用于促进可植入式传感器中细胞生长的设备的制造方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2012年12月28日提交的美国临时申请61/746, 691的优先权，其 授予本申请的受让人并且通过引用并入本文。
技术领域
[0003] 本发明的一些应用一般地涉及用于检测体内分析物的可植入式传感器，并且具体 涉及用于在可植入式医疗装置中向细胞提供营养物的方法和设备。
【背景技术】
[0004] 监控各种医疗状况经常需要测量血液内各种组分的水平。为避免侵入性的重复抽 血，已发展了旨在检测体内血液的各种组分的可植入式传感器。更具体地，在内分泌学的领 域中，为避免用于抽血以估计糖尿病患者体内血液中葡萄糖水平的重复的"手指刺穿"，已 讨论了可植入式葡萄糖传感器。
[0005] -种用于感测分析物（诸如葡萄糖）的浓度的方法依靠荧光共振能量转移 (FRET)。FRET涉及当供体和受体分子彼此紧密接近时，非光子能量从受激励荧光团（供体） 到另一荧光团（受体）的转移。FRET使得能够确定分子的相对接近以便调查例如分析物 (诸如葡萄糖）的浓度。
[0006] Gross等人的通过引用并入本文的PCT专利申请公布W0 2006/006166描述了一种 蛋白质，其包括葡萄糖结合部位、青色荧光蛋白质（CFP)和黄色荧光蛋白质（YFP)。该蛋白 质配置成使得葡萄糖到葡萄糖结合部位的结合引起CFP和YFP之间距离减小。描述了用于 检测受试者内物质浓度的设备，该设备包括适于植入受试者内的壳体。该壳体包括荧光共 振能量转移（FRET)测量装置，以及被基因工程化以在原位置产生具有FRET复合物的FRET 蛋白质的细胞，该FRET复合物包括荧光蛋白质供体、荧光蛋白质受体和用于物质的结合部 位。
【发明内容】
[0007] 设计基于细胞的可植入式装置的挑战中的一个是在长期（例如在一年或更长时 间）维持相当数量的细胞群体。根据本发明的一些应用，提供用于随时间推移维持期望的 细胞群体大小的技术，包括以下两点：
[0008] ?抑制细胞群体生长，即细胞增殖，以便避免群体过剩，该群体过剩导致远离装置 边缘的细胞中缺乏营养物，这将产生最终使整个细胞群体中毒的细胞坏死中心；以及
[0009] ?允许受限的细胞增殖以替代随时间推移而死亡的细胞，以便防止装置中细胞群 体衰落，该衰落将最终使装置功能障碍。
[0010] 为平衡上述冲突目标并在长时期（例如至少一年）保持大体恒定的细胞群体，提 供了三层细胞封装结构，其包括具有细胞附接到的表面的大体上不可降解的三维支架，以 及应用到细胞的水凝胶。
[0011] 支架、细胞和水凝胶布置成使得细胞夹在水凝胶和支架的表面之间的空间中。细 胞在单层中布置在支架的表面的总计表面面积的至少50%上。该布置允许细胞在水凝胶和 支架的表面之间的空间中的移动和增殖，并防止细胞移动和增殖到水凝胶和支架的表面之 间的空间外的位置。水凝胶和支架的表面之间的空间内的死亡的细胞在分解时留下空间。 在一侧上由支架的表面提供的结构和在另一侧上的水凝胶维持该空间的开放，直到一个或 多个邻近细胞增殖到该空间中。
[0012] 因此，在任何局部微观环境中，封装结构包括（a)固体支架的表面、（b)细胞和（c) 水凝胶的按此顺序的三层叠堆。在任何位置处的细胞因此一般限于单层，允许细胞在支架 和水凝胶之间的狭窄空间内的自由移动和增殖，但防止到容积其余部分中的任何增殖和三 维细胞结构的产生。
