Sculponin R在制备治疗肾癌药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及化合物Sculponin R的新用途，具体涉及Sculponin R在制备治疗肾 癌药物中的应用。
【背景技术】
[0002] Hua-Yi Jiang等人首次分离纯化出化合物Sculponin R，并将成果发表在著名 天然产物杂志 Journal ofNatural Product 上（Enmein-type 6, 7-sec〇-ent_Kauranoids from Isodon sculponeatus，J. Nat. Prod.，2013, 76, 2113-2119) 〇
[0003] 目前尚未有该化合物关于治疗肾癌的活性报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种Sculponin R的医药用途。
[0005] 上述目的是通过如下技术方案实现的：
[0006] Sculponin R在制备治疗肾癌药物中的应用，所述Sculponin R化学结构式如下，
[0008] 进一步地，所述肾癌为肾癌786-0和0S-RC -2。
【具体实施方式】
[0009] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容。
[0010] 实施例1 :Sculponin R的分离制备及结构确证
[0011] Sculponin R的制备方法同文献报道的制备方法（Enmein-type 6, 7-sec〇-ent_Kauranoids from Isodon sculponeatus，J.Nat.Prod.，2013,76， 2113-2119)。
[0012] 结构确证：白色无定形粉末，分子式为CmH26O7，不饱和度为8。核磁共振氢谱 数据 S H (ppm，DMS0-d6,400MHz) :H-1 (5. 32, t，J = 8. 4)，H-2 (2. 44, m)，H-2 (2. 12, m)， H-3 (3. 79, d，J = 4. 4)，H-5 (3. 99, d，J = 3. 3)，H-6 (5. 88, d，J = 3. 3)，H-9 (2. 22, d，J = 10.6)，H-Il (4.43, m)，H-12 (2. 62, overlap)，H-12 (1.65, m)，H-13 (2.49, m)，H-14 (2. 84， m)，H-14(2. 61，overlap)，H-17(l. 50, s)，H-18(l. 26, s)，H-19(l. 04, s)，H-20(4. 73, d，J =9. 2)，H-20(4. 19, d，J = 9. 2);核磁共振碳谱数据 S c(ppm，DMS0-d6,100Hz) :71. 5(CH， 1-C)，34. 7 (CH2, 2-C)，81. 6 (CH，3-C)，42. I (C，4-C)，52. 8 (CH，5-C)，109. I (CH，6-C)， 171. 2(C，7-C)，56. 3(C，8-C)，54. 0(CH，9-C)，51. 3(C，10-C)，64. I (CH，11-C)，33. 9(CH2， 12-C)，41. 4 (CH，13-C)，31. I (CH2,14-C)，211. 8 (C，15-C)，78. 0 (C，16-C)，19. I (CH3,17-C)， 20. 9 (CH3,18-C)，28. 2 (CH3,19-C)，76. 2 (CH2, 20-C)。结构确证数据与文献报道一致，因此可 以确定本发明制备的化合物即为文献报道的Sculponin R。
[0013] 实施例2 :Sculponin R的药理作用试验
[0014] -、材料和仪器
[0015] 786-0肾癌细胞株、0S-RC-2肾癌细胞株均购自中科院细胞库。Sculponin R自 制，HPLC归一化纯度大于98%。RPMI-1640培养基、lOOU/mL青霉素及100 y g/mL链霉素、 IXPBS缓冲液、胰酶-EDTA购于美国HyClone。胎牛血清购于美国Gibco。细胞增殖与毒性 检测试剂盒（中国）。基质胶购于美国BDBioscience。
[0016] HERAcell240i恒温孵箱、GmbHD-37520低温离心机、1510酶标仪为芬兰Thermo公 司产品。頂T-2倒置相差显微镜为日本Olympus公司产品。DFC480正置显微镜为德国徕卡 公司产品。MDF-U53V-80°C超低温冰箱为日本SANYO公司产品。YDS-50B-80液氮储存罐购 自中国成都液氮容器厂。BC-185GE 4°C冰箱为中国益友公司产品。Minispinplus小离心机 为Eppendorf公司产品。powerpac300电泳仪为美国Biorad公司产品。Las4000mini凝胶 成像仪为日本FUJIFILM公司。
