用于结核病的预防或治疗的合成免疫原的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及编码结核病（TB)免疫原（编码免疫原性TB抗原）的多价构建体。每 一种构建体编码多个免疫原性TB抗原并且具有被设计用于高水平表达的的编码序列。提 供了预防性和治疗性疫苗，以及制造和使用所述疫苗来诱导免疫应答、从而预防TB感染和 治疗感染TB病毒的个体的方法。
【背景技术】
[0002] 结核病（TB)是在全球具有显著发病率和死亡率的重大传染病。目前唯一得到许 可的针对TB的疫苗是卡介苗（BacillusCalmette-Guerin)(BCG)疫苗。不幸的是，该疫苗 赋予弱的抗成人肺TB的保护作用，并且已与不利事件相关联。因此，迫切需要开始诱导抗 TB的长效保护作用的新型有效的疫苗。然而，由于多种因素，迄今只研究了少数已被确定 为诱导针对TB的T细胞免疫的只有几个抗原。这些抗原包括Ag85A、Ag85B、ESAT6、TB10. 4 和Mtb39a。一个问题是，存在许多从其选择的TB抗原并且目前用于递送TB抗原的技术是 有限的和昂贵的。
[0003] 仍然存在对可诱导针对免疫原性TB抗原的免疫应答的、保护以免受TB感染和为 被TB感染的个体提供有效治疗的经济有效的TB疫苗和方法的需要。还存在对使得能够进 行大规模抗TB疫苗接种的具有成本效益的递送系统的需要。
【附图说明】
[0004] 图1A描绘多价esx疫苗质粒的构建和三价表达载体的体外表达。
[0005] 图1B提供显示5个esx构建体的抗原表达的数据。
[0006] 图2A和图2B显示多价TB疫苗构建体的经修饰的氨基酸插入序列。
[0007] 图3显示响应多价疫苗施用的体液免疫应答。
[0008] 图4A-图4C提供显示对多价疫苗的细胞免疫应答的柱形图。
[0009] 图 5A和 5B描绘pVSW、pBCU、pDQE、pHAT和pORF(pVSW. 2、pBCU. 2、pDQE. 2、pHAT. 2 和pORF. 2)插入物和质粒的新形式的构建并且包括显示所述插入物在用所述质粒转染的 哺乳动物细胞中表达的实验结果。
[0010] 图6A-图6F显示实验设计和来自比较针对质粒的5种新形式（pVSW、pB⑶、pDQE、 pHAT和pORF的新形式（pVSW. 2、pBCU. 2、pDQE. 2、pHAT. 2 和pORF. 2))的每一种中包含的 3 种特定esx抗原的每一种诱导的免疫应答的实验的结果。图6A描述实验设计。图6B显示 利用质粒pDQE的新形式接种的小鼠中的针对esxD、esxQ和esxE的免疫应答的实验结果。 图6C显示利用质粒pVSW的新形式接种的小鼠中的针对esxV、esxS和esxW的免疫应答的 实验结果。图6D显示利用质粒pBCU的新形式接种的小鼠中的针对esxB、esxC和esxU的 免疫应答的实验结果。图6E显示利用质粒pORF的新形式接种的小鼠中的针对esX〇、eSXR 和esxF的免疫应答的实验结果。
[0011] 图 7A-图 7C显示评价利用pVSW、pBCU、pDQE、pHAT和pORF的新形式（pVSW. 2、 pBCU. 2、pDQE. 2、pHAT. 2和pORF. 2)的组合接种后的esx-特异性CD4和CD8T细胞应答的 实验的实验结果。图7A显示用于分析对于IFN-和TNF-细胞因子都是阳性的CD4和CD8T 细胞的频率的门控策略。图7B显示esx-特异性⑶4T细胞免疫应答。图7C显示esx-特 异性CD4T细胞免疫应答。
[0012] 图8A-图8C显示实验设计和来自将利用RSQ-15 (每一种pVSW、pBCU、pDQE、pHAT 和pORF的新形式（pVSW. 2、pBCU. 2、pDQE. 2、pHAT. 2和pORF. 2)的混合物）免疫的动物的 免疫应答与由TB疫苗BCG诱导的免疫应答相比较的实验的结果。
