矢车菊素-3-葡萄糖苷对UVB诱导HaCaT细胞损伤的防护作用
【技术领域】
[0001] 本发明属于化妆品技术领域。更具体地，涉及矢车菊素-3-葡萄糖苷对UVB诱导 HaCaT细胞损伤的防护作用。
【背景技术】
[0002] 随着大气臭氧层遭到严重破坏，紫外线（ultraviolet，UV)辐射强度照射增强，且 生活水平提高，户外运动、日光浴机会的增多，导致人们接受过多的紫外线照射，导致光损 害性皮肤病逐渐增多。紫外线（ultraviolet，UV)照射到地面上的强度增大，引起人皮肤损 伤的紫外线主要是中波紫外线（ulrtavioletB，UVB)和长波紫外线（ulrtavioletA，UVA)， 而前者对皮肤的损伤程度约是后者的1000倍，可对皮肤造成如日晒伤的急性损伤和光老 化、皮肤癌等的慢性累积性伤害，对人类健康构成潜在威胁。
[0003]UVB诱导角质形成细胞光损伤的分子机制及防治研究，是当今国际上研究热点之 一。长期以来，众多的研究者在这当中做了大量的研究，其涉及的分子机制较为复杂，其中 DNA直接损伤、氧化损伤及膜表面死亡受体的活化是主要的机制。而氧化损伤机制是目前 研究较多且是较为重要的。随着人们生活水平的提高以及老龄人口的增长，皮肤老化问题 日益引起人们的重视，因此，开发具有高活性成分的防晒产品、抵抗紫外线的辐射、保护皮 肤免受光损伤、预防和延缓皮肤衰老，已成为目前医学研究的热点。
[0004] 矢车菊素-3-葡萄糖苷（〇5^111(1;[11-3-8111(3081(16，036)是最为常见的花青素 (anthocyanidin)之一，属于酸类化合物中的类黄酮类，分子式C21H21O11,它作为一种多功能 的抗氧化剂，具有抗炎、抗氧化和抗癌的生物活性。虽然以往的研究已表明了C3G具有强大 的抗炎、抗氧化性能，但目前关于C3G抗皮肤光损伤的研究，对于C3G对人类表皮细胞是否 具有减轻光损伤的效果及其安全性尚无相关研究和报道。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是克服现有UVB诱导角质细胞光损伤防护的不足，提供 矢车菊素-3-葡萄糖苷（C3G)的一种新应用，即在皮肤光损伤防护方面的应用。具体是C3G 可减少UVB引起HaCaT细胞的ROS生成，具有抗氧化作用，而且可以保护DNA免受损伤，抗 凋亡等等作用。
[0006] 本发明上述目的通过以下技术方案实现： 矢车菊素-3-葡萄糖苷在制备防晒化妆品和/或药物方面的应用。
[0007] 矢车菊素-3-葡萄糖苷在制备晒后修复化妆品和/或药物方面的应用。
[0008] 矢车菊素-3-葡萄糖苷在制备皮肤光损伤防护剂和/或光损伤后修复剂方面的应 用。具体地，所述光损伤是指UVB引起的光损伤。
[0009] 矢车菊素-3-葡萄糖苷在制备HaCaT细胞光损伤防护剂和/或光损伤后修复剂中 的应用。具体地，所述HaCaT细胞光损伤是指UVB诱导的HaCaT细胞损伤。
[0010] 另外，上述矢车菊素-3-葡萄糖苷在应用时的用量优选为80~200ymol/L。
[0011] 矢车菊素-3-葡萄糖苷在制备抗氧化的化妆品和/或药物中的应用。具体地，所 述氧化是指UVB引起的氧化损伤。更具体地，是在制备防治UVB引起的HaCaT细胞的氧化 损伤中的应用。更进一步地，具体是抑制UVB引起HaCaT细胞生成R0S。
[0012] 矢车菊素-3_匍萄糖苷在制备抗凋亡制剂方面的应用。
[0013] 本发明分别采用四甲基偶氮唑盐比色实验（MTT法)、荧光ROS探针实验等技术检 测UVB照射后细胞的存活率、ROS生成量，并通过蛋白质免疫印迹(Westernblot)技术初 步探究C0X-2及其相关蛋白的表达水平和C3G的干预机制，探讨C3G对UVB引起人体皮 肤光损伤的防护作用及安全性。同时，为了系统地了解C3G在人类表皮形成细胞中是否也 能抑制UVB诱导的C0X-2表达，探究在UVB损伤下角质形成细胞中ROS水平和p53的活化， 分析两者之间与UVB诱导凋亡的关系；并以"R0S-DNA损伤一P53--线粒体凋亡通路"为 主线，探究矢车菊素-3-葡萄糖苷（C3G)对皮肤光损伤角质形成细胞的保护机制，为C3G实 际应用于防治光损伤提供重要依据，为预防及治疗光损伤提供新方向。
[0014] 本发明具有以下有益效果： 本发明选用体外培养的HaCaT细胞为代表，用UVB照射诱发其氧化损害，模仿紫外线 对表皮细胞的光损伤模型，再以C3G作为光损伤保护剂，通过评估应用C3G减轻永生化人 角质形成细胞HaCaT细胞的UVB损伤效果及相关通路，以探讨C3G对皮肤光损伤(尤其是 UVB引起人体皮肤光损伤）的防护作用及其作用机制和安全性。研究结果显示，C3G可减 少UVB引起HaCaT细胞的ROS生成，具有抗氧化作用；而且可以保护DNA免受损伤，能够 提高UVB照射后HaCaT细胞的存活率，减少凋亡等等作用，为临床上有效的预防和治疗皮 肤光损伤，尤其是急性光损伤提供新的应用和思路，为研究天然植物抗氧化剂保护紫外线 福射损伤的作用机制奠定理论基础。
