共轭亚油酸促进骨折愈合的新用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及共辄亚油酸促进骨折愈合的新用途，属于医药新用途技术领域。
【背景技术】
[0002] 随着全球经济的不断发展、人类交际及流动范围的迅速扩大、延伸与频繁，拌之交 通手段的快速发展，则创伤造成的骨折发生率逐年增高，因此有关骨折的修复一直是骨科 学界研究的热点问题。骨折愈合受全身和外界因素等多因素的影响，目前相关研究多关注 骨折内固定材料和手术方式，以及药物应用等方面对骨折愈合的影响，很少注意到营养物 质代谢同样也是一个重要影响因素。
[0003] 最近研究报道共辄亚油酸可以直接促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，促经 骨形成。成骨细胞和破骨细胞的动态平衡在骨折愈合过程中具有重要的作用，那么共辄亚 油酸是否对骨折愈合有促进的作用。
[0004] 共辄亚油酸（(conjugated linoleic acid?简写CLA))是一组含有共辄双键的亚 油酸的同分异构体混合物，以双键在9和11 (c9, tll-CLA)或10和12(tl0, C12-CLA)位置 上的同分异构体含量最多，属于多不饱和脂肪酸。已发现CLA的天然形式主要存在于反刍 动物的肉类和奶制品。近年来的广泛研究证明，共辄亚油酸有多种生物学活性，例如减少动 脉粥样硬化的严重程度，改善免疫不良刺激的影响，改善瘦素抵抗来发挥其降脂，CLA可以 抑制肿瘤细胞繁殖、抑制肿瘤细胞向细胞外基质成分和纤维粘连蛋白粘附的作用。且具既 无毒又无任何副作用的生物安全性。目前国内、外没有关于CLA对骨折愈合方面的相关研 究，故设计本实验研究CLA对骨折愈合的影响，以期提高我们对营养物质代谢在骨折愈合 中重要作用的认识，为我们今后对骨折愈合的治疗提供又一有效的方法和途径。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了共辄亚油酸的系列生物学实验，为开拓共辄亚油酸促进骨折愈合的 新用途提供了依据。具体生物学实验研究结论包括以下方面：
[0006] 通过建立骨折模型，从血样、影像学检查、力学测试、组织学检查等方面研究共辄 亚油酸对模型动物的影响。血清碱性磷酸酶（ALP)活性在骨折后2周时两组对比有显著性 差异（P〈0. 01)，X线摄片评价显示共辄亚油酸干预组4周骨折线模糊，骨折端骨痂体积大、 骨痂数量多，三名骨折医生对骨折后6周进行评分较空白对照组具有明显统计学差异。根 据实验结果推测：①共辄亚油酸可以促进骨折愈合。②增强机体内成骨活动，提高ALP的活 性。提示其具有开发性的骨折药物的前景。
【附图说明】
[0007] 图I :CLA组与空白两组在不同时间点对大鼠血清ALP浓度的测定对比结果，在2 周时CLA干预组ALP浓度均明显高于生理盐水对照组（p = 0. 0126);
[0008] 图2为CLA组与空白干预两组大鼠胫骨骨折断端在不同时间点最具有代表性的X 光片对比；
[0009] 图3为影像学对骨折愈合组织的分级评分结果示；
[0010] 图4为CLA组与空白组大鼠胫骨骨折断端在不同时间点最具代表性的Micro-CT 扫描图像对比（骨折愈合第4、6周）；
[0011] 图5为CLA组与空白组在不同时间点的大鼠胫骨骨折断端ROI的BMD测定比较；
[0012] 图6为CLA组与空白组在不同时间点的大鼠胫骨骨折断端横截面积（CSA)测定比 较；
[0013] 图7为CLA组与空白组在不同时间点的骨强度指数（BSI)的计算结果比较；
[0014] 图8为CLA组与空白组在骨折愈合第6周最大弯曲应力测试比较；