[0013] 图9A-图9C显示实验设计和来自比较利用BCG免疫并利用RSQ-15加强一次或两 次或无加强的动物的esx-特异性免疫应答的初免加强实验的结果。
[0014]图 10A-图 10C显示利用一种pORF、pHAT或pVSW的新形式（pORF. 2、pHAT. 2 或 pVSW. 2)诱导的针对亚家族直系同源物成员的免疫应答的交叉反应性。
【发明内容】
[0015] 提供了包含编码选自以下的氨基酸序列的核酸分子的组合物：SEQIDN0:2、SEQ IDN0:4、SEQIDN0:6、SEQIDN0:8、SEQIDN0:10、SEQIDN0:12、SEQIDN0:14、SEQID NO: 16、SEQIDNO: 18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQ IDN0:28、其具有至少90%的全长的片段、具有至少95%的同源性的同源序列以及具有至 少95 %同源性的同源序列的片段，具有至少95 %的同源性的同源序列的所述片段具有至 少90 %的全长。
[0016]提供了包含选自SEQIDN0:1、SEQIDN0:3、SEQIDN0:5、SEQIDN0:7、SEQID N0:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQID NO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25 和SEQIDNO:27 的核酸分子的组合物。
[0017] 提供了SEQIDNO: 19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25 以及SEQID N0:27SEQIDN0:1、SEQIDN0:3、SEQIDN0:5、SEQIDN0:7、SEQIDN0:9、SEQIDN0:11、 SEQIDN0:13、SEQIDN0:15、SEQIDN0:17、SEQIDN0:19、SEQIDN0:21、SEQIDN0:23、 SEQIDNO:25 和SEQIDNO:27。
[0018] 提供了包含含有SEQIDNO: 19的质粒、含有SEQIDN0:21的质粒、含有SEQID NO:23的质粒、含有SEQIDNO:25的质粒和含有SEQIDNO:27的质粒的组合物。
[0019] 提供了包含含有V-S-W构建体的质粒、含有D-Q-E构建体的质粒、含有H-A-T构建 体的质粒、含有B-C-U构建体的质粒和含有0-R-F构建体的质粒的组合物。
[0020] 提供了在个体中诱导抗TB的免疫应答的方法。
[0021] 提供了治疗已被诊断患有TB的个体的方法。
[0022] 提供了预防个体的TB感染的方法。
【具体实施方式】
[0023] 提供了安全、有效和经济的TB疫苗，包括应用DNA疫苗技术的实施方案。所述TB 疫苗可用于可诱导抗免疫原性TB抗原的免疫应答、抗TB感染的保护作用以及为被TB感染 的个体提供有效治疗的方法。DNA疫苗技术可用于给广大的个体群体提供具有成本效益的 TB疫苗的递送，从而使得能够进行大规模的预防性TB疫苗接种。
[0024] 所述疫苗的廉价生产、贮存、运输和施用使得它们对于以具有成本效益的方式用 于接种的大群体是理想的。表1显示目前正被研究以用作疫苗的TB抗原。
[0025]
