骨移植物成骨潜能的增强的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及通过用Wnt多肽如脂质体Wnt多肽进行的活体外处理增强骨移植物的成骨潜能。特别地，本发明涉及用Wnt3a蛋白，优选脂质体Wnt3a(L-Wnt3a)对骨移植物的活体外处理。
【背景技术】
[0002]矫形和牙科植入物用于多种关节和牙齿置换及促进人体和动物中的骨修复，特别是髋和膝关节及牙齿的置换。虽然许多个体经历简单的愈合和功能恢复，但也存在高的并发症率，对于全关节置换估计为10-20%。植入物-骨骼界面处的故障造成这些失败中的大部分并使得随后的矫正手术成为必要。另外，用作正畸牙移动的锚固装置的植入物据估计具有40%的失败率且由于植入物-骨骼界面处的故障使得随后布置另外的植入物成为必要。
[0003]矫形和牙科植入物由相对惰性的材料(“异种成形(alloplastic) ”材料)(通常金属和陶瓷或塑料的组合)制成。之前用于改善矫形植入物手术的结果的途径主要集中于植入物表面的物理改变，其设计为用于增加骨形成。这些途径包括使用具有多孔金属表面的植入物以促进骨内生和用轻磷灰石乳楽(hydroxyapatite plasma)喷射植入物。使用牙科植入物的途径也包括使用形态增强的钛表面，其中表面粗糙度通过如喷砂、酸蚀刻或氧化的方法赋予。
[0004]也试图促进骨整合，其中植入物表面发生大的改变。例如，包含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列的短肽连接于植入物的表面，因为细胞利用RGD序列以粘附于细胞外基质。研究者尝试再建这种细胞与改性的植入物表面的粘附，但这一策略仅导致植入物骨整合和机械固定的轻度增加。或者，在尝试刺激植入物周围的血管内生时，它们的表面用包含血管生成生长因子VEGF的涂层涂覆。浸入盐水溶液中的植入物已作为增加植入物骨整合的手段上市，但具有很少或没有数据证实所声称的效果。
[0005]用于刺激骨整合的另一策略是使植入物表面纳米织构化(nano-texture)。这一策略的基本原理是织构化增加表面积并因此防止植入物相对于在植入物周围环境中的细胞“滑动”。但是在临床试验中，纳米织构化未产生可测量的益处。
[0006]用于刺激植入物骨整合的基于蛋白质的方式的使用也已经进行了广泛研究。重组骨形态发生蛋白(BMP)在骨折中诱导稳健的骨形成且它们也已经用于试图刺激植入物周围的直接骨形成。尽管体外结果是令人鼓舞的，但体内数据仍然不能令人信服。重组BMP抑制骨髓腔中细胞的成骨分化并因此禁用于植入物骨整合。参见Sykaras等(2004)Clin OralInvestig 8 (4): 196-205 和 Minear 等(2010) Journal of Bone and Mineral Research25(6):1196-207oBMP的使用与异位骨化发生率的提高和不受控的炎症相关，且较新的元数据分析也表明增加的癌症风险。
[0007]Wnt蛋白形成高度保守的分泌信号传导分子的家族，其结合由Frizzled和低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)编码的细胞表面受体。WNT基因家族由编码分泌的信号传导蛋白质的结构相关的基因组成。这些蛋白质牵涉到肿瘤发生及几种发育过程，包括细胞命运的调控和胚胎发生过程中的模式形成。一旦结合，配体启动细胞内事件的级联，其最终通过β-连环蛋白和DNA结合蛋白TCF的核活性导致革巴基因的转录(Clevers Η, 2004 Wntsignaling:lg-norrin the dogma.Curr B1l 14:R436_R437 ;Nelson WJ, Nusse R 2004Convergence of Wnt, beta-catenin, and cadherin pathways.Science 303:1483—1487;Gordon MD, Nusse 2006 Wnt signaling:Multiple pathways, multiple receptors, andmultiple transcript1n factors.J B1i Chem 281:22429-22433)。
[0008]Wnt也涉及到与骨发生的程序相关的广泛的细胞决策。例如，Wnt调节sox9和runx2的表达水平，其影响间充质祖细胞定型为软骨生成或骨生成细胞的命运。Wnt影响骨原细胞的分化率。在成年动物中，有大量证据证明Wnt信号传导调节骨量。例如，人Wnt共受体LRP5中的功能获得性突变与几种高骨量综合征相关，包括I型骨质石化病和骨内膜骨质增生或常染色体显性骨硬化病。Wnt功能丧失性突变引起低骨量疾病，包括骨质疏松症-假神经胶质瘤。Wnt抑制剂Dkkl的产生增加与多发性骨髓瘤(具有增加的骨吸收作为其区别特征之一的一种疾病)相关。