[0017] 二、试验方法
[0018] 1、细胞培养
[0019] (1)常规培养及细胞传代：786-0及0S-RC-2肾癌细胞株均培养在改良型 RPMI-1640培养基中，常规培养时加入了 10%胎牛血清及1%青霉素和链霉素，构成完全培 养基。培养条件为37°C、5% CO2的恒温培养箱。正常情况下786-0及0S-RC-2细胞均为贴 壁生长。每天在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况，一般隔天换液一次。换液时先吸去 培养瓶或培养皿中培养基，加PBS洗漆2次后再加入完全培养基。细胞密度达到80-90 %且 细胞形态仍保持良好时进行传代，传代周期一般为3天。细胞传代步骤如下：1)先弃去培养 瓶内培养基，PBS洗2次；2)培养瓶内加ImL胰蛋白酶-EDTA，37°C孵育约3分钟，倒置显微 镜下观察细胞变圆并脱落后，加入3mL完全培养基终止消化，并用吸管将成团的细胞吹散； 3)细胞悬液移至15mL离心管中，1000转/分离心5分钟，弃去上清，加入完全培养基吹散 细胞沉淀，分装到3个培养瓶中，置于37°C、5% CO2中继续培养。
[0020] (2)细胞冻存：细胞处于对数生长期，状态良好并且细胞密度达到80~90 %冻存 细胞，步骤如下：1)配制细胞冻存液：将改良型RPMI-1640培养基、胎牛血清、DMSO按7:2:1 比例混合、震荡混匀；2)消化、离心细胞（具体见细胞传代步骤）；3)离心后吸去上清液，加 入冻存液并吹匀，调整细胞计数约I X 107mL，移至I. 2mL冻存管中。在冻存管标记冻存日期 及细胞株信息，用封口膜封口。置于4°C冰箱30分钟，移至-20 °C冰箱2小时，再移至-80 °C 冰箱过夜，次日转入液氮中保存。
[0021] (3)细胞复苏：1)水浴锅预热到37°C准备；2)从-80°C冰箱或液氮中取出细胞，迅 速放入37°C的水浴锅中并摇动，使其内液体在1-2分钟内融化；3)将融化后的细胞悬液移 置15mL离心管中，1000转/分钟离心5分钟，离心后弃去上清并加入完全培养基。4)将细 胞置于37°C、5% CO2培养箱中培养，次日观察细胞状态并换液。
[0022] (4)细胞计数：1)细胞消化，吹散制备细胞悬液，方法同细胞传代。用加样器吸取 20 y L悬液沿盖玻片边缘烧靠外侧滴加，使悬液由于气压影响均匀吸入计数察，健康活细胞 呈规则圆形、透明状。计算计数板4个角的4大格内细胞数（格子边线上的细胞只记上边、 不计下边；只记左边、不记右边）。细胞密度=4大格细胞总数X0. 25X 107mL。
[0023] 2、细胞增殖曲线绘制
[0024] (1)当786-0及0S-RC-2细胞处于对数生长期，密度80~90%时，制备细胞悬液 并细胞计数，方法同上。调节细胞悬液浓度为IXIO5AiL; (2)接种细胞悬液ImL接种于于 24孔板上，然后再根据不同条件加药，保证每孔细胞数基本一致。同一种细胞同一种加药 条件设计计数6天，每天计数3个孔，即每种条件需设置18个孔；（3)将培养板置于37°C、 5% 0)2中培养；(4)从接种次日开始计数，记为第1天（第0天细胞数记为接种细胞数，即 IXIO5)。每孔加200yL胰酶-EDTA，消化、吹散、计数即可。每隔24小时取3个孔进行细 胞计数；（5)根据计数所得数据绘制细胞生长曲线。
[0025] 3、WST-8细胞活力实验
[0026] (1)收集对数生长期的786-0及0S-RC-2细胞，制备细胞悬液、细胞计数，方法同 上。调节细胞悬液浓度为4X IO4mL; (2)每孔中加入50 y L细胞悬液（即2000个细胞/ 孔），然后各逾加入含有设计值2倍浓度药物的完全培养基50 y L混勾，这样使药物终浓度 恰好为设计值，且保证了各孔细胞数的一致性。每个条件设置5个复孔；（3)将细胞置于 5% C02、37°C条件下的细胞培养箱中孵育；(4)分别在24小时和48小时后终止培养，吸取 孔内培养基，更换新鲜完全培养基，每孔加入10 y LWST-8溶液，用加了新鲜完全培养基和 WST-I溶液但没有接种细胞的孔作为空白对照；（5)避光条件下置于摇床5分钟摇勾，后继 续放入37°C、5% CO2条件下培养箱中培养1小时；(6)酶标仪下测定450nm吸光度值；(7)