[0026] 多价疫苗方法是有吸引力的，因为广泛的免疫应答可通过同时靶向多个抗原来产 生。可明显有利的是一次靶向整个家族的基因可限制细菌逃避宿主免疫的能力。在这方面， 本文中提供了靶向来自TB的整个家族的基因的第一多价扩展疫苗。所述多价疫苗集中于 早期分泌抗原性靶6-kDa(esat-6)蛋白家族，其由23种蛋白质组成。这些蛋白是有吸引力 的靶，因为它们是重要的致病因子，潜在地在不同的生理条件下表达；因此如果所有这些成 员可被靶向，则它们可能提供针对细菌生命周期中的多个步骤的保护作用。在先前的研究 中，仅存在对该家族的仅少数成员作为疫苗免疫原的有限分析。目前没有疫苗靶向超过该 基因家族的少数基因。此处，已使用优化的DNA疫苗候选物开发了新型方法，通过肌内注射 和体内电穿孔递送，以增加抗原性库和产生针对TB的广泛免疫。已开发了在多价TB疫苗 中整合代表所有esx家族成员的全部esx家族基因的合成TBDNA疫苗。此种疫苗代表免 疫靶向的指数提高和TB疫苗开发的突破。质粒技术的多项提高促成该开发并且在下文中 进行概述。
[0027] 早期分泌抗原性靶6-kDa(esat-6)蛋白家族为有效的TB疫苗提供免疫原性靶。多 价疫苗提供广泛的革巴。在23个不同的esat-6蛋白家族成员中，一些esat-6蛋白具有充分 的同源性，以使得单一蛋白靶可诱导识别多种TBesat-6蛋白的免疫应答。通过使用DNA 疫苗，可将多种免疫原性蛋白质的编码序列包含在单一多价蛋白质中。可将多个不同的构 建体组合使用，以诱导针对esat-6家族蛋白的成员的免疫应答。
[0028] 所述esat-6家族由23种低质量蛋白质（esxA至esxW)组成，并且至少10种可 因高序列相关同源性而被进一步分入亚家族。一个亚家族是Mtb9. 9家族，其由具有在 92-98%的范围内的蛋白质同源性的5个开放阅读框架（0RF)(表2)组成。另一个亚家族 为QILSS亚家族，其由在蛋白质水平共享超过98%的个体同一性的5个相邻的0RF组成。
[0029] 在本文中公开的疫苗中，来自Mtb9. 9亚家族的2个抗原esxO和esxV被选择作为 用于诱导广泛的免疫应答的代表性抗原。不使用TB抗原esxI、esxL和esxN，但它们与esxO 和esxV的密切结构关系允许esxO和esxV成为MTb9. 9家族的抗原的靶。
[0030] 类似地，从QLISS亚家族选择esxW来代表包括其的亚家族的5个抗原抗原esxj、 esxK、esxM、esxP和esxW〇
[0031] 此外，两个其它esat-6蛋白esxS和esxG共享96%的同源性；因此，esxS将代表 两种抗原。
[0032] 选择这些抗原代表与它们具有高水平的同源性的其它抗原，应当诱导与TB的控 制相关的针对所有成员的交叉免疫应答。余下的11个esat-6基因彼此几乎不具有同源性， 并且全部已被整合为单一抗原盒。总之，使用总共15种esat-6抗原，并且这15种抗原提 供了esat-6家族的所有23个成员的革巴。
[0033]
[0034] 表3显示可用于可预防TB感染和治疗被TB感染的个体的疫苗的9种构建体。如 上文中提及的，esxO、esxV、esxW和esxS被选择用来代表它们本身和抗原呈递中的密切相 关的抗原以诱导广泛的免疫应答。
[0035]
[0036] 这14个载体的每一个的构建体在每一个的N末端具有IgE信号肽。IgE信号肽是 任选的，并且本公开内容旨在被理解为明确地公开在N末端上包含IgE信号肽的序列并且 还明确地公开不包含IgE信号肽的不具有用于接受来自另一种蛋白质的信号肽的添加的 残基或N末端甲硫氨酸或位点的序列。
[0037] 类似地，所述序列在每一个序列的C末端上包含HA标签。该结构不是必需的并且 在一些实施方案中，是想要的。本公开内容旨在被理解为明确地公开在C末端上包含HA标 签的序列并且还明确地公开不包含HA标签的序列。
[0038] 所述构建体提供费林蛋白酶切割位点。通常存在于接种的个体的细胞中的通过蛋 白酶加工的其它蛋白酶切割位点可用于替代费林蛋白酶位点。
[0039] 如实施例中所指出的，所述蛋白质序列已被修饰来改变它们的糖类的翻译后添加 的模式。在一些实施方案中，这些修饰的保留是高度期望的。
[0040] 所述构建体可通过改变给定的质粒上的抗原的顺序或重排分组来进行重排或另 外地改变。
