Q ID N0:5所示。质粒构建的示意图如图1 ;其中PAc片段包含2061碱基，编码687个氨基酸(PAc全长蛋白的219— 905位)，Glu片段包含876碱基，编码291个氨基酸(Glu全长蛋白的1185-1475)。
[0018]2、重组KFD2-PAc-Glu的表达与纯化
转化菌在添加了 50 μ g/ml卡那霉素Luria-Bertani (LB)培养液中在37°C培养过夜；
0.5毫摩尔异丙基-D -半乳糖苷(IPTG)诱导对数生长期细菌。表达的重组蛋白由亲和色谱法在N1-NTA柱(QIAGEN)纯化，纯化的蛋白由Bradford法进行定量，并通过SDS-PAGE鉴定。污染的内毒素和脂多糖(LPS)的去除使用Detox1-Gel Endotoxin Removing Gel(Thermo Scientific, USA)。最终的蛋白质制剂的内毒素和内毒素的含量用Pierce LALChromogenic Endotoxin Quantitat1n Kit (Thermo Scientific, USA)进行了测定，其值为〈0.01 EU/微克。
[0019]3、纯化的KFD2-PAc-Glu TLR5活性的检测将长成单层的的Caco-2细胞传代，并以2 X 15/孔的密度接种至24孔板，置37°C温箱孵育。至细胞间界限明显再培养3天后，将完全培养基换成无血清DMEM培养基，饥饿12h后用无血清培养基洗细胞I次。用无血清培养基稀释蛋白样品，至终浓度分别为0.1、
1、10、ΙΟΟηΜ，将稀释好的样品分别加入细胞孔内，0.5mL/孔，每个样品各稀释度做3个重复，将细胞板置37°C温箱孵育。6h后收集培养液，2000rpm离心10分钟，取上清分装冻存于-80°C。ELISA试剂盒(BD)检测上清中的IL-8含量。
[0020]4、龋齿进展观察模型
6组雌性Wistar大鼠(n = 5),18日龄断奶和喂食致龋饲料一Keyes 2000。19至23日龄，添加抗生素(氯霉素，氨苄青霉素，羧苄青霉素，1.0克/公斤饲料或水)，暂时抑制口腔菌群，促进致龋细菌定植。24至28日龄，用预先浸泡细菌溶液的试子，通过口腔将2x109CFU的变形链球菌Ingbritt接种大鼠。牙齿表面的细菌样本进行了检查，以验证每只大鼠感染。以接菌完成的日期记为O天，在d0，d42, d56, d84, dll2, dl40分别杀鼠，进行磨牙離齿积分。
[0021]大鼠龋齿评估
断颈处死大鼠，下颚被拆除，清理，并用紫脲酸铵染色。磨牙洗净，切片和龋齿程度用凯斯(Keyes)方法确定。離损的延伸和深度记分为:牙釉质離(E)、浅表牙本质離(Ds)、中度牙本质龋(Dm)及重度牙本质龋(Dx)。龋损的整体得分为E，Ds和Dm及Dx分数的总和。
[0022]5、治疗性龋齿疫苗实验大鼠模型
4组雌性Wistar大鼠(n = 5),18日龄断奶和喂食致龋饲料一Keyes 2000。19至23日龄，添加抗生素(氯霉素，氨苄青霉素，羧苄青霉素，1.0克/公斤饲料或水)，暂时抑制口腔菌群，促进致龋细菌定植。24至28日龄，用预先浸泡细菌溶液的试子，通过口腔将2x109CFU的变形链球菌Ingbritt接种大鼠。牙齿表面的细菌样本进行了检查，以验证每只大鼠感染。以接菌完成的日期记为O天，接菌完成后将动物进行随机分组，分成5组control，PBS, PAc, KF-PAc, KFD2-PAc_Glu，control组在d56杀鼠，作为治疗性龋齿疫苗干预前龋损的基础值。其余四组分别在d56，d84, dll2分别滴鼻免疫:(I)PBS ; (2)5微克PAc ; (3)8.5微克KF-PAc; (4)9微克KFD2_PAc_Glu。在dl40采取唾液和放血后，断颈处死大鼠，取磨牙进行龋损积分。实验组龋齿抑制率计算公式如下:[1-(实验组龋齿总积分-control组離齿总积分)/ (PBS组離齿总积分-control组離齿总积分)]*100%。
[0023]6、唾液及血清中PAc特异性抗体分析
聚苯乙稀96孔平底酶标微孔板(Greiner，德国)，100微升PAc (5微克/毫升，碳酸盐缓冲液，pH值9.6 )包被，37 °C，3小时。在4°C用含I %牛血清白蛋白(BSA)封闭过夜后，洗板3次，连续稀释的唾液或血清加入到每孔，并在37°C孵育2小时。每孔再用PBST洗涤，然后加入100 μ L碱性磷酸酶标记的羊抗大鼠IgG或IgA (1:1000，Southern b1tech公司)，在37°C孵育I小时，再度洗涤后，加入磷酸盐底物(P -硝基苯磷酸盐)显色，37°C孵育30分钟。在405 nm读取光密度(OD)值。最高稀释度的吸光度与阴性对照(没有样品)的吸光度相比超过多0.1，此最高稀释度定义为终点滴度。