【附图说明】
[0015] 图1为不同UVB剂量照射的HaCaT细胞的细胞存活率（%)。
[0016] 图2为不同剂量UVB照射的HaCaT细胞内ROS水平。
[0017] 图3为细胞内ROS水平与细胞生存率的关系。
[0018] 图4为UVB照射对HaCaT细胞形态的影响。
[0019] 图5为不同浓度的C3G对300mJ/cm2UVB照射的HaCaT细胞形态的影响。
[0020] 图6为不同浓度C3G对UVB照射HaCaT细胞的存活率的影响。
[0021 ] 图7为C3G作用Ih对UVB照射后HaCaT细胞的细胞活性影响。
[0022] 图8为不同浓度C3G对300mJ/cm2UVB照射的HaCaT细胞内ROS的影响。
[0023] 图9为Westernblot检测不同浓度C3G对300mJ/cm2UVB照射的HaCaT细胞 C0X-2的影响。
[0024] 图10为Westernblot检测C3G及塞来昔布抑制UVB诱导EGFR的磷酸化。
[0025] 图11为Westernblot检测C3G及塞来昔布抑制UVB诱导ERK的磷酸化。
[0026] 图12为Westernblot检测C3G及塞来昔布抑制UVB诱导JNK的磷酸化。
[0027] 图13为Westernblot检测C3G及塞来昔布抑制UVB诱导p38的磷酸化。
[0028] 图14为Westernblot检测C3G及塞来昔布抑制UVB诱导Akt的磷酸化。
[0029] 图15为C3G对UVB照射后HaCaT细胞凋亡的影响。
[0030] 图16为C3G对UVB照射后HaCaT细胞凋亡的影响。
[0031] 图17为C3G对UVB照射后HaCaT细胞A$m的影响。
[0032] 图18为C3G对UVB照射后HaCaT细胞A也m的影响。
[0033] 图19为westernblot分析C3G对UVB照射后HaCaT细胞DNA损伤的影响。
[0034] 图20为westernblot分析C3G对UVB照射后HaCaT细胞p53磷酸化的影响。
[0035] 图21为westernblot分析C3G对UVB照射后HaCaT细胞凋亡相关蛋白的影响。
【具体实施方式】
[0036] 以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明 做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的方法和设备为本技术领域常规方法和设 备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0037] 所用HaCaT细胞购于武汉大学保藏中心，37°C、5% 0)2培养箱中培养。
[0038] 主要溶液的配制(所有溶液配制用水均为超纯水）： (I)C3G:取20mg的C3G粉溶于无血清的DMEM中，配制成4. 49X105yg/ml(即Immol/L)的储备液，分装储存在I. 5ml的EP管中，避光保存在-20°C冰箱。使用时提前取出，根据 实验不同浓度需要，用DMEM稀释成相应浓度。
[0039] (2)塞来昔布：塞来昔布用DMSO溶解，分别配制成281. 37yg/ml(即lmmol/L)的 储备液，过滤分装后，-20 °C保存备用。
[0040] (3)HaCaT细胞培养基(完全培养基）：DMEM培养基（高糖无血清培养基）+10%FBS (胎牛血清)，即比例为9 :1 ;培养基中加入双抗(青霉素+链霉素)，使其终浓度为100mg/L; 封口膜封口，4°C保存备用。
[0041] (4)磷酸盐缓冲液（PBS):PBS=KH2PO4 0? 20g、Na2HP04.12H20 3. 56g、NaCl8. 00g、 KCl0.20g，加超纯水至1000mL，调pH至7. 2-7. 4,高压灭菌4°C保存。
[0042] (5)细胞冻存液：60%DMEM培养基、30%胎牛血清、10%DMS0,细胞冻存前现配现 用。
[0043] (6)MTT(5mg/mL):MTT粉末 50mg，加PBS溶解至 10mL，使MTT浓度为 5mg/mL。 0. 22ym滤器过滤灭菌，分装避光4°C或-20°C保存。
[0044] (7 )荧光酶标仪检测ROS试剂DCFH-DA:用无血清培养液稀释DCFH