±0. 19 分。在骨折愈合第 4 周 CLA 组：3. 66±0. 33 分；Control 组： 3. 0±0. 33 分。在骨折愈合第 6 周 CLA 组：4. 43±0. 57 分；Control 组：3. 38±0. 36 分。在 骨折第6周时CLA组的评分明显高于Control组，见图3。
[0055] 从图3结果可以看出：骨折愈合第2周时X-Ray摄片分值很接近（P = 0. 23)。骨 折愈合第4周时，CLA组分值要高于Control组，但无统计学差异（P = 0.07)。骨折愈合第 6周时，CLA组的评分明显高于Control组，并且有统计学差异（P = 0. 002)。
[0056] Micro-CT 扫描结果
[0057] Micro-CT扫描图像分析：骨折愈合第4周CLA组与Control组骨皮质不连续，内部 骨小梁未全部形成连续性，骨折线清晰可见。骨折愈合第6周，CLA组骨皮质连续性存在， 骨折断端未见透亮影，近似正常骨结构，Control组骨折线模糊，皮质骨大部分连续，仍可见 骨痂存在，如图4所示。
[0058] 骨密度（BMD)测定：Micro-CT骨形态学参数由大鼠胫骨骨折断端为中心测量而 得。骨折愈合第4周，CLA组中大鼠胫骨骨折断端ROI的BMD(0. 88±0. 14g/cm3)，Control 组中大鼠胫骨骨折断端ROI的BMD (0. 85 ±0. 07g/cm3)，CLA组与Control组之间的BMD 差异无统计学意义（P > 〇. 05)。在骨折愈合第6周，CLA组中大鼠胫骨骨折断端ROI的 BMD(0. 98±0. 05g/cm3) ,Control 组中大鼠胫骨骨折断端 ROI 的BMD(0. 86±0. 08g/cm3)，CLA 组与Control组之间的BMD差异有统计学意义（P < 0.05)。CLA组中大鼠胫骨骨折断端 ROI的BMD明显高于Control组，如图5所示。
[0059] 骨折断端横截面积（CSA)测定：Micro-CT骨形态学参数由大鼠胫骨骨折断端为中 心测量而得。骨折愈合第4周，CLA组中大鼠胫骨骨折断端ROI的CSA(13. 85±5. 33mm2)， Control组中大鼠胫骨骨折断端ROI的CSA(9. 13±3. 32mm2)，CLA组与Control组之间的 CSA差异无统计学意义（P > 0. 05)。骨折愈合第6周，CLA组中大鼠胫骨骨折断端ROI的 CSA(14. 05±3. 13mm2) ,Control 组中大鼠胫骨骨折断端 ROI 的 CSA(9. 38± I. 87mm2)，CLA 组 与Control组之间的CSA差异有统计学意义（P < 0. 05)。CLA组中大鼠胫骨骨折断端ROI 的CSA明显高于Control组，如图6所示。
[0060] 骨强度指数（BSI)的计算分析：骨折愈合第4周，CLA组中大鼠胫骨骨折断端ROI 的851(12.32±5.7111^/臟），（：〇11钍〇1组中大鼠胫骨骨折断端1?01的851(7.50±2.1111^/ mm)。CLA组与Control组之间的BSI差异无统计学意义（P > 0. 05)。骨折愈合第6周， CLA组中大鼠胫骨骨折断端ROI的BSI (13. 73±2. 67mg/mm)。Control组中大鼠胫骨骨折 断端ROI的BSI (8. 07 ± I. 66mg/mm)，CLA组与Control组之间的BSI差异有统计学意义（P < 0. 05)。CLA组中大鼠胫骨骨折断端ROI的BSI明显高于Control组，如图7所示。
[0061] 5. 3力学测试结果