[0015] 图9 CLA组与空白组为在骨折愈合第6周大鼠骨折骨痂HE染色比较。
【具体实施方式】
[0016] 以下所列实施例，仅为帮助本领域技术人员更全面理解本发明，但不以任何方式 限制本发明。
[0017]〈实施例1>共辄亚油酸对小鼠骨折模型的影响
[0018] 1动物及主要材料
[0019] 1.1实验动物
[0020] 雌性Sprague-Dawley大鼠30只，清洁级，体质量（200 ±15) g
[0021] 1.2试剂和仪器
[0022] 共辄亚油酸（顺-9,反-11CLA，37. 6%;反-10,顺-12CLA，39. 3% ;C18:1，10. 11 %; cl8:0,2. 04%，青岛澳海生物有限公司）
[0023]2实验方法
[0024] 2. 1动物分组
[0025] 将30只雌性SD大鼠骨折造模后随机分成2组，每组15只，A空白对照组 (Control):给予生理盐水灌胃，B给予共辄亚油酸（CLA)灌胃干预（10g/Kg Miet)，曾有报 道应用该剂量研究共辄亚油酸对去势大鼠钙代谢和骨代谢的影响，实验过程中对动物的处 置方法符合2006年科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。
[0026] 2. 2骨折大鼠骨折模型的建立与给药方法
[0027] 用10%水合氯醛以3mL/kg进行腹腔注射麻醉，将大鼠仰卧，四肢固定于手术台 上，各组大鼠行左侧胫骨中段纵形皮肤切口，长约2cm，沿胫前肌肌间隙钝性分离达胫骨干， 固定胫骨，在胫骨干中段用线锯锯断成横行骨折，此过程注意保护神经和肌肉组织，再以直 径为0. 8_的克氏针逆行穿入骨折近端且从胫骨结节穿出，复位骨折后再将其顺行穿入骨 折远段髓腔，生理盐水冲洗，逐层关闭伤口。不包扎，不固定。术后在大鼠尾部标记，待麻醉 醒后放入笼中喂养，自由取食、饮水。
[0028]按照SD大鼠生活习性，活动多集中在黄昏到清晨这段时间，白天常在闭目休息， 所以选择每日的灌胃时间在晚上6-8点之间。并自动物骨折模型造模成功后第一天开始进 行灌胃干预。每天18 :00灌胃一次，灌胃剂量为：A组给予生理盐水灌胃，B组给予共辄亚 油酸灌胃干预（l〇g/Kg ? diet)，其他食物统一给标准鼠粮。各组大鼠均自由进食饮水，12h 光照周期。
[0029] 3标本的采集与检测
[0030] 3. 1血样采集与检测
[0031] 血清碱性磷酸酶（ALP)测定：骨折造模后第2周、第4周和第6周，处死5只实验 大鼠取I. 5ml血，离心后取上清液测定。
[0032] 3. 2影像学检查
[0033] 3. 2. I X-Ray 摄片
[0034] X射线检查大鼠胫骨骨痂的连续性及骨折愈合情况：在胫骨骨折造模后第2周、第 4周和第6周将各组大鼠用10%水合氯醛以3mL/kg进行腹腔注射麻醉后计算机X射线摄 相仪（DR)摄片，拍摄条件为50kV，2. 5ms，观察大鼠胫骨骨痂的连续性及骨折愈合情况。
[0035] 评价方法采用骨痂形成的影像学评分：每张片均由3名高年资的骨科医生分别 评分，对骨折断端愈合组织具体评分标准：〇-无骨痂形成；1-少量或者中等量骨痂形成； 2_有丰富的骨痂形成；3-有连接骨膜骨痂形成，似"桥型连接";4-成熟的连接骨痂；5-连 接骨痂吸收完成，骨折完全连接。如表1所示：
[0036]
[0037] 3. 2. 2Micro_CT 扫描
[0038] 对大鼠胫骨骨折愈合第4周和第6周，进行MicroCT扫描，设定电压65KV，电流 385mA，层间距17. 51 ym，以胫骨骨折线为中心，沿胫骨纵轴上下围绕骨痂周围各取200个 扫描层面，共400个层面，建立三维兴趣区（ROI)以250ms的积分时间带有0. 7°旋转对兴 趣区进行扫描。对骨痂形态学参数分别测量和计算分析，测量以骨折断端为中心ROI的平 均横截面积（CSA，cm 2)和ROI骨密度（BMD)。观察及计算两组以骨折端为中心ROI骨段的 力学强度指数（BSI)。骨强度指数可以客观的反应出骨折愈合情况，并能够提供具体的量 值，具有很强的准确性和特异性。