[0013] 支架提供具有高的总计表面面积和高的表面积与容积比率的三维结构，这使得有 效利用室的三维容积。支架的表面尽管经常不平坦但有效地用作用于细胞播种、生长和附 接的二维基底。如果水凝胶不提供在单层细胞之上，则细胞通常以三维远离其附接到的表 面而生长。此类三维生长一般将导致不期望的群体过剩，如以上描述的。另外，对于许多细 胞类型，细胞生存力和包括传感蛋白质表达的蛋白质表达在细胞附接和散布时显著增强。 因此，在该配置中的细胞将比悬浮的细胞（例如悬浮在水凝胶支架中的细胞）存活更长时 间并更好地起作用。
[0014] 对于一些应用，支架包括微载体珠、纤维、刚性结构，或具有多个互连内部孔隙的 海绵结构。
[0015] 封装结构可组合至少三个益处：（a)良好的细胞附接，引起更优的细胞生存力和 表达，其在较简单的系统（例如将水凝胶用作支架的系统）中是缺少的，（b)因为有限数目 的细胞和经由水凝胶的到细胞的开放扩散通道，所以防止经常导致坏死中心的群体过剩， 以及（c)使得细胞能够在二维培养物内移动和增殖，由此使得能够实现长期稳态群体。
[0016] 本发明的一些应用提供多层免疫隔离系统。在基于细胞的装置内细胞的生存力强 烈地取决于氧的充足供应。通常，在装置植入后的异物反应产生封装该装置的密集纤维化 组织，充分减少氧从血液循环到该装置的扩散。因此，通过尽可能接近植入装置的组织的充 分血管化（这提高了在装置表面处的氧水平），增强了基于细胞的装置内的细胞生存力。更 具体地，对于葡萄糖测量装置，密集纤维化组织的产生是葡萄糖的潜在扩散屏障，导致在组 织中的葡萄糖水平和由装置测量的葡萄糖水平之间的时间延迟。因此，应避免此类密集纤 维化组织以便维持葡萄糖测量的准确性。
[0017] 多层免疫隔离系统配置成增强植入的基于细胞的装置的长期功能。多层免疫隔离 系统至少包括以下三层：（a)布置在装置的外表面处的下（内）隔膜层，（b)上（外）新血 管化层，以及（c)布置在下隔膜层和上新血管化层之间的中间保护层。多层免疫隔离系统 包括生物可降解支架。在生物降解前，生物可降解支架跨越上新血管化层和中间保护层，使 得上新血管化层包括生物可降解支架的第一上部部分，并且中间保护层包括生物可降解支 架的第二下部部分。另外，中间保护层还包括生物不可降解的水凝胶，其浸渍生物可降解支 架的第二下部部分。包括生物可降解支架的第一上部部分的上新血管化层不被水凝胶浸 渍。
[0018] 生物可降解支架用于至少两个功能：(a)在装置植入期间，生物可降解支架保护 中间保护层的软水凝胶免于强剪力，该强剪力否则可扯下该软水凝胶；以及（b)在装置植 入后，生物可降解支架促进生长到上新血管化层中的组织的血管化，直到生物可降解支架 最终降解并且完全被吸收。
[0019] 在生物可降解支架生物降解时，中间保护层（现在主要包括水凝胶）保持附接到 下隔膜层。中间保护层通常用来（a)防止蛋白质附接到下隔膜层，由此将纤维化组织的产 生最小化，和/或（b)排斥大的蛋白质，由此将下隔膜层的堵塞最小化。中间保护层的水凝 胶的高含水量防止附接各种蛋白质，因此免疫系统细胞较不可能附接到组织-水凝胶分界 面，由此将总体免疫反应最小化。由于该三层保护，围绕装置的组织由高的血管化和最小纤 维化来表征。
[0020] 本发明的一些应用提供包括至少以下三层的另一种多层免疫隔离系统：(a)布置 在装置的外表面处的下（内）隔膜层，（b)上（外）保护层，以及（c)中间附接层，其布置 在下隔膜层和上保护层之间，并且将上保护层紧密固定到下隔膜层。中间附接层包括生物 不可降解支架，其诸如通过使用静电纺丝直接安置于隔膜上来紧密固定到下隔膜层。