[0041] 提供了包含在多种质粒上编码编码TB抗原esxV、esxS、esxW、esxD、esxQ、esxE、 esxH、esxA、esxT、esxB、esxC、esxU、esxO、esxR、esxF的的核酸序列的疫苗，其中针对C_ 甘 露糖基化突变和N-连接糖基化突变修饰所述蛋白质序列。所述抗原（esxA、esxE、esxF、 eSXU、eSXW)具有突变（N-X-S/T至N-X-A)的N-连接糖基化规范序列位点的氨基酸。C-甘 露糖基化规范序列位点上的氨基酸也被突变（W-X-X-W(SEQIDN0:29)至W-X-X-A(SEQID N0:30)或W-X-X-W(SEQIDN0:29)至A-X-X-W(SEQIDN0:31))。
[0042] 在一些实施方案中，提供了包含5种质粒的疫苗，每一种所述质粒具有esx-抗原 的编码序列。在一些实施方案中，疫苗是包含如下质粒的组合物：包含V-S-W构建体的质 粒、包含D-Q-E构建体的质粒、包含H-A-T构建体的质粒、包含B-C-U构建体的质粒和包含 0-R-F构建体的质粒的组合物。在一些此类实施方案中，包含V-S-W构建体的质粒可包含 3￡〇10勵：19或3￡〇10勵：1。在一些此类实施方案中，包含〇-〇4构建体的质粒可包含 SEQIDN0:21或SEQIDN0:3。在一些此类实施方案中，包含H-A-T构建体的质粒可包含 SEQIDN0:23或SEQIDN0:5。在一些此类实施方案中，包含B-C-U构建体的质粒可包含 SEQIDN0:25或SEQIDN0:7。在一些此类实施方案中，包含0-R-F构建体的质粒可包含 SEQIDN0:27或SEQIDN0:9。在一些实施方案中，疫苗是包含如下质粒的组合物：a)包 含SEQIDN0:19 或SEQIDN0:1 的质粒、b)包含SEQIDN0:21 或SEQIDN0:3 的质粒、 c)包含SEQIDNO:23 或SEQIDNO:5 的质粒、d)包含SEQIDNO:25 或SEQIDNO:7 的质 粒和e)包含SEQIDNO:27或SEQIDNO:9的质粒。在一些实施方案中，疫苗是包含如下 质粒的组合物：a)包含SEQIDN0:19的质粒、b)包含SEQIDN0:21的质粒、c)包含SEQ IDN0:23的质粒、d)包含SEQIDN0:25的质粒和e)包含SEQIDN0:27的质粒。
[0043] 1?定义
[0044] 本文中使用的术语仅为了描述特定的实施方案并且不旨在限制。如本说明书和所 附权利要求中所用的，除非上下文明确指出，否则单数形式"一个（a) "、"一种（an)"和"该 (the) "包括复数指示物。
[0045] 对于本文中数值范围的引述，明确地以相同的精度包括其间的每一个中介数。例 如，对于6-9的范围，除了 6和9外还包括数值7和8,而对于范围6. 0-7. 0,明确地包括数 值 6. 0、6. 1、6. 2、6. 3、6. 4、6. 5、6. 6、6. 7、6. 8、6. 9 和 7. 0。
[0046]a?佐剂
[0047] 如本文中所用的"佐剂"可意指添加至本文中描述的DNA质粒疫苗以增强一种或 多种由DNA质粒和下文中描述的编码核酸序列编码的TB抗原的抗原性的任何分子。
[0048]b?抗体
[0049] "抗体"可意指种类IgG、IgM、IgA、IgD或IgE或片段的抗体、其片段或其衍生物， 包括Fab、F(ab'）2、Fd和单链抗体、双抗体、双特异性抗体、双功能抗体及其衍生物。抗体可 以是从哺乳动物的血清样品分离的抗体、多克隆抗体、亲和纯化的抗体或其混合物，所述抗 体展现足够的对期望的表位或来源于其的序列的结合特异性。
[0050]c?编码序列
[0051] 如本文中所用，"编码序列"或"编码核酸"可意指包含编码蛋白质的核苷酸序列的 核酸（RNA或DNA分子）。编码序列还可包括有效地连接于能够在施用了核酸的个体或哺 乳动物的细胞中指导表达的调控元件（包括启动子和多聚腺苷酸化信号）的起始和终止信 号。
