养24 h。然后加入阿霉素达到10 μ g/mL，培养24h后，MTT法检测细胞活力。
[0027] ⑵UVB诱导成纤维细胞HS68光毒性氧化损伤保护能力评价： UVB被认为是最危险的环境致癌物质，通过产生大量的活性氧（ROS)危害对人体健康。 近期，本课题组研宄发现UVB的光毒性主要是由细胞脂质过氧化造成的（Song et al. The photocytotoxicity of different lights on mammalian cells in interior lighting system. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology 117 (2012) 13 -18)。因此，本实验采用UVB诱导成纤维细胞HS68光毒性氧化损伤细胞模型来评价黑果枸杞 果渣天然复合抗氧化剂对于光毒性的保护作用。
[0028] 具体操作：人皮肤成纤维细胞HS68采用DMEM培养基(含10%新生牛血清、2mM谷氨 酸盐、1%链霉素/青霉素）培养，培养条件为温度37°C、5% CO2的无菌环境。培养基每2~3 天更换一次，细胞培养24h并达到80%聚集程度时，向培养基中加入黑果枸杞果渣天然复合 抗氧化剂，使其终浓度达到〇，10，20 or 40 μ g/mL培养24h。然后暴露在120 mj/cm2剂 量的UVB光线下（（Philips TL 20W/12RS荧光灯管，发射光谱285~350 nm，峰值310~315 nm)，继续培养24h后，MTT法检测细胞活力。
[0029] ⑶结论如表2所示。细胞暴露于阿霉素或UVB后，细胞活力显著下降。给予黑果 枸杞果渣天然复合抗氧化剂或葡萄籽提取物（GSE)后，细胞活力显著增高，表明黑果枸杞果 渣天然复合抗氧化剂或葡萄籽提取物（GSE)能够显著保护阿霉素诱导的心肌细胞心脏毒性 损伤和UVB诱导的人表皮成纤维细胞光毒性损伤。而且，在心脏毒性细胞损伤保护方面，黑 果枸杞果渣天然复合抗氧化剂的保护能力优于同剂量阳性对照药物GSE但无显著差别；在 光毒性细胞损伤保护方面，黑果枸杞果渣天然复合抗氧化剂的保护能力接近阳性对照药物 GSE。因此，可以看出本发明制备得到黑果枸杞果渣天然复合抗氧化剂具有良好的抗氧化活 性和细胞氧化损伤保护作用。
[0030] 表2黑果枸杞果渣天然复合抗氧化剂细胞氧化损伤保护能力评价结果
注：与空白对照组相比，#产< 0. 01 ;与损伤模型组相比，*产< 0. 05、**产< 0. 01、M产 < 0.0 Olo
[0031] 4、本发明操作简单、安全性好。
【具体实施方式】
[0032] 实施例1 一种黑果枸杞天然复合抗氧化剂的制备方法，包括以下步骤： ⑴将黑果枸杞果渣与复合酶溶液按1 :6的质量体积比（g :mL)混匀后，在温度为40°C 的条件下静置60 min，得到混合溶液。
[0033] 其中：黑果枸杞果渣是指茄科枸杞属多年生灌木植物黑果枸杞（ rwiAeflicw? Murr.)成熟果实榨汁后的固体废弃物。
[0034] 复合酶溶液是指将纤维素酶与果胶酶等质量混合后溶解于水中，所得到的pH为 4~5的溶液。
[0035] ⑵将混合溶液与体积浓度为95%的乙醇混合，直至混合溶液中乙醇浓度达到75%， 然后在超声波-微波反应器中反应，得到黑果枸杞果渣提取物。
[0036] 其中：超声波-微波反应器的反应条件是指超声波功率为800 W、微波功率为300 W、反应时间为35 min、反应温度为70°C。
[0037] ⑶将黑果枸杞果渣提取物与水按I :10的质量体积比（g :mL)混匀后离心，得到上 清液，该上清液上弱极性大孔树脂色谱柱进行纯化，并依次用2倍柱体积的水和体积浓度 为70~90%的乙醇水溶液洗脱，收集乙醇溶液洗脱液，该洗脱液经减压浓缩至原洗脱液体积 的30%后得到浓缩产物；浓缩产物于-70°C预冻4 h后经冷冻干燥，即得到黑果枸杞果渣天 然复合抗氧化剂。
