细胞活性抑制率=(对照组吸光度值-实验组吸光度值）八对照组吸光度值/空白组吸光 度值）X 100%。
[0027] 4、划痕细胞迀移实验
[0028] (1)准备无菌6孔细胞培养板，marker笔在6孔板背面每隔Icm划一道标线；（2) 取对数生长期细胞，PBS液洗漆2次，0. 25%胰蛋白酶消化、吹散，将细胞悬液离心，更换完 全培养基重悬。接种于标记好的6孔培养板中培养，每孔加5X IO5细胞；（3)37°(：、50)2培 养，待倒置相差显微镜下观察各孔细胞密度约达到90 %时吸取完全培养基，换用无血清培 养基培养24小时，以消除由于血清引起的增殖对迀移作用的干扰；(6)无血清培养到指定 时间后用高压消毒的200 y L枪头垂直6孔板上的标记线划痕。划痕与孔板上mark笔上的 横线交叉点即为观察的固定点。（7)PBS清洗2次洗去划下的细胞。更换新鲜的无血清培 养基，按照实验条件在各组培养基中加入相应浓度的药物，同时设立对照组，置37°C、5C02 孵箱中培养；(6)每个孔取8个固定点观察划痕后12h、18h的细胞迀移情况并照相，使用 ImageJ图像分析软件测定每张图片划痕区的面积；(8)迀移率=(观察时间固定点划痕面 积-起始时间固定点划痕面积）/起始时间固定点划痕面积X 100%。迀移抑制率=(实验 组迀移率-对照组迀移率）/实验组迀移率X 100 %。
[0029] 5、Transwell细胞侵袭实验
[0030] (1)取培养在完全培养基中的对数生长期786-0和0S-RC-2肾癌细胞株，PBS洗 漆2次，换用无血清的RPMI-1640培养基培养12小时，以减少细胞增殖对侵袭实验的影 响；（2)准备Transwell小室。小室可搭置于24孔细胞培养板上，底面为直径6. 5mm、孔 径5 ym的膜。取40 y L以1:5稀释的lmg/mL基质胶铺在上室，并放入4°C过夜风干，该 操作需在冰上完成，因基质胶在室温下易迅速凝固；（3)786-0和0S-RC-2肾癌细胞株经 无血清RPMI-1640培养基培养到12小时后，胰酶-EDTA消化、离心后吸去上清，加入无血 清的RPMI-1640培养基重悬，细胞计数调整细胞浓度至IX IO6AiL; (4)将准备好的带有 Transwell小室的24孔板取出，下室（即24孔板的孔）中加入500 y L含有10%胎牛血清的 完全培养基，以提供对细胞的趋化作用。将上室搭在孔上，此时可见上室底面的膜刚好浸在 了下室中的培养基里。观察下室的培养基与上室底面的膜之间没有气泡即可；（5)取50 y L 细胞悬液加在各个孔的上室，再加入含有不同浓度药物的无血清RPMI-1640培养基50 y L， 使各个孔上室药物的浓度达到实验设计浓度。观察各孔中没有气泡；(6)将细胞放入37°C、 5C02的恒温培养箱中培养12小时，取出上室。用棉棒轻柔擦拭小室膜的上面，将没有穿过 膜的细胞擦掉；（7)将小室用PBS轻柔冲洗，洗去表面的培养基；（8)将小室放入95%乙醇 中固定10分；(9)用PBS轻柔冲洗小室表面的固定液，再将小室放入苏木素中染色5分钟； (10)小室放入1 %盐酸酒精中分化，自来水冲洗返蓝5分钟；（11)将小室放入伊红中染色5 分钟，然后自来水冲洗；（12)小室依次放入75%乙醇1分钟、85%乙醇1中分钟、95%乙醇 1中分钟、100%乙醇4分钟；（13)将小室风干，用刀片小心沿边缘切下小室底面的膜。膜底 面朝上放在盖玻片上，中性树胶封片；（14)在正置显微镜下观察，每张片在200 X下取8个 随机视野，数出每个视野中穿过的细胞数，进行统计分析，进行统计学分析。
[0031] 6、统计分析
[0032] 应用SPSS20. 0(IBMInc，USA)软件处理数据，所有数据用i±s表示。多组间差异比 车父米用单因素方差分析，两两间比$父米用Dunnett-t检验，两组间比$父差异米用student-t 检验。检验水准a = 0.05。
[0033] 三、结果及结论
[0034] 1、SculponinR对肾癌细胞株786-0和0S-RC-2增殖能力的影响