[0052] d?互补
[0053] 如本文中所用，"互补"或"互补的"可意指核酸，可意指核酸分子的核苷酸或核苷 酸类似物之间的沃森-克里克（Watson-Crick)(例如，A-T/U和C-G)或Hoogsteen碱基配 对。
[0054] e?共有或共有序列
[0055] 如本文中所用，"共有"或"共有序列"可意指基于多个亚型的特定TB抗原的比对 的分析构建的合成核酸序列或对应的多肽序列，所述序列可用于诱导针对多个亚型、或血 清型或株系的特定TB抗原的广泛免疫。共有TB抗原可包含如本文中所示的esat-6家族 的蛋白质的共有氨基酸序列。还提供了编码所述共有氨基酸序列的核苷酸序列。同样地， 合成抗原诸如融合蛋白可经操作以包含共有序列（或共有抗原）。
[0056] f?恒定电流
[0057] 如本文中所用，"恒定电流"定义由组织或限定所述组织的细胞在整个递送至相同 组织的电脉冲的持续过程中接收或经历的电流。从本文中描述的电穿孔装置递送电脉冲。 该电流在电脉冲的整个过程中在所述组织中维持恒定的安培度，因为本文中提供的电穿孔 装置具有反馈元件，优选地具有瞬时反馈。反馈元件可测量整个脉冲持续过程中组织（或 细胞）的电阻（resistance)，并使电穿孔装置改变其电能输出（例如，提高电压），这样相 同组织中的电流在整个电脉冲（大约数微秒）中以及在脉冲间维持恒定。在一些实施方案 中，反馈元件包括控制器。
[0058] g?电流反馈或反馈
[0059] 如本文中所用，"电流反馈"或"反馈"可互换使用，并且可意指提供的电穿孔装置 的主动响应，其包括测量组织中电极之间的电流和相应地改变由EP装置递送的能量输出， 以将电流维持在恒定水平。该恒定水平由用户在开始脉冲序列或电处理之前预先设定。反 馈可由电穿孔组件例如电穿孔装置的控制器来实现，因为其中的电路能够连续监测组织中 电极之间的电流并将该监测的电流（或组织内的电流）与预设电流相比较，以及连续进行 能量输出调整以将监测的电流维持在预设水平。反馈回路可以是瞬时的，因为其为模拟闭 环反馈。
[0060] h?分散电流
[0061] 如本文中所用，"分散电流"可意指从本文中描述的电穿孔装置的各种针电极阵列 递送的电流的模式，其中所述模式使待电穿孔的组织的任何区域上的电穿孔相关热应激的 发生降至最低或优选消除。
[0062] i.电穿孔
[0063] 如本文中可互换使用的，"电穿孔"、"电_透化"或"电动增强"（"EP"）可指使用 跨膜电场脉冲来诱导生物膜中的微观通路（孔）；它们的存在允许生物分子诸如质粒、寡核 苷酸、siRNA、药物、离子和水从细胞膜的一侧通过进入另一侧。
[0064] j?反馈机制
[0065] 如本文中所用，"反馈机制"可指通过软件或硬件（或固件）进行的过程，该过程接 收期望的组织的阻抗（在递送能量脉冲之前，期间和/或之后）并将其与现有值（优选地 当前）相比较，随后调整被递送的能量的脉冲以达到预设值。可通过模拟闭环电路进行反 馈机制。
[0066] k?片段
[0067] "片段"可意指能够在哺乳动物中通过识别特定TB抗原引发抗TB的免疫应答的 TB抗原或多蛋白的多肽片段。TB抗原在具有或不具有IgE信号肽的每一种情况下可以是esat-6蛋白家族的23个成员：esxA至esxW以及TB抗原Ag85A和Ag85B之一，在具有或不 具有信号肽和/或位置1上的甲硫氨酸的每一种情况下，可以是与本文中所示的共有序列 具有98%或更多同源性的蛋白质、与本文中所示的共有序列具有99%或更多同源性的蛋 白质以及与本文中所示的共有序列具有100%同一性的蛋白质。片段是指短于这些蛋白质 的全长。片段可以例如包含或可以例如不包含连接于信号肽诸如免疫球蛋白信号肽（例如 IgE信号肽或IgG信号肽）的TB免疫原的片段。
[0068] "片段"还可意指编码上文中所示的TB抗原片段的核酸片段。