[0038] 其中：离心的条件是指转速为4000 rpm，时间为20min。
[0039] 减压浓缩的条件是指真空度0. 05 MPa，温度50°C。
[0040] 冷冻干燥的条件是指真空度为10 Pa、温度为-55°C、干燥时间为72 h。
[0041] 实施例2 -种黑果枸杞天然复合抗氧化剂的制备方法，包括以下步骤： ⑴将黑果枸杞果渣与复合酶溶液按I :7. 5的质量体积比（g :mL)混匀后，在温度为 50°C的条件下静置40 min，得到混合溶液。
[0042] 其中：黑果枸杞果渣是指茄科枸杞属多年生灌木植物黑果枸杞（ rwiAeflicw? Murr.)成熟果实榨汁后的固体废弃物。
[0043] 复合酶溶液是指将纤维素酶与果胶酶等质量混合后溶解于水中，所得到的pH为 4~5的溶液。
[0044] ⑵将混合溶液与体积浓度为100%的乙醇混合，直至混合溶液中乙醇浓度达到 75%，然后在超声波-微波反应器中反应，得到黑果枸杞果渣提取物。
[0045] 其中：超声波-微波反应器的反应条件是指超声波功率为1000 W、微波功率为330 W、反应时间为32 min、反应温度为60°C。
[0046] ⑶将黑果枸杞果渣提取物与水按I :15的质量体积比（g :mL)混匀后离心，得到上 清液，该上清液上弱极性大孔树脂色谱柱进行纯化，并依次用3倍柱体积的水和体积浓度 为70~90%的乙醇水溶液洗脱，收集乙醇溶液洗脱液，该洗脱液经减压浓缩至原洗脱液体积 的30%后得到浓缩产物；浓缩产物于-85°C预冻6 h后经冷冻干燥，即得到黑果枸杞果渣天 然复合抗氧化剂。
[0047] 其中：离心的条件是指转速为5000 rpm，时间为15min。
[0048] 减压浓缩的条件是指真空度0. 08 MPa，温度70°C。
[0049] 冷冻干燥的条件是指真空度为100 Pa、温度为-70°C、干燥时间为24h。
[0050] 实施例3 -种黑果枸杞天然复合抗氧化剂的制备方法，包括以下步骤： ⑴将黑果枸杞果渣与复合酶溶液按1 :7的质量体积比（g :mL)混匀后，在温度为45°C 的条件下静置50 min，得到混合溶液。
[0051 ] 其中：黑果枸杞果澄是指前科枸杞属多年生灌木植物黑果枸杞（ rwiAeflicw? Murr.)成熟果实榨汁后的固体废弃物。
[0052] 复合酶溶液是指将纤维素酶与果胶酶等质量混合后溶解于水中，所得到的pH为 4~5的溶液。
[0053] ⑵将混合溶液与体积浓度为98%的乙醇混合，直至混合溶液中乙醇浓度达到75%， 然后在超声波-微波反应器中反应，得到黑果枸杞果渣提取物。
[0054] 其中：超声波-微波反应器的反应条件是指超声波功率为900 W、微波功率为320 W、反应时间为33 min、反应温度为65°C。
[0055] ⑶将黑果枸杞果渣提取物与水按I :12的质量体积比（g :mL)混匀后离心，得到上 清液，该上清液上弱极性大孔树脂色谱柱进行纯化，并依次用2. 5倍柱体积的水和体积浓 度为70~90%的乙醇水溶液洗脱，收集乙醇溶液洗脱液，该洗脱液经减压浓缩至原洗脱液体 积的30%后得到浓缩产物；浓缩产物于-75°C预冻5h后经冷冻干燥，即得到黑果枸杞果渣 天然复合抗氧化剂。
[0056] 其中：离心的条件是指转速为4500 rpm，时间为18min。
[0057] 减压浓缩的条件是指真空度0· 06 MPa，温度60°C。
[0058] 冷冻干燥的条件是指真空度为50 Pa、温度为_60°C、干燥时间为48 h。