[0062] 本实验生物力学测试应用3点弯曲应力试验测试大鼠胫骨骨折断端愈合的 力学强度。在骨折愈合第6周，比较CLA组与Control组之间的最大弯曲应力，CLA组 (78. 12±10.03N)，Control 组（32.34±8.99N)，比较两组差异 P = 0.03,具有统计学意义 (P <0? 05)。CLA组3点弯曲应力高于Control组，如图8所示。
[0063] 6组织学观察
[0064] 根据HE染色，如图9所示，可以观察到，在骨折愈合第6周，CLA组骨痂中心有部 分软骨细胞样类骨质，骨痂内软骨骨化明显，充满大量的骨样类骨质，形成编织骨，骨痂边 缘骨桥形成完整，骨痂开始塑型；Control组骨痂中心仅为小部分肥大软骨细胞，骨痂内有 较多软骨样类骨质，骨痂边缘部分骨桥形成。
[0065]7讨论：
[0066] 骨折愈合是机体结缔组织的一种再生修复，涉及到细胞、生长因子、细胞外基质相 互作用一个复杂的过程，在骨折修复过程中包括重叠的四个阶段：最初的炎症反应、软骨痂 形成、硬骨痂形成、最后的骨重建的完成。在整个过程均需要有关骨折修复的各种细胞的增 殖和相互作用，特别是成骨细胞发挥着重要的作用，成骨细胞分泌的ALP可以渗透入血液， 因此血清ALP可作为成骨细胞活跃性的指标。
[0067]ALP被认为是骨形成的标志物之一。ALP能分解有机磷酸化合物，产生大量的无机 磷酸盐离子，促使其与钙离子结合成磷酸钙而沉积于骨组织中，其含量变化可预示骨折愈 合程度。本实验结果显示，应用CLA干预胫骨骨折大鼠，显著提高血清ALP的活性，说明成骨 细胞活跃，也有研究报道有实验结果显示高浓度c9, tll-CLA及tlO, C12-CLA均能显著提高 成骨细胞系MG63细胞及Sa0S2细胞的ALP活性，并增加细胞成熟过程中矿化结节的数量， 这提示其对成骨过程有一定的促进作用。体外实验表明c9, tll-CLA能够促进体外培养的 人骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化，同时不影响其向成骨细胞分化；而tlO, C12-CLA能 够促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化同时抑制其向脂肪细胞分化，这与本实验结果相 一致。提示CLA能通过影响成骨细胞和破骨细胞的转化和相互作用，实现促进骨折愈合。
[0068]骨矿物质含量与骨力学强度密切相关，骨强度的80%可以用骨密度来判定。骨基 质形成后需要骨盐沉积以完成愈合，骨折端组织的矿化导致局部骨量和骨密度的增加，骨 痂趋于成熟骨化，使骨的力学强度迅速增加。故骨矿含量的变化也反映了骨折愈合[18]。 本实验通过Micro-CT扫描测定骨折端骨密度，在骨折愈合第6周，CLA干预组的BMD明显 高于Control组（P < 0. 05)。反映出CLA可能具有提高骨折愈合骨痂骨密度，促进骨折愈 合质量。
[0069] 力学强度恢复和结构完整是骨折愈合的观察终点，结合生物力学测试及Micro-CT 扫描计算BSI对比，其中BSI作为骨折愈合定量评价的依据，准确率90. 5%，能够精确反映 骨折愈合与否。实验结果示CLA干预组骨折愈合强度优于Control组，暗示CLA可能通过 提高骨折愈合质量，从而优化骨折愈合强度，能够促进骨折愈合。
[0070] 综上所述，骨折愈合生物学过程复杂，影响骨折愈合因素是多方面的，通过本实验 表明：CLA可能对骨折愈合具有促进的作用，补充CLA可能成为促进骨折愈合又一有效安全 的方法。
[0071]本实验结果提示CLA对骨折愈合有促进作用。通过对骨折不同时间点观察血清 ALP和放射学检查说明经过CLA干预后的大鼠骨折愈合明显优于空白对照组。血清ALP在 骨折后2周明显高于空白对照组P = 0. 0126,而且在术后第4、6周，CLA干预组的ALP均高 于空白对照组，虽然两组对比无统计学意义，但是发现CLA干预组的ALP保持一定的水平， 我们认为CLA可以提高ALP的活性，从而说明CLA有助于骨折早期愈合。放射学的检查同 样证实这一点，选3名骨科医生对X线光片的评价，并应用统一的骨痂愈合评分标准，我们 发现在术后第6周，CLA干预组的评分3. 38±0. 36分，空白对照组评分4. 43±0. 57分，CLA 干预组明显优于空白对照组P〈〇. 05, 2、4周两组虽没有统计学意义，但是CLA干预组的评分 均优于空白对照组。以上的结果说明CLA可以促进骨痂形成，有助于骨折愈合。
