-DA，使终浓度 为 10ymol/L。
[0045] (8) 0. 25%胰酶：称取一定量的胰酶粉，放入已消毒的大锥形瓶中，按0. 25%浓度 加入相应的PBS，磁力搅拌待完全溶解后，调整其pH至7. 2-7. 4之间，放入4°C冰箱过夜；隔 天用0.22ym滤器滤过灭菌，并分装至15ml离心管中，作好标记保存于-20°C冰箱中。
[0046] (9)0. 04%EDTA:称取乙二胺四乙酸二钠0? 024g，加入60mlPBS溶液中；将溶液 置于70-80°C水浴振荡至完全溶解；用0. 22ixm滤器过滤灭菌，分装，4°C保存。
[0047] 另外，以下实施例的数据进行统计学处理，所有实验至少重复三次，所有数据均 以平均值土标准差（X土s)表示，运用SPSS17. 0进行统计分析，采用单因素方差分析，P <0.05为有统计学意义。
[0048] 实施例1矢车菊素-3-葡萄糖苷干预UVB损伤HaCaT细胞R0S/C0X-2通路的 研究 一、实验方法UHaCaT细胞培养 (1)细胞复苏 1) 从-80°C冰箱中取出装有HaCaT细胞的冻存管，立即投入37°C温水中，并不时摇动 使其受热均匀，尽快融化； 2) 待冻存液完全溶解时，取出冻存管，在无菌台中吸出细胞悬液，注入到9ml细胞培养 基中，轻轻吹打均勾，1000rpmX5min离心； 3) 弃去上清液，加入6ml培养基，吹打离散细胞，移入IOmm培养皿中，置于5%C02、37°C 培养箱中培养。
[0049] (2)细胞培养 1) 细胞生长于含10%FBS的DMEM培养基中，置于含5%C02、37°C培养箱中培养；2天换 液传代1次，实验时取对数生长期细胞； 2) 细胞传代：待细胞长满培养皿时，弃去培养液，PBS冲洗一次，向培养瓶中加入 0. 25%的胰蛋白酶3ml，轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍细胞表面；培养箱中放置2min，倒置 显微镜下观察，发现细胞间隙增大，立即加入含血清的培养基终止消化；将消化下的单细胞 悬液分装至新培养皿中，继续培养。
[0050] (3)细胞冻存 1) 选取处于对数生长期的HaCaT细胞，用0. 25%胰蛋白酶消化细胞，细胞悬液离心 1000 rpmX5min； 2) 弃去上清液，加入细胞冻存液，重悬混匀细胞； 3) 每只冻存管内加入上述细胞悬液1~I. 5ml，旋紧盖子，并在冻存管上写明冻存细 胞、冻存人及冻存时间； 4 )将冻存管置于-20 °C冰箱中，待冻存液凝固后，转于-80 °C冰箱中存放。
[0051] 2、UVB辐射建立HaCaT细胞的光损伤模型 当细胞融合至80%左右时，进行UVB辐射。NB-UVB灯管（飞利浦，波长31lnm，辐射强 度0.42mW/cm2)置于超净台内操作：吸去培养液后进行UVB辐射，辐射结束后立即加入适 量的含血清的培养基置于培养箱中继续培养。辐射剂量分别为100、200、300、400mJ/cm2 ; 检测时间分别为辐射后的Oh、3h、6h、12h、24h、48h。
[0052] 3、MTT实验检测细胞存活情况 (1)不同剂量UVB照射HaCaT细胞的存活影响 UHaCaT细胞培养至对数期，收集细胞；96孔板内设阴性对照组、阳性对照组和不 同剂量处理组，阴性对照组加入完全培养基，阳性对照组和处理组调整细胞悬液浓度，以 7. 5X104/ml，每孔接种200yL细胞悬液，每组均设6个实验孔；边缘孔用无菌PBS填充， 5%C02,37°C孵育； 2) 培养24h细胞长至单层后，吸走培养基，处理组分别给予4min、8min、12min、16min 的UVB照射；阳性对照组给予假照； 3) 照射后每孔加入200yL完全培养基继续培养。在照射后0h、3h、6h、12h、24h、48h 时，吸走培养基，每孔加入50ulMTT溶液（5mg/ml，即0. 5%MTT)，继续培养4h; 4) 终止培养，小心吸去孔内培养液，倒置吸干。每孔加入IOOy1二甲基亚砜，置摇床 上低速振荡l〇min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值 OD值； 5) 计算各组UVB辐射的存活率： 细胞存活率（％)=(OD处理组-OD阴性对照组）/(OD阳性对照组-OD阴性对照组）X100% (2)C3G对UVB照射的HaCaT细胞存活情况的影响 UHaCaT细胞培养至对数期，收集细胞；96孔板内设阴性对照组、阳性对照组和不 同剂量处理组，阴性对照组加入完全培养基，阳性对照组和处理组调整细胞悬液浓度，以 7. 5X104/ml，每孔接种200yL，每组均设6个实验孔；边缘孔用无菌PBS填充，5%C02， 37°C孵育； 2) 培养24h细胞长至单层后，吸走培养基，给予UVB照射12min; 3) 照射后，处理组分别给予80ymol/L、160ymol/L和200ymol/L的C3G100yL孵 育Ih;对照组给予完全培养基孵育Ih; 4) Ih后吸去孵育液体，每孔分别加入完全培养基继续培养5h、llh、23h、47h; 5) 群8照射后的6、12、24、4811，吸走培养基，每孔加入5〇11110'1'溶液（511^/1111，即 0. 