[0021] 多层免疫隔离系统包括跨越上保护层和中间附接层的生物不可降解的水凝胶。 即，中间附接层包括水凝胶的第一部分，并且上保护层包括水凝胶的第二部分。水凝胶浸渍 在中间附接层的支架中，并在支架上方（即在远离下隔膜的方向上）延伸，以便提供上保护 层。上保护层不包括支架。结果，支架不暴露于组织，由此降低多层免疫隔离系统产生免疫 反应的可能性。
[0022] 中间附接层将上保护层的水凝胶保持在下隔膜层上的适当位置。上保护层具有平 滑上（外）表面，这引起下隔膜层的低生物堵塞，允许隔膜将营养物有效扩散到装置中，即 使在长期植入后。另外，上保护层通过将高度生物相容的表面呈现给组织来保护装置。
[0023] 在本发明的一些应用中，完全可植入式或部分可植入式传感装置包括用于促进细 胞生长的设备。对于一些应用，该设备包括室和至少部分地围绕室并且是营养物可渗透的 隔膜。（"营养物"在本说明书的情境下并在权利要求书中包括氧、葡萄糖和对于细胞生存 重要的其他分子）。通常，包括水凝胶或其他合适材料的支架布置在室内，并且多个细胞布 置在其中。另外，至少一个营养物供应舱通常布置在室内，并且散布有支架，使得细胞生长 介质内细胞的至少80%布置在营养物供应舱的100ym(微米）内。以此方式，营养物供应 舱定位在室内，使得通过营养物供应舱在隔膜与细胞的至少80%之间提供用于营养物的扩 散路径。
[0024] 在本申请的情境下并在权利要求书中，描述为"围绕"元件的隔膜应理解为至少部 分地围绕该元件。因此，例如，围绕室的隔膜可完全围绕室，或可部分地围绕室（而室的另 一部分可用除隔膜外的某物覆盖）。
[0025] 在本发明的一些应用中，设备包括具有布置（例如，封装）在其中的隔离细胞的 室，以及至少部分地围绕该室的隔膜结构。在其第一状态下的隔膜结构具有第一截留分子 量（MWC0)，并且转换到其第二状态，在第二状态中该隔膜结构具有第二MWC0,第二MWC0高 于第一MWC0。设备的目标中的一个是通过提高隔膜可渗透性维持营养物恒定流入室中，因 此减小由隔膜堵塞引起的对营养物流动的不利影响（其否则可限制营养物流到细胞）。隔 膜结构在许多月或甚至设备植入受试者内的全部时间内通常是白血细胞不可渗透的。大分 子诸如转铁蛋白或甚至免疫球蛋白G的可渗透性随时间推移而提高。
[0026] 注意即使该应用在上文和下文中描述为具有高于第一MWC0的第二MWC0,但本发 明的范围包括其中第一MWC0与第二MWC0相同或甚至大于第二MWC0的应用。此应用情况 的益处是增强的总隔膜厚度，这减小免疫系统组成中的一些（尤其是活性氧类（R0S))的影 响。另外，如由本发明的一些应用所提供的软生物可降解隔膜与刚性表面相比可补充较弱 的免疫反应。
[0027] 在本发明的一些应用中，隔膜结构包括（a)包括生物可降解材料的第一层，以及 (b)生物不可降解的第二层。在一些应用中，隔膜结构包括用生物可降解材料浸渍的生物 不可降解材料。随时间推移，生物可降解材料生物降解，由此在生物不可降解材料中留下空 间，由此提高隔膜结构的可渗透性。结果，隔膜结构初始具有有效阻塞细胞因子的低MWC0， 而在生物可降解材料降解后，留下具有较大MWC0的生物不可降解材料。因此，即使隔膜已 堵塞，由于由生物可降解材料降解而引起的隔膜的较高可渗透性，因此营养物仍可经过隔 膜。
