四组分别在d56，d84, dll2分别滴鼻免疫=(I)PBS ；(2) 5 微克 PAc ; (3) 8.5 微克 KF-PAc; (4)9 微克 KF-PAc。在 dl40采取唾液和放血后，断颈处死大鼠，取磨牙进行龋损积分。
[0032]图6显示了四组大鼠磨牙的不同龋坏程度的凯斯(Keyes)得分，数据表示为均值加上标准偏差值；四组大鼠滴鼻免疫:(I) PBS ; (2) 5微克PAc ； (3) 8.5微克KF-PAc; (4)9 微克 KFD2-PAc-Glu。*，P <0.05 ;** P <0.01 ;_，P〈0.001。符号:E,牙釉质龋；Ds，浅表牙本质龋；Dm，中度牙本质龋；Dx，重度牙本质龋。
[0033]①PBS组、PAc组、KF-PAc组、KFD2_PAc_Glu组4组的釉质龋积分均显著高于免疫干预前的龋损基础值(control组);KFD2-PAc_Glu组的E得分显著低于PBS组和PAc组；
②KFD2-PAc-Glu组的Ds得分显著低于PBS组和PAc组，但与control组无显著差异！③PBS组、PAc组、KF-PAc组均可见中度及重度牙本质龋，但KFD2-PAc-Glu组及control组未观察到这2种成都的龋损。
[0034]图7显示了四组大鼠龋坏的整体得分。龋损的延伸和深度记分为:牙釉质龋(E)、浅表牙本质龋(Ds)、中度牙本质龋(Dm)及重度牙本质龋(Dx)。龋损的整体得分为E，Ds和Dm及Dx分数的总和。数据表示为均值加上标准偏差值；四组大鼠滴鼻免疫=(I)PBS ;(2)5微克 PAc ；(3) 8.5 微克 KF-PAc; (4) 9 微克 KFD2_PAc_Glu。*，P <0.05 ;** P <0.01 ;***，P <0.001ο
[0035]结果显示:①与阴性对照组PBS组相比，单纯抗原PAc免疫组的龋损总积分无显著差异，而融合蛋白KF-PAc及KFD2-PAc-Glu免疫组的龋损总积分均显著降低；②在所有的抗原免疫组中，KFD2-PAc-Glu免疫组的龋损总积分最低，显著低于PAc及KF-PAc组；③与龋损本底组control相比，KFD2_PAc_Glu免疫组的離损总积分无显著差异。
[0036]图8显示了相对于PBS组，其他免疫组的防龋保护力，数据表示为均值加上标准偏差值；四组大鼠滴鼻免疫=(I)PBS ;(2)5微克PAc ;(3)8.5微克KF-PAc; (4)9微克KFD2-PAc-Gluo *，P〈0.05;** P <0.01 ;_，P〈0.001。
[0037]相对于PBS组，PAc、KF_PAc、KFD2-PAc_Glu免疫组的抑龋效果分别为20%、50%、90%，KFD2-PAc-Glu的抑龋效果显著高于PAc及KF-PAc组，说明KFD2_PAc_Glu是最好的治疗性龋齿疫苗。
[0038]图9显示了 PAc特异性的抗体滴度:A，血清IgG ;B，血清IgA ;C，唾液IgA。四组大鼠滴鼻免疫=(I)PBS ;(2)5 微克 PAc ;(3)8.5 微克 KF-PAc; (4)9 微克 KFD2-PAc_Glu。其中数据表示为均值±标准差；*，P <0.05 ;林P <0.01 ;***，P <0.001 ；
融合蛋白KF-PAc及KFD2-PAc-Glu免疫组大鼠，PAc特异性的血清IgG、血清IgA、唾液IgA滴度均显著高于单纯抗原PAc免疫组；KF-PAc与KFD2_PAc_Glu 2组在PAc特异性的血清IgG、血清IgA、唾液IgA滴度上均无显著差异。说明鞭毛素与PAc融合后，能显著促进PAc特异性的系统及粘膜抗体应答。
[0039]图10显示了龋齿积分与PAc特异性抗体相关性分析:A，血清IgG ;B，血清IgA ;C，唾液IgA0四组大鼠滴鼻免疫=(I)PBS ; (2) 5微克PAc ; (3) 8.5微克KF-PAc; (4) 9微克KFD2-PAc-Glu。其中每个点代表一只大鼠的数据；
相关性分析显示PAc特异性的血清IgG、血清IgA、唾液IgA均与龋齿积分呈显著负相关，表明PAc特异性的血清和唾液抗体应答在龋损进展的抑制中发挥了重要作用、可以对机体的牙齿起到免疫保护作用。
[0040]图11显示了 Glu特异性的抗体滴度:A，血清IgG ;B，血清IgA。四组大鼠滴鼻免疫:(I) PBS ; (2) 5 微克 PAc ； (3) 8.5 微克 KF-PAc; (4)9 微克 KFD2-PAc_Glu。