5%MTT)，继续培养4h; 6) 终止培养，小心吸去孔内培养液，倒置吸干。每孔加入IOOyl二甲基亚砜，置摇床 上低速振荡l〇min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值 OD值； 7) 计算各组的细胞存活率： 细胞存活率（％)= (0D处理组-0D阴性对照组）/ (0D阳性对照组-OD阴性对照组）X100% 4、DCF荧光测定HaCaT细胞内的ROS水平 (1) 不同剂量UVB照射的HaCaT细胞内ROS水平 UDCFH-DA配制：用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为IOymol/L; 2) 对数期HaCaT细胞悬液以1.5X104/mL的密度接种到96孔板，每孔200yL细胞 悬液； 3) 培养24h后，弃去旧培养液。加入50yL稀释好的DCFH-DA，37°C细胞培养箱内孵 育30min。用无血清细胞培养液洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA; 4) 分别给予0min、4min、8min、12min、16min的UVB照射。照射后每孔加入100yL完 全培养基； 5) 培养30min后，用荧光酶标仪检测，488nm作为激发波长，568nm为发射波长； (2) C3G对UVB照射HaCaT细胞内ROS水平的影响 1) DCFH-DA配制：用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10ymol/L; 2) 对数期HaCaT细胞悬液以1.5X104/mL的密度接种到96孔板，每孔200yL细胞 悬液； 3) 培养24h后，弃去旧培养液。加入50yL稀释好的DCFH-DA，37°C细胞培养箱内孵 育30min。用无血清细胞培养液洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA; 4) 用UVB照射12min后，把细胞分为7组，分别给予完全培养基和10、20、40、80、160、 200ymol/L的C3G; 5)培养30min后，用荧光酶标仪检测，488nm作为激发波长，568nm为发射波长。
[0053] 5、Western blot检测HaCaT细胞的C0X-2及相关蛋白表达 (1)总蛋白提取 1) 将HaCaT细胞培养至对数期，以细胞悬液浓度为IXIO6个/ImL接种于IOmm培养 皿培养，每皿8mL，置于37°C，5%CO2培养箱内贴壁生长； 2) 培养24h后，弃去旧培养液；设阴性对照组、阳性对照组和不同剂量处理组，阳性 对照组和处理组给予12min的UVB照射，阴性对照组给予假照；照射后处理组分别给予 80ymol/L、160ymol/L和200ymol/L的C3G3mL孵育Ih;对照组给予完全培养基孵育； Ih后吸去孵育液体，各组均加入完全培养基继续培养Ilh; 3) 取各组细胞悬液，400Xg离心5min，去除上清； 4) 每组先加入IOyL裂解液（RIPA与PMSF以100:1混合)，涡旋裂解细胞Imin后 冰上冷却5min，每隔20min再次加入10yL裂解液，继续涡旋裂解； 5) 1h后，4°C10,000Xg离心15min，将上清液移到1.5mLEP管中；置于-80°C冰 箱保存。
[0054] (2)蛋白浓度测定 1) 根据样品数量，按照BCA法检测试剂盒配制BCA工作液（BCA试剂A:BCA试剂B 为50 :1)，充分混匀； 2) 取出7个0.2mL规格PCR管，并编号1-7,第2-7号管加入5yL的超纯水； 3) 将标准品（2mg/mL)吸出10yL加入到1号管内，取出5yL至2号管中，依次 按以上方法配制出 2、1、0. 5、0. 25、0. 125、0. 0625mg/mL; 4) 96孔板内加2yL各不同浓度的标准品及样品； 5) 各孔加入200yLBCA工作液，37 °C放置30min; 6 ) 570nm处测定OD值，根据标准曲线计算出蛋白浓度； 7)按每次上样量40yg分装蛋白样品。将蛋白溶液与5XsampleloadingBuffer按5 :1混合。
[0055] (3)SDS电泳 (4) 转膜 (5) 免疫杂交 1) 一抗稀释液稀释一抗至适当浓度（1:1000-1:2000)，4°C孵育过夜； 2) 吸去一抗孵育液，将孵育盒放置在脱色摇床上，用TBST洗膜，5minX3次； 3) 含5%脱脂奶粉稀释二抗至适当浓度（1:2500-1:5000)，室温下孵育Ih; 4) 弃去二抗孵育液，将孵育盒放置在脱色摇床上，TBST洗膜，5minX3次。
[0056] (6)显色：暗房内采用ECL化学发光液显色，显影结束后，室