[0035] 生长曲线显示加入不同浓度的Sculponin R后，两种肾癌细胞株的增殖都受到了 明显的抑制。0.1mg/mL Sculponin R作用于786-0细胞24小时即出现显著的抑制生长 作用（P〈〇. 035)。随着培养时间的延长，O.lmg/mL Sculponin R 及 0.25mg/mL Sculponin R对细胞增殖保持明显的抑制作用，而〇. 5mg/mL Sculponin R使786-0细胞的增殖停滞。 Sculponin R对0S-RC-2细胞的增殖同样有抑制作用，在培养第3天0. lmg/mL、0. 25mg/mL、 0. 5mg/mL表现出对0S-RC-2细胞的显著抑制（P分别为0. 026、0. 004、0. 002)。绘制的生长 曲线显示Sculponin R对786-0细胞株的增殖抑制作用较对0S-RC-2细胞的增殖抑制作用 更为明显。生长曲线周期中每天的细胞增殖情况见表1(注：*在相应作用时间与对照组相比有统计学差异（P〈〇. 05))。
[0036] WST-8细胞活力实验结果显示，Sculponin R对肾癌细胞株786-0细胞及0S-RC-2 细胞活力均有明显的抑制作用，Sculponin R 0? lmg/mL即在24小时对786-0及0S-RC-2细 胞的活力有显著的抑制作用，且与对照组比较差异有统计学意义。药物在24小时对两种细 胞的半数抑制浓度（ICJ分别为3. 5mg/mL和16. 45mg/mL，在48小时分别为为0. 165mg/mL 和I. 762mg/mL。对两种细胞的活性抑制作用见表2(注：*在相应作用时间与对照组相比有 统计学差异（P〈〇.〇5))。
[0037] 2、SculponinR抑制肾癌细胞株迀移和侵袭能力
[0038] 细胞划痕迀移实验结果显示，Sculponin R对肾癌细胞株786-0和0S-RC-2的迀 移能力有抑制作用，Sculponin R 0.25mg/mL组在6h、12h、18h对786-0迀移的抑制率为 10. 95%、21. 96%和43. 02%，12h和18h的差异有统计学意义（P值分别为0. 004和0. 000); 对0S-RC-2的抑制率为3. 81%、19. 67%、28. 44%，12h和18h的差异有统计学意义（P值 分别为 〇? 009 和 0? 000)。Sculponin R 0? 5mg/mL 组在 6h、12h、18h 对 786-0 的抑制率为 76. 82%、81. 18%、和82. 62%，差异均有统计学意义（P值分别为0. 001、0. 000和0. 000); 对0S-RC-2细胞的抑制率为22. 01 %、52. 95 %、和61. 50 %，12小时和18小时的差异均有统 计学意义（P值分别为〇. 〇〇〇和〇. 〇〇〇)。各组在对应时间的迀移率如表3。
[0039] Transwell细胞侵袭实验结果显示，经过12小时后，786-0细胞株加药组（0? 25mg/ mL Sculponin R)和对照组每个200 X视野穿过的细胞数分别为262. 38 ± 22. 13和 74. 75±10. 50,差异有统计学意义（P = 0. 000) ;0S-RC-2细胞株则分别为102. 75±8. 75、 65. 13±9. 66,且差异有统计学意义（P = 0. 000)。
[0040] 结论，本研究结果表明一定浓度的SculponinR对肾癌细胞的增殖、迀移、侵袭、死 亡都有显著地影响，且在这些实验中对786-0细胞系的作用明显比对0S-RC-2细胞系更为 明显。
[0041] 表明这种药物也有可能通过这一机制对控制肾癌的进展和转移发挥一定的作用。
[0042] 表ISculponinR对肾癌细胞株786-0和0S-RC-2增殖能力的影响
[0043]
[0044] 表2Sculponin R对肾癌细胞株786-0和0S-RC-2抑制率的影响
[0047] 表3Sculponin R对肾癌细胞株迀移和侵袭能力的影响
【主权项】
1. SculponinR在制备治疗肾癌药物中的应用，所述SculponinR化学结构式如下，2. 根据权利要求1所述的SculponinR在制备治疗肾癌药物中的应用，其特征在于： 所述肾癌为肾癌786-0和0S-RC-2。
【专利摘要】本发明公开了Sculponin？R在制备治疗肾癌药物中的应用，属于药物领域。研究发现Sculponin？R对肾癌细胞株786-0细胞及OS-RC-2细胞活力、迁移和侵袭能力均有明显的抑制作用，可以进一步研究开发成治疗肾癌的药物。
【IPC分类】A61P13/12, A61P35/00, A61K31/366
【公开号】CN105193786
【申请号】CN201510648404
【发明人】吴正锋
【申请人】吴正锋
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年10月9日