[0028] 在本发明的一些应用中，设备包括光学透明的支架；耦合到支架的光波导；支架 上的多个细胞；以及围绕支架的隔膜结构。支架的透明性使得光能够经过光波导传到支架， 并经过支架传到从细胞分泌的或在细胞内产生的传感蛋白质被布置的位置。相似地，由传 感蛋白质响应于激励光而发射的荧光经过透明支架传输到光波导。
[0029] 在本发明的一些应用中，用于检测受试者内分析物浓度的设备包括具有近末端和 远末端的光波导。感测单元布置在光波导的远末端处并检测分析物（例如，通过分析物到 蛋白质的结合）。感测单元包括第一室。第二室围绕第一室的至少远末端部分布置。被基因 工程化以在受试者体内产生具有用于分析物的结合部位的传感蛋白质的活细胞布置（例 如，封装）在第一室或第二室中任一个之内。
[0030] 在本发明的一些应用中，用于检测受试者内分析物浓度的设备包括具有第一远末 端和第二近末端的光波导。用于检测分析物的感测单元布置在光波导的第一末端处。感测 单元包括至少无细胞的内部轴向部分，其邻近光波导的第一末端布置。第二室邻近内部轴 向部分，并与光波导和内部轴向部分共轴。被基因工程化以在受试者体内产生具有用于分 析物的结合部位的传感蛋白质的活细胞布置在第二室中，并分泌传感蛋白质。在该配置中， 提供相对大的表面面积以便允许分析物和营养物在受试者身体和第二室之间转移。
[0031] 在本发明的一些应用中，用于检测受试者内分析物浓度的设备包括光波导；围绕 光波导的远端部分的室，光波导的远端部分沿室长度的至少75%延伸；以及被基因工程化 以在受试者体内产生具有用于分析物的结合部位的传感蛋白质的活细胞。活细胞布置（例 如，封装）在室内。
[0032] 在本发明的一些应用中，用于检测受试者内分析物浓度的设备包括传输激励光的 光波导，以及包括（即，容纳）活细胞的室，该活细胞被基因工程化以在受试者体内产生具 有用于分析物的结合部位的荧光传感蛋白质。荧光传感蛋白质配置成响应于激励光而发射 荧光。室相对于光波导共轴地布置。透镜布置在光波导和室之间，该透镜配置成将源自光 波导的光聚焦到室，并将源自室的光聚焦到光波导。第一反射镜耦合到室并布置在室的近 末端和透镜之间。第一反射镜反射室内的激励光并将荧光从室内朝向透镜和光波导传输。 第一反射镜被成形以界定允许激励光从透镜转到室中的针孔。第二反射镜耦合到室并布置 在室的远末端处。
[0033] 本发明的应用还包括用于促进从受试者的皮下位置测量受试者体内的分析物浓 度的方法。这通过以下来实现：测量皮下位置的温度连同促进测量分析物浓度；以及响应 于所测量的温度校准分析物浓度的测量。
[0034] 因此，根据本发明的应用提供用于检测受试者内的分析物浓度的设备，该设备配 置成植入受试者体内并包括：
[0035]具有近末端和远末端的光波导；
[0036] 布置在光波导的远末端并配置成检测分析物的感测单元，该感测单元包括：
[0037]至少第一室；
[0038]至少在第一室的近末端部分处围绕第一室布置的至少第二室；
[0039] 以及
[0040] 被基因工程化以在受试者体内产生具有用于分析物的结合部位的传感蛋白质的 活细胞，该活细胞布置在选自由第一室和第二室组成的组的至少一个室内。
[0041] 对于一些应用，分析物是葡萄糖。
[0042] 对于一些应用，第二室完全围绕第一室。
[0043] 对于一些应用，光波导包括光纤。对于一些应用，光波导包括平面光波导。