[0072]骨折愈合是机体结缔组织的一种再生修复，涉及到细胞、生长因子、细胞外基质相 互作用一个复杂的过程，在骨折修复过程中包括重叠的四个阶段：最初的炎症反应、软骨痂 形成、硬骨痂形成、最后的骨重建的完成在整个过程均需要有关骨折修复的各种细胞的增 殖和相互作用，特别是成骨细胞发挥着重要的作用，成骨细胞分泌的ALP可以渗透入血液， 因此血清ALP可作为成骨细胞活跃性的指标。
[0073] 骨折愈合的过程影响生化骨代谢标记物变化，ALP被认为是骨形成的标志物之一。 ALP能分解有机磷酸化合物，产生大量的无机磷酸盐离子，促使其与钙离子结合成磷酸钙而 沉积于骨组织中，其含量变化可预示骨折愈合程度。本实验结果显示，应用CLA干预胫骨骨 折大鼠，显著提高血清ALP的活性，说明成骨细胞活跃，也有研究报道有实验结果显示高浓 度c9, tll-CLA及tlO, C12-CLA均能显著提高成骨细胞系MG63细胞及Sa0S2细胞的ALP活 性，并增加细胞成熟过程中矿化结节的数量，这提示其对成骨过程有一定的促进作用。体外 实验表明c9, tll-CLA能够促进体外培养的人骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化，同时不 影响其向成骨细胞分化；而110, cl2-CLA能够促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化同时 抑制其向脂肪细胞分化，这与本实验结果相符合。提示CLA可能通过影响成骨细胞和破骨 细胞的转化和相互作用，实现促进骨折愈合。
[0074] 本实验具有一定的局限性，骨折愈合是一个复杂的过程，通过血生化和放射学说 明CLA对骨折具有积极有益的作用，根据实验结果证明：①共辄亚油酸可以促进骨折愈合。 ②增强机体内成骨活动，提高ALP的活性。提示其具有开发性的促骨折愈合药物的前景。
[0075] 另外，共辄亚油酸结合物理方法（如紫外线照射、超声波等）治疗骨质疏松和促进 骨折愈合，具有更好的疗效。
[0076] 共辄亚油酸的摄入在促进骨折愈合和骨质疏松治疗中的作用应该与钙剂的补充 受到同样的重视。
[0077] 共辄亚油酸的补充通过减少脂肪组织，增加肌肉组织，为促进骨折愈合和治疗骨 质疏松提供微应力环境。
[0078] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 共辄亚油酸在制备促进骨折愈合、骨质疏松药物中的应用。2. 含共辄亚油酸为活性成分的药物组合在制备促进骨折愈合、骨质疏松药物中的应 用。
【专利摘要】本发明公开了一种共轭亚油酸促进骨折愈合的新用途，整体动物和分子细胞水平的相关实验研究表明，共轭亚油酸能够通过提高大鼠骨折愈合骨痂的质量，进一步提高骨折愈合强度，达到促进骨折愈合。根据实验结果证明：①共轭亚油酸可以促进骨折愈合。②增强机体内成骨活动，提高ALP的活性。提示其具有开发性的促骨折愈合药物的前景。
【IPC分类】A61P19/08, A61K31/201, A61P19/10
【公开号】CN105193779
【申请号】CN201510575399
【发明人】陈亮, 单中书, 罗宗平
【申请人】苏州大学
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年9月11日