ 1终浓度为 62. 5ug/ml和31. 25ug/ml的灰灰菜石油醚相提取物，对照组加入10 μ 1的DMSO,再向每个 孔补加 Iml的RPMI-1640培养基，继续培养24h。弃掉培养基，PBS洗1遍，4%多聚甲醛固 定15-20min，PBS洗2遍，Hoechst33342染色液室温下避光染色30min，PBS洗2遍，用倒置 荧光显微镜蓝色荧光观察、拍照。结果如图在灰灰菜浓度62. 5 μ g/ml时如图3B所示与细 胞对照组（图3A)相比，加药物的细胞出现核染色质皱缩，出现月牙形或者是断裂的片段，亮 度增加，明显的细胞早期凋亡的细胞学表型 细胞周期检测： A549细胞进入对数生长期后，加入0. 25%的EDTA-胰蛋白酶溶液消化细胞。用RPMI 1640培养液将细胞稀释成密度为5 X IO5个/ml的细胞悬液，加入6孔细胞培养板中，每孔 加入1ml肿瘤细胞悬液。细胞接种后继续培养24h，向孔中各加入10 μ 1终浓度为62. 5ug/ ml和31. 25ug/ml灰灰菜石油醚相提取物，对照组加入10 μ 1的DMSO,再向每个孔补加 Iml 的RPMI1640培养基，继续培养24h。用胰酶消化细胞，1000 g离心3-5分钟沉淀细胞。小心 吸除上清加入1ml冰浴预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。再次加入 Iml冰浴预冷的PBS，重悬细胞。1000 g离心3-5分钟沉淀细胞，75%冰浴预冷的95%乙醇重 悬细胞混匀后4°C固定24h。洗去固定液，碘化丙啶染色室温下避光孵育30min，流式细胞仪 检测，其结果用Flowjo. 7. 6软件进行分析。结果如图4所示灰灰菜全株植物石油醚相提取 物以62. 5ug/ml的浓度处理细胞后（图4C) Gl期占76. 93%，31. 25ug/ml的浓度处理细胞后 (图4B)G1期占69. 74%与对照组细胞（图4A)相比细胞周期明显的阻滞在Gl期且对着药物 浓度的增加 Gl期阻滞效果越明显。
[0026] 细胞凋亡检测： A549细胞进入对数生长期后，加入0. 25%的EDTA-胰蛋白酶溶液消化细胞。用RPMI 1640培养液将细胞稀释成密度为5 X IO5个/ml的细胞悬液，加入6孔细胞培养板中，每孔 加入1ml肿瘤细胞悬液；细胞接种24h后，加入10 μ 1终浓度为62. 5ug/ml和31. 25ug/ml 石油醚提取物，对照组加入10 μ 1的DMSO,再向每个孔补加 Iml的RPMI1640培养基，继续 培养24h。用4°C预冷的PBS洗细胞两次，用250 μ 1结合缓冲液重新重悬细胞，加入5 μ 1 Annexin V/FITC和10μ1 20μg/ml的碘化丙啶溶液，混匀后于室温避光孵育15min。流式 细胞仪检测，其结果用Flowjo. 7. 6软件进行分析。结果如图5所示灰灰菜全株植物石油醚 相提取物以62. 5ug/ml的浓度处理细胞后（图5C)细胞凋亡比率为23. 3%，31. 25ug/ml的浓 度处理细胞后（图5B)细胞凋亡率为11. 9%，与对照组细胞（图5A)相比提取物能诱导细胞的 凋亡且随着药物浓度的增加细胞的凋亡率也随之增加。
【主权项】
1. 灰灰菜全株植物提取物在制备抗非小细胞肺癌药物中的应用。2. 根据权利要求1所述灰灰菜全株植物提取物在制备抗非小细胞肺癌药物中的应用， 其特征在于，灰灰菜全株植物提取物的制备方法具体包括以下步骤： (1) 利用乙醇对灰灰菜全株植物枝叶进行浸泡过夜，然后超声提取至少3次，每次提取 0.5~2h，减压抽滤得到乙醇提液，再多次用相同体积的乙醇浸泡并重复第一次的提取流程， 直到乙醇提取液无色为止，最后合并所有的乙醇提取液； (2) 利用旋转蒸发仪对灰灰菜叶的乙醇提取液进行减压蒸馏，得到乙醇提取物浸膏，然 后用蒸馏水对其进行溶解； (3) 用石油醚对灰灰菜全株植物乙醇提取物的水溶液进行多次萃取，直到萃取相无色 为止，合并多次萃取得到石油醚相萃取物。3. 根据权利要求2所述灰灰菜全株植物提取物在制备抗非小细胞肺癌药物中的应用， 其特征在于：所述超声提取的温度为50~80°C，功率为200W。4. 根据权利要求2所述灰灰菜全株植物提取物在制备抗非小细胞肺癌药物中的应用， 其特征在于：所述乙醇的体积百分比浓度为95%。
【专利摘要】本发明公开灰灰菜全株植物提取物的新用途，属于药物、天然药物技术领域。该新用途是灰灰菜全株植物石油醚相的提取物在制备抗非小细胞肺癌药物中的应用。所述提取物的制备方法如下：以95%乙醇为提取剂，利用超声提取法对灰灰菜全株进行提取，得到其乙醇总提物，然后用石油醚对乙醇总提物进行萃取，浓缩萃取液得到石油醚相提取物。本发明所提供的灰灰菜全株植物的石油醚相提取物对非小细胞肺癌A549细胞具有明显的抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡作用。
【IPC分类】A61P35/00, A61K36/185
【公开号】CN104983756
【申请号】CN201510263636
【发明人】赵扬, 赵婷, 李拓, 梁超, 潘卉, 冯阳
【申请人】昆明理工大学
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年5月22日