[0041]将等量的GLu抗原用SDS-PAGE进行分离后，转移到PVDF膜上，将各组大鼠血清分别进行系列稀释后，作为一抗与PVDF膜进行孵育，再用AP标记的羊抗大鼠IgG或IgA作为二抗，充分洗涤后用BCIP/NBT在膜上显色，观察特异性条带(Glu的分子量约30kDa)的有无。用羊抗大鼠的IgG做二抗时，KFD2-PAc-Glu免疫后的大鼠血清在稀释倍数达8000倍时，还可以检测到Glu抗原，而PBS组、PAc组、KF-PAc组即使在125倍稀释时也检测不到Glu条带；用羊抗大鼠的IgA做二抗时，在血清进行20倍稀释后，KFD2-PAc-Glu免疫后的大鼠血清可检测到Glu抗原，而其余三组未检测到。考虑到western blotting检测抗体滴度的灵敏度远低于ELISA，我们可以断定的是KFD2-PAc-Glu免疫后的大鼠血清中Glu特异性的IgG滴度高于8000、IgA滴度高于20。
[0042]三、实验结论
从以上结果可以看出，KFD2-PAc-Glu是相对最好的治疗性疫苗。
[0043]最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
【主权项】
1.一种龋齿疫苗，其特征在于，所述龋齿疫苗是通过将所述变形链球菌表面蛋白PAc派生的抗原的DNA序列插入到所述鞭毛素派生的佐剂的DNA序列的下游3’端或替代全部的所述鞭毛素派生的佐剂的DNA序列的高变域，然后与变形链球菌葡糖基转移酶派生的抗原的DNA序列连接后共表达而成的重组蛋白。2.根据权利要求1所述的龋齿疫苗，其特征在于，所述变形链球菌表面蛋白PAc派生的抗原的DNA序列由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的部分组成；所述变形链球菌表面蛋白PAc派生的抗原的DNA序列包含至少一个抗原表位。3.根据权利要求1所述的龋齿疫苗，其特征在于，所述鞭毛素派生的佐剂的DNA序列由SEQ ID NO:2 组成。4.根据权利要求1所述的龋齿疫苗，其特征在于，变形链球菌葡糖基转移酶派生的抗原的DNA序列由SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 3的部分组成；变形链球菌葡糖基转移酶派生的抗原的DNA序列包含至少一个抗原表位。5.根据权利要求1所述的龋齿疫苗，其特征在于，所述的龋齿疫苗DNA序列由SEQIDNO:4组成。6.根据权利要求1所述的龋齿疫苗，其特征在于，所述共表达的方式为原核表达。7.根据权利要求6所述的龋齿疫苗，其特征在于，所述共表达的载体为pET28a载体。8.一种如权利要求1-7任一所述的龋齿疫苗的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤: 将所述变形链球菌表面蛋白PAc派生的抗原的DNA序列插入到所述鞭毛素派生的佐剂的DNA序列的下游3’端或替代全部的所述鞭毛素派生的佐剂的DNA序列的高变域，然后与变形链球菌葡糖基转移酶派生的抗原的DNA序列连接后共表达出所述龋齿疫苗。9.一种龋齿疫苗组合物，其特征在于，所述龋齿疫苗组合物包括如权利要求1-7任一所述的龋齿疫苗和药学上可接受的载体。10.一种如权利要求1-7任一所述的龋齿疫苗在制备预防或治疗由变形链球菌感染引起的龋齿的药物中的用途。
【专利摘要】本发明公开了一种龋齿疫苗，所述龋齿疫苗是通过将所述变形链球菌表面蛋白PAc派生的抗原的DNA序列插入到所述鞭毛素派生的佐剂的DNA序列的下游3’端或替代全部的所述鞭毛素派生的佐剂的DNA序列的高变域，然后与变形链球菌葡糖基转移酶派生的抗原的DNA序列连接后共表达而成的重组蛋白。通过建立一种治疗性龋齿疫苗的大鼠模型，以变形链球菌毒力因子PAc、Glu为疫苗抗原、重组细菌鞭毛素蛋白（KF）为粘膜佐剂，系统研究比较了PAc、KF-PAc、KFD2-PAc-Glu的免疫应答效应和抗龋保护效应，结果显示KFD2-PAc-Glu是相对最好的治疗性疫苗，即本发明所述龋齿疫苗是相对最好的治疗性疫苗。
【IPC分类】A61K39/09, A61P1/02, C07K14/315, A61K48/00, A61K39/39, A61P31/04
【公开号】CN105214084
【申请号】CN201510461367
【发明人】鄢慧民, 钟茂华, 杨菁毅, 包容, 孙颖
【申请人】鄢慧民, 钟茂华, 杨菁毅, 包容, 孙颖
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年7月31日