[0059] 上述实施例1~3中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0060] 上述实施例1~3中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0061] 微波提取装置为XH-300B微波超声波合成/萃取仪(北京祥鹄科技发展有限公 司），冷冻干燥机为FD-2型冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司）。
【主权项】
1. 一种黑果枸杞天然复合抗氧化剂的制备方法，包括以下步骤： ⑴将黑果枸杞果渣与复合酶溶液按I :6~7. 5的质量体积比混匀后，在温度为40~50°C 的条件下静置40~60 min，得到混合溶液； ⑵将所述混合溶液与体积浓度为95~100%的乙醇混合，直至混合溶液中乙醇浓度达到 75%，然后在超声波-微波反应器中反应，得到黑果枸杞果渣提取物； ⑶将所述黑果枸杞果渣提取物与水按1 :1〇~15的质量体积比混匀后离心，得到上清 液，该上清液上弱极性大孔树脂色谱柱进行纯化，并依次用2~3倍柱体积的水和体积浓度 为70~90%的乙醇水溶液洗脱，收集乙醇溶液洗脱液，该洗脱液经减压浓缩至原洗脱液体积 的30%后得到浓缩产物；所述浓缩产物于-70°C ~ -85°C预冻4~6 h后经冷冻干燥，即得到 黑果枸杞果渣天然复合抗氧化剂。2. 如权利要求1所述的一种黑果枸杞天然复合抗氧化剂的制备方法，其特征在于：所 述步骤⑴中的黑果枸杞果渣是指茄科枸杞属多年生灌木植物黑果枸杞成熟果实榨汁后的 固体废弃物。3. 如权利要求1所述的一种黑果枸杞天然复合抗氧化剂的制备方法，其特征在于：所 述步骤⑴中的复合酶溶液是指将纤维素酶与果胶酶等质量混合后溶解于水中，所得到的PH 为4~5的溶液。4. 如权利要求1所述的一种黑果枸杞天然复合抗氧化剂的制备方法，其特征在于：所 述步骤⑵中超声波-微波反应器的反应条件是指超声波功率为800~1000 W、微波功率为 300~330 W、反应时间为32~35 min、反应温度为60~70°C。5. 如权利要求1所述的一种黑果枸杞天然复合抗氧化剂的制备方法，其特征在于：所 述步骤⑶中离心的条件是指转速为4000~5000 rpm，时间为15~20min。6. 如权利要求1所述的一种黑果枸杞天然复合抗氧化剂的制备方法，其特征在于：所 述步骤⑶中减压浓缩的条件是指真空度0. 05~0. 08 MPa，温度50~70°C。7. 如权利要求1所述的一种黑果枸杞天然复合抗氧化剂的制备方法，其特征在于：所 述步骤⑶中冷冻干燥的条件是指真空度为10~100 Pa、温度为-55°C ~ -70°C、干燥时间为 24-72 h〇
【专利摘要】本发明涉及一种黑果枸杞天然复合抗氧化剂的制备方法，该方法包括以下步骤：⑴将黑果枸杞果渣与复合酶溶液混匀后静置，得到混合溶液；⑵将混合溶液与乙醇混合，直至混合溶液中乙醇浓度达到75%，然后在超声波-微波反应器中反应，得到黑果枸杞果渣提取物；⑶将黑果枸杞果渣提取物与水混匀后离心，得到上清液，该上清液上弱极性大孔树脂色谱柱进行纯化，并依次用水和乙醇水溶液洗脱，收集乙醇溶液洗脱液，该洗脱液经减压浓缩得到浓缩产物；所述浓缩产物经冷冻干燥，即得到黑果枸杞果渣天然复合抗氧化剂。本发明操作简单、提取率高。
【IPC分类】A61P39/06, A61K36/815
【公开号】CN104983915
【申请号】CN201510433968
【发明人】高婷婷, 毕宏涛, 陶燕铎, 邵赟
【申请人】中国科学院西北高原生物研究所
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年7月23日