[0044] 对于一些应用，活细胞布置在第一室内。对于一些应用，第二室的第一远端纵向段 至少在第一室的近末端部分处围绕第一室布置，并且第二室的第二近端纵向段不围绕第一 室。对于一些应用，第二室容积的至少60%沿第二近端纵向段布置。对于一些应用，第二室 的第一纵向段完全围绕第一室。对于一些应用，光波导的直径等于第二室的直径。
[0045] 对于一些应用，光波导的直径等于第一室的直径。
[0046] 对于一些应用，设备还包括在第一室和第二室之间的第一半渗透隔膜，活细胞被 基因工程化以分泌传感蛋白质，并且半渗透隔膜配置成促进传感蛋白质从第一室转到第二 室，并限制活细胞经过其。对于一些应用，第二室完全围绕第一室。对于一些应用，光波导 的直径等于第二室的外径。对于一些应用，设备进一步包括围绕第二室的第二半渗透隔膜， 该第二半渗透隔膜经配置促进营养物转到第二室中并限制细胞经过其。
[0047] 对于一些应用，第一室具有近端部分和远端部分，并且近端部分具有比远端部分 的远端部分直径更小的近端部分直径。对于一些应用，光波导的直径等于远端部分直径。
[0048] 对于一些应用，第二室围绕第一室的近端部分，并且第二室促进营养物从受试者 的体液转到第一室中的活细胞。对于一些应用，设备还包括在第一室和第二室之间的半渗 透隔膜，活细胞被基因工程化以分泌传感蛋白质，并且半渗透隔膜配置成促进传感蛋白质 从第一室转到第二室。对于一些应用，设备还包括围绕选自由第一室和第二室组成的组中 的至少一个室的半渗透隔膜，第二半渗透隔膜配置成促进营养物转到所选择室中并限制细 胞经过其。对于一些应用，半渗透隔膜配置成限制细胞转到第二室中。对于一些应用，半渗 透隔膜配置成限制细胞转到第一室中。
[0049] 对于一些应用，活细胞布置在第二室内。对于一些应用，第二室的第一近端纵向段 完全围绕第一室，并且第二室的第二远端纵向段不围绕第一室。对于一些应用，第二室容积 的至少60%沿第二远端纵向段布置。对于一些应用，光波导的直径等于第一室的直径。
[0050] 对于一些应用，设备还包括在第一室和第二室之间的第一半渗透隔膜，活细胞被 基因工程化以分泌传感蛋白质，并且半渗透隔膜配置成促进传感蛋白质从第一室转到第二 室。对于一些应用，光波导具有等于第一室的直径的直径。
[0051 ] 对于一些应用，光波导具有等于第二室的直径的直径。
[0052] 对于一些应用，第一室包括配置成经过第一室透射光的光学透明材料。对于一些 应用，设备还包括布置在第一室的远末端处并且配置成反射经过第一室透射的光的反射 镜。
[0053] 对于一些应用，第一室包括配置成经过第一室透射光的光学透明材料。对于一些 应用，设备还包括布置在第一室的远末端处并且经配置反射经过第一室透射的光的反射 镜。
[0054] 根据本发明的应用还提供了用于植入人类受试者内的容纳细胞的设备，该设备包 括：
[0055] 具有细胞附接到的表面的大体上不可降解的三维支架；以及
[0056] 附接到细胞的水凝胶。
[0057] 其中支架、细胞和水凝胶布置成使得细胞夹在水凝胶和支架的表面之间的空间 中，以及
[0058] 其中细胞在单层中布置在支架的表面的总计表面面积的至少50%上，由此允许细 胞在水凝胶和支架的表面之间的空间中的移动和增殖，并防止细胞移动和增殖到水凝胶和 支架的表面之间的空间之外的位置。
[0059] 对于一些应用，细胞在单层中布置在支架的表面的总计表面面积的至少70%上， 诸如在支架的表面的总计表面面积的至少90%上。
[0060] 对于一些应用，设备还包括室，支架、细胞和水凝胶容纳在该室中。对于一些应用