exinV、PI双阳性表示晚期凋亡或坏死的 细胞(右上象限)。
[0082] (1)处理及收集细胞：取培养在培养瓶中处于对数生长期的HaCaT细胞消化，以 25万/ml的细胞密度种于六孔板，每孔2ml，置于培养箱中培养24h后处理细胞。按照分组 将四个孔给予300mj/cm2UVB照射，未照射的孔用铝箱纸遮挡。照射完成后在三个孔马上 加回配好的不同浓度的C3G(80，160，200ymol/L)，对照组加回的是完全培养基。C3G 作用Ih后，把C3G组的C3G换回完全培养基，继续孵育共12h，收集细胞进行染色并流式细 胞仪检测。
[0083] (2)染色及流式细胞仪检测：收集细胞，包括漂浮在培养基上的细胞；之后，需将 EDTA洗去，200ylPBS重悬送样。将重悬的细胞离心，1500转5min，弃上清。加入200yl BindingBuffer混匀重悬，再加入5ylAnnexinV-FITC，室温避光孵育lOmin。再以1500 转5min离心，后弃上清。加入200ylBindingBuffer混勾重悬，再加入5ylPI，直接 上机。用BDFACSDivaV4. 1. 2软件分析数据。
[0084] 2、实验结果 300mj/cm2的UVB照射HaCaT细胞后，再加入不同浓度的C3G作用，对细胞凋亡的影响 通过流式细胞仪检测结果如图15和16所示。
[0085] 由图15和16可见，与正常对照组相比，经300mj/cm2的UVB照射以后细胞的凋 亡率明显升高、活性细胞的比例明显下降（P〈 0.01)。而在加入C3G作用以后，三个浓度的 C3G均可以降低细胞凋亡，凋亡的细胞比从58. 01%分别下降到26. 14%、25. 38%、21. 40%，虽 然C3G保护后的细胞凋亡率还是高于正常对照组细胞，但已没有明显的统计学差异。而晚 期凋亡/坏死的细胞一直处于较低的水平，且没有明显变化。
[0086] 实施例3C3G对UVB照射后HaCaT细胞线粒体膜电位的影响 1、线粒体膜电位（Aitm)检测--JC-I染色流式细胞仪检测 JC-I检测线粒体膜电位变化的原理JC-I是一种阳离子脂质荧光染料，有单体和多聚 体两种存在状态，在低浓度时以单体形式存在，在高浓度时以多聚体形式存在。在正常细胞 中，由于线粒体膜电位（△ (6111)具有极性，JC-I依赖Ai])m的极性被迅速摄入线粒体内，并 因其浓度升高而在线粒体内形成多聚体，多聚体发射光为红色荧光，可被流式细胞仪的红 色（FL-2)通道检测到；当细胞发生凋亡时，线粒体膜电位被去极化，导致JC-I从线粒体内 释放，使其浓度降低，故以单体的形式存在而发出绿色荧光。根椐荧光的红绿变化就反映了 线粒体膜电位的变化。JC-I单体的绿色荧光百分比代表所测A!Im降低的细胞百分比。
[0087] 染色及流式细胞仪检测：收集细胞，包括漂浮在培养基上的细胞；之后，200iU PBS重悬送样。将重悬的细胞离心，1500转5min，弃上清。加入200ylJC-I染液混匀细 胞染色，室温避光孵育15min，上机。用BDFACSDivaV4. 1. 2软件分析数据。
[0088] 2、实验结果 线粒体膜电位（A!Dm)的破坏，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件之 一，它发生在细胞核凋亡特征(染色质浓缩、DNA断裂）出现之前，一旦线粒体膜电位崩溃，则 细胞凋亡不可逆。300mj/cm2的UVB照射HaCaT细胞后，再加入不同浓度的C3G作用，对线 粒体膜电位变化的影响通过流式细胞仪检测结果如图17和18所示。
[0089] 由图17和18可见，与正常对照组相比，经300mj/cm2的UVB照射后细胞的A边m 有所降低(表现为绿色荧光从2. 73%增加到5. 6%)(P〈 0.05)。而在加入C3G作用以后，三 个浓度的C3G均可以使Ai])m有所升高。
[0090] 实施例4C3G对UVB照射后HaCaT细胞DNA损伤的影响 1、ATM和ATR，是核心分子传感器的主要激酶，可以被DNA损伤召集、刺激活化，最终导 致细胞周期阻滞或细胞凋亡，所以ATM、ATR通常被作为是细胞发生DNA损伤的标记物质。
[0091] 本实施例通过westernblot分析检测被激活发生磷酸化的ATM、ATR的蛋白水平， 来反映细胞DNA损伤的水平，分析C3G对UVB照射后HaCaT细胞DNA损伤的影响。
[0092] 2、磷酸化ATM、ATR的蛋白表达条带如图19A所示；用QuantityOne软件进行条带 分析，结果如图19B所示。结果显示，300mj/cm2的UVB照射后引起了明显的DNA损伤，表 现在ATM、ATR磷酸化水平的上调。而在加入不同浓度的C3G作用后，均起到了保护DNA免 受损伤的作用，表现在磷酸化ATM、ATR的减少。