[0039] 骨强度指数（BSI)=横截面积X骨密度，SP (BSI = CSAXBMD)
[0040] 3. 3力学测试
[0041] 在大鼠骨折愈合第6周通过"三点力学"测试评估骨折愈合强度，通过骨折愈合强 度能够有效的评估和说明骨折愈合程度。将大鼠无痛处死后注意保护骨折断端愈合的骨 痂组织，将其周围的软组织完全剥离。将胫骨放置在生物力学测试仪上，以17mm为跨度，以 5mm/min的速度下降加载负荷载力，直至胫骨断裂[13]，根据载荷-变形曲线得出骨折端最 弯曲载荷力作为计量生物力学指标。
[0042] 3. 4组织学检查
[0043] 3. 4. 1组织学标本的制备：
[0044] 无痛处死大鼠，将大鼠左后侧胫骨分离，并注意保护骨折断端愈合的骨痂组织，将 其周围的软组织完全剥离。标本于10%的福尔马林中浸泡固定120h，自来水冲洗24h，按 组织学检查的要求以及术前造模，以相应骨折部位为标志，在向胫骨远端和近端延长0. 5CM 处（以确保能完整获取骨折愈合区域）用于脱钙组织学染色。
[0045] 4?统计学分析：
[0046] 采用SPSS17. 0对数据进行分析，采用均数土标准差表示，若数据服从正态性及 方差齐性米用两个独立样本的t检验，否则米用Wilcoxon秩和检验，检验水准a = 〇. 05， P〈0. 05为差异有统计学意义。
[0047] 5实验结果
[0048] 5. 1血生化指标检测结果：碱性磷酸酶（ALP)测定
[0049] 骨折2、4、6周后CLA干预组和空白对照组ALP浓度均有不同程度的升高，CLA干 预组在2周时ALP浓度均明显高于生理盐水对照组（p = 0. 0126);骨折后4周、6周CLA干 预组血清ALP浓度均高于生理盐水A组，无统计学意义，如图1所示。
[0050] 图1:空白与CLA两组在不同时间点的大鼠血清ALP浓度测定对比结果，在第2周、 4周、6周ALP的结果均比Control组高，其中在2周时CLA组ALP浓度均明显高于Control 组（p = 0? 0126)*P < 0? 05。
[0051] 5. 2影像学检查结果：X线检查结果
[0052] X-Ray摄片：通过对CLA组和Control组X-Ray摄片的观察和分析，在骨折愈合 第2周，未发现两组有明显区别，骨折断端变化不明显，骨折线清晰可见，未见骨痂组织形 成。在骨折愈合第4周，发现两组均有骨痂形成，骨折线模糊，CLA组均有大量骨痂形成， 而Control组部分有骨痂形成，部分骨折线模糊，但未见明显骨痂。在骨折愈合第6周，是 发现CLA组骨折断端愈合，骨折线消失，多数外骨痂近于消失接近健康骨骼结构和外形， Control组均产生大量骨痂，骨折线消失，但无一例接近骨折完全愈合标准，见图2, CLA组 与Control组大鼠胫骨骨折断端在不同时间点最具代表性的X-Ray摄片对比；
[0053] 从图2结果可以看出：可以看出骨折愈合第2周两组变化不明显，第4周骨折断 端均可见骨痂形成，第6周发现CLA组愈合接近完全愈合，Control组仍有外骨痂，并没有 达到完全愈合标准。
[0054] X-Ray 摄片评分：通过 3 名骨科医生依照 "Radiographic Grading Scale of Fracture Callus Formation"的标准评分分析，在骨折愈合第2周CLA组：I. 08±0. 16 分；Control 组：0? 83