[0069] 1.基因构建体
[0070] 本文中所用的"遗传构建体"是指包含编码蛋白质的核苷酸序列的DNA或RNA分 子。所述编码序列包括有效地连接于能够在施用了核酸分子的个体的细胞中指导表达的调 控元件（包括启动子和多聚腺苷酸化信号）的起始和终止信号。如本文中所用，术语"可表 达的形式"是指基因构建体，所述基因构建体含有有效地连接于编码蛋白质的编码序列的 必需调控元件，以便当存在于个体的细胞中时，所述编码序列将被表达。
[0071] m.同源性
[0072] 如本文中所用，〃同源性〃是指互补性的程度。可存在部分同源性或完全同源性 (即，同一性）。至少部分抑制完全互补的序列与靶核酸杂交的部分互补的序列称为使用功 能术语"基本上同源的"。当用于指双链核酸序列诸如cDNA或基因组克隆时，如本文使用 的，术语"基本上同源的"是指在低严格度条件下可与双链核酸序列的链杂交的探针。当用 于指单链核酸序列，如本文中所用，术语"基本上同源的"是指在低严格度条件下可与单链 核酸模板序列杂交（即，为其的互补序列）的探针。
[0073] n.相同的
[0074] 如在本文中在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中所用，"相同的"或"同一 性"可意指序列具有指定百分比的在指定区域上相同的残基。可通过如下步骤计算百分比： 将两条序列最佳地比对，在指定的区域上比较两条序列，测定在两条序列中存在相同残基 的位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以指定区域中的位置总数，及 将结果乘以1〇〇来得到序列同一性的百分比。在两条序列具有不同长度或比对产生一个或 多个交错末端以及指定的比较区域仅包括单条序列的情况下，将单条序列的残基包括在计 算的分母而非分子中。当比较DNA和RNA时，可将胸腺嘧啶（T)和尿嘧啶（U)认为是等同 的。人工或通过使用计算机序列算法诸如BLAST或BLAST2.0来获得同一性。
[0075] 〇.阻抗
[0076] 当讨论反馈机制时可使用如本文中所用的"阻抗"，并且可按照欧姆定律将其转换 成电流值，从而使得能够与预设电流比较。
[0077] p?免疫应答
[0078] 如本文中所用，"免疫应答"可意指宿主的免疫系统，例如哺乳动物的免疫系统，响 应一种或多种TB抗原（经由提供的DNA质粒疫苗）的引入的激活。免疫应答可以以细胞 应答或体液应答的形式或这两种形式存在。
[0079] q?核酸
[0080] 如本文中所用，"核酸"或"寡核苷酸"或"多核苷酸"可意指共价连接在一起的至 少两个核苷酸。单链的描述也限定了互补链的序列。因此，核酸还包括描述的单链的互补 链。核酸的许多变体可出于相同的目的作为给定的核酸使用。因此，核酸还包括基本上相 同的核酸和其补体。单链提供可在严格杂交条件下与靶序列杂交的探针。因此，核酸还包 括在严格杂交条件下杂交的探针。
[0081] 核酸可以是单链或双链的，或可含有双链和单链序列的部分。核酸可以是DNA(基 因组DNA和cDNA)、RNA或杂交体，其中核酸可含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，及 碱基（包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶和 异鸟嘌呤）的组合。核酸可以通过化学合成法或通过重组法获得。
[0082]r.有效连接的
[0083] 如本文中所用，"有效连接的"可意指基因的表达在与其空间上连接的启动子的控 制下。启动子可位于在其控制下的基因的5'（上游）或3'（下游）。启动子与基因之间的 距离可与在所述启动子来源自的基因中该启动子与其控制的基因之间的距离大致相同。如 在本领域中是已知的，在不丧失启动子功能