[0093] 实施例5C3G对UVB照射后HaCaT细胞p53及凋亡相关蛋白的影响 1、westernblot分析C3G对UVB照射后HaCaT细胞p53磷酸化的影响 P53作为细胞内一个重要的核因子，是通过被激活发生磷酸化才发挥调节作用，所以通 过检测细胞内磷酸化P53的水平来阐明细胞损伤或保护机制。
[0094] 磷酸化p53的蛋白表达条带如图20A所示；用QuantityOne软件进行条带分析， 结果如图20B所示。
[0095] 由图20可见，细胞在正常状态下磷酸化p53的水平很低，但经300mj/cm2的UVB 照射后磷酸化的P53明显增多，而在加入不同浓度的C3G作用后，均发生p53磷酸化水平的 下调。
[0096] 2、C3G对UVB照射后HaCaT细胞中凋亡相关蛋白的影响 为了确认Bcl-2家族蛋白参与了UVB诱导的细胞凋亡，用westernblot来分析Bcl-2家族蛋白中的促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的水平，以及下游效应蛋白caspase-3 的裂解情况。
[0097] 上述蛋白表达条带如图21A所示；用QuantityOne软件进行条带分析，结果如图 21B所示。结果显示，UVB照射后显著增加了促凋亡蛋白Bax的表达，而减少了抗凋亡蛋白 Bcl-2的表达，并且也增加了caspase-3的裂解。而在加入不同浓度的C3G作用后，均可以 逆转上述效应，使Bax的表达下调、Bcl-2的表达上调、caspase-3的裂解减少。
[0098] 综上所述，我们可以得出以下结论： (I)UVB照射减少了HaCaT细胞的存活率，使HaCaT细胞发生凋亡。
[0099] (2)UVB诱导细胞凋亡，是通过ROS的过度产生、诱导发生DNA损伤，激活p53表达， P53作用于线粒体膜上的Bcl-2家族蛋白、使线粒体膜电位改变，释放一系列的细胞因子， 最终导致激活caspases以及启动细胞凋亡级联反应。
[0100] (3)C3G是具有较强抗氧化活性的天然植物化学物质，能够提高UVB照射后的 HaCaT细胞的存活率，使HaCaT细胞凋亡减少。
[0101] (4)C3G抑制UVB所致的细胞凋亡，是通过清除过量的ROS、减少DNA损伤，降低p53 的活化，调控线粒体膜上Bcl-2家族蛋白的表达、恢复线粒体膜电位、减少线粒体膜的通透 性，使凋亡相关细胞因子的释放减少，从而减少caspases的裂解活化，最终抑制UVB所致凋 亡反应的发生。
【主权项】
1. 矢车菊素-3-葡萄糖苷在制备防晒化妆品和/或药物方面的应用。2. 矢车菊素-3-葡萄糖苷在制备晒后修复化妆品和/或药物方面的应用。3. 矢车菊素-3-葡萄糖苷在制备皮肤光损伤防护剂和/或光损伤后修复剂方面的应 用。4. 根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述光损伤是指UVB引起的光损伤。5. 矢车菊素-3-葡萄糖苷在制备HaCaT细胞光损伤防护剂和/或光损伤后修复剂中的 应用。6. 根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述HaCaT细胞光损伤是指UVB诱导的 HaCaT细胞损伤。7. 根据权利要求1~6任一所述应用，其特征在于，所述矢车菊素-3-葡萄糖苷的用 量为 80 ~200 y mol/L。8. 矢车菊素-3-葡萄糖苷在制备抗氧化的化妆品和/或药物中的应用。9. 根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述氧化是指UVB引起的氧化损伤。10. 矢车菊素-3-匍萄糖苷在制备抗凋亡制剂方面的应用。
【专利摘要】本发明公开了矢车菊素-3-葡萄糖苷（C3G）对UVB诱导HaCaT细胞损伤的防护作用。具体是C3G可减少UVB引起HaCaT细胞的ROS生成，具有抗氧化作用，可以保护DNA免受损伤，能够提高UVB照射后HaCaT细胞的存活率，减少凋亡等作用。本发明选用体外培养的HaCaT细胞为代表，用UVB照射诱发其氧化损害，模仿紫外线对表皮细胞的光损伤模型，再以C3G作为光损伤保护剂，通过评估C3G减轻HaCaT细胞的UVB损伤效果及相关通路，以探讨C3G对皮肤光损伤的防护作用及其作用机制和安全性，为临床上有效的预防和治疗皮肤光损伤，为研究天然植物抗氧化剂保护紫外线辐射损伤的作用机制奠定理论基础。
【IPC分类】A61P17/16, A61Q17/04, A61Q19/08, A61K8/60, A61P39/06, A61K31/7048
【公开号】CN105030560
【申请号】CN201510407491
【发明人】白卫滨, 邓列华, 胡云峰, 何咏, 马月瑭, 吴实, 孙建霞, 焦睿
【申请人】暨南大学
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年7月13日