[0024]7、唾液及血清中Glu特异性抗体分析 ⑴Glu的重组表达及纯化
BL21 pET28a-Glu菌株，表达不可溶的Glu。经超声裂菌，洗涤去除可溶性蛋白，得到纯化的包涵体沉淀。沉淀用尿素溶解后离心，吸上清，即得尿素变性的Glu上清。尿素变性的Glu蛋白用PBS梯度透析复性，再超滤浓缩，获得可溶性的Glu蛋白。
[0025]⑵唾液及血清中Glu特异性抗体分析
取纯化的Glu蛋白进行SDS-PAGE分离后，再将蛋白条带电转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭液封闭后，加入系列稀释的各组免疫大鼠血清4°C孵育过夜，充分洗涤后，加入碱性磷酸酶标记的二抗(1:2000稀释，山羊抗大鼠IgG, Abcam ;山羊抗大鼠IgA, 1:4000稀释，Southern B1tech)室温孵育lh。充分洗涤后，加BCIP和NBT配置的显色液显色，自来水漂洗终止反应。
[0026]二、实验结果
图1显示了 pET28a-KFD2-PAc-Glu质粒构建的示意图；以SEQ ID NO:6和SEQ IDN0:7所示的序列为引物，以表达变形链球菌(S.mutans)毒力因子Glu的质粒pGJA-P/VAX为模版，PCR扩增获得目的基因片段glu，再将酶切回收后的该片段与同样酶切线性化的pET28a-KFD2-PAc质粒连接获得融合蛋白表达质粒pET28a-KFD2-PAc_Glu。
[0027]图2 显示了纯化了的 PAc，KF-PAc 和 KFD2_PAc_Glu 的 SDS-PAGE 图；结果显示KFD2-PAc-Glu、KF-PAc以及PAc的主带分别在130kD、130kD、70kD左右，均与预期分子量相符，说明纯化的蛋白纯度分子量大小正确且纯度较高。
[0028]图3显示了纯化了的PAc，KF-PAc和KFD2_PAc_Glu的TLR5激活活性验证:由于鞭毛素蛋白是TLR5信号通路的激动剂，它能激活TLR5信号通路的表达，并释放高水平的趋化因子IL-8。人结肠上皮细胞系(Caco-2)组成性表达TLR5，所以常被用作体外检测鞭毛素活性的细胞系。将Caco-2细胞铺入24孔细胞培养板，待极化好后，用不同浓度的蛋白进行刺激，收集上清检测IL-8的分泌情况。结果显示:PAc作为非鞭毛素对照不能诱导Caco-2细胞产生IL-8，融合蛋白KF-PAc、KFD2-PAc-Glu均能诱导IL-8的分泌。当蛋白浓度小于1nM时，KFD2-PAc-Glu诱导IL-8分泌的能力低于KF_PAc，但当蛋白浓度增大至10nM时，2者诱导IL-8的水平相当。上述结果表明:KF_PAc和KFD2_PAc_Glu都具有激活TLR5信号通路的能力。
[0029]图4显示了大鼠龋齿模型的龋坏进展图，(A)大鼠龋齿模型的龋坏进展观察的实验程序:除菌、接菌、免疫、采样、杀鼠；(B)不同时间点的大鼠磨牙的不同龋坏程度的凯斯(Keyes)得分，E,牙釉质龋；Ds，浅表牙本质龋；Dm，中度牙本质龋；Dx，重度牙本质龋；(C)不同时间点的大鼠龋坏的总体得分=E+Ds+Dm+Dx ; (D)不同时间点的大鼠龋坏的代表性图片。B-C，数据表示为均值加上标准偏差值。
[0030]本研究将接菌完成的当日计为O天。在-9至-5天饲喂抗生素进行除菌，-4至O天进行口腔接菌。接菌完成后将动物进行随机分组，分成6组，分别在d0，d42, d56, d84,dll2, dl40杀鼠，取磨牙进行龋坏观察、Keyes评分。结果表明大鼠在接菌后第6周可见龋损，以牙釉质龋为主，可见少量浅表牙本质龋，平均总积分20.5 ;第8周，100%的大鼠出现浅表牙本质龋，平均总积分约28 ;第12周龋损进一步进展，开始出现中度牙本质龋(Dm)龋损，離齿积分平均约46、第16周離齿积分为61、第20周離损进一步发展，100%的大鼠出现中度牙本质龋，并可见少量深度牙本质龋，总积分达73。
[0031]图5显示了治疗性龋齿疫苗实验大鼠模型的实验流程。本研究将接菌完成的当日计为O天。在-9至-5天饲喂抗生素进行除菌，-4至O天进行口腔接菌。接菌完成后将动物进行随机分组，分成 5 组:control, PBS, PAc, KF-PAc, KFD2_PAc_Glu，control 组在d56杀鼠，作为治疗性龋齿疫苗干预前龋损的基础值。其余