对于进一步的详细信息，参见S.Minear等，Wnt proteins promote bone regenerat1n.Sc1.Transl.Med.2, 29ra30(2010)；Zhao 等,Controlling the in vivo activity of Wnt liposomes, Methods Enzymol465:331-47 (2009) ；Popelut 等,The accelerat1n of implant osseointegrat1n byliposomal Wnt3a, B1materials 31 9173e9181 (2010)和 Morrell NT, Leucht P, ZhaoL, Kim J-B, ten Berge D等(2008)Liposomal Packaging Generates Wnt Protein with InVivo B1logical Activity.PLoS ONE 3(8):e2930。
[0009]已证明将Wnt蛋白与脂质囊泡(脂质体)组合产生具有生物活性的Wnt制剂(Morrell 等,2008,同上；和 Zhao 等,2009,同上)(Minear 等,2010,同上；和 Popelut等，2010，同上)。可溶性无翅蛋白(wingless protein)的生物活性描述于van Leeuwen等(1994) Nature 24:368 (6469): 3424中。使用可溶性生物活性脊椎动物Wnt蛋白对Wnt-Frizzled 相互作用的生物化学表征由 Hsieh 等(1999)Proc Natl Acad Sci US A96(7):3546-51 描述。Bradley 等(1995)Mo 1 Cell B1i 15 (8): 4616-22 描述了具有促有丝分裂活性的Wnt蛋白的可溶性形式。使用脂质体Wnt蛋白增强骨整合描述于美国专利公开 N0.20120115788 中。
【发明内容】
[0010]在一个方面，本发明涉及一种增强骨移植物中的细胞存活的方法，包括使骨移植物经历Wnt多肽的活体外处理。在另一个方面，本发明涉及一种增强骨移植物的成骨潜能的方法，包括使骨移植物经历有效剂量的Wnt多肽(包括，但不限于Wnt3A)的活体外处理。在进一步的方面，本发明涉及一种复活(revitalizing)来自具有降低的治愈潜能的受试者的骨移植物的方法，包括使骨移植物经历Wnt多肽的活体外处理。在所有方面中，骨移植物可以是自体移植物或同种异体移植物。在所有方面中，骨移植物可以包含干细胞群体，例如，举例来说，骨髓来源的干细胞群体，例如骨髓来源的间充质干细胞。
[0011 ] 骨移植物优选来自人类受试者。在一个实施方式中，人类受试者是老年患者。在某些实施方式中，人类受试者至少50岁，至少55岁，至少60岁或至少65岁或至少70岁或至少75岁或至少80岁或至少85岁。在另一实施方式中，人类受试者具有降低的治愈潜能，例如，是吸烟者、糖尿病患者或特征在于营养缺陷的人。
[0012]在所有方面和实施方式中，Wnt多肽优选为Wnt3a，更优选人Wnt3a，最优选脂质体人Wnt3a(L-Wnt3a)。在进一步的方面，本发明的方法进一步包括将骨移植物引入接受者如人类患者中的步骤。在各种实施方式中，骨移植物可以用于支持牙种植体、修复骨折。在另一实施方式中，骨移植物用于修复或重建病变的骨骼。在再另一实施方式中，骨移植物用于接受者的髋部、膝部或脊柱中。
【附图说明】
[0013]图1A-1J.骨移植物具有成骨潜能。图1-A.从转基因β肌动蛋白-增强绿色荧光蛋白(β -肌动蛋白-eGFP)雄性小鼠收获的全骨髓的代表性等份样品中总DNA的定量；各等份样品构成骨移植物。图1-B.骨移植物移植到2-_直径的临界尺寸(critical-size)颅盖缺陷(用圆圈界定)中，其在分隔顶骨的矢状缝中形成(用垂直白色虚线描绘轮廓)。黑色虚线表示组织切片的平面。图1-C.移植后第1天来自损伤位点的代表性组织切片；GFP免疫染色鉴别来自eGFP供体(η = 5)的移植细胞；下部空间代表矢状窦。图1_D.移植后第5天的代表性组织切片；溴脱氧尿苷(BrdU)的免疫染色鉴别S期的细胞。图1-E.移植后第7天，GFP免疫染色鉴别骨移植物(黄色点线)；图1-E中方框区域的更高放大倍数图象(图1-F)显示损伤位点的大部分细胞源自GFP-阳性移植物。图1-G.移植后第14天，微-CT重建确认2-_颅盖损伤构成临界尺寸的非愈合缺陷(η = 6)40。图1-Η.用骨移植物处理的相同尺寸颅盖损伤愈合(η = 6)。图1-1和1-J.移植后第7天，苯胺蓝染色用于鉴别新的骨样基质；没有骨样基质在未处理的损伤位点中形成(黄色点线)。图ι-J显示用骨移植物处理的代表性样品中移植后第7天的可见骨样基质。缩写:IHC =免疫组织化学。箭头标明完整骨骼的边缘。标尺:2mm (图1-B) ；200 ym(图1-C和1-D) ;100μπι(图1-Ε)；40 μπι(图 1-F) ；2mm(图 1-G)和 200 μm(图 1-1 和 1-J)。
[0014]图2A-21.来自老年动物的骨移植物中成骨潜能降低。在移植后第7天(d7)，苯胺蓝染色表明通过来自年轻供体(图2-A)与老年供体(图2-B)的骨移植物产生的骨样基质。图2-C.由年轻和老年骨移植物形成的新骨量的组织形态测定分析。图2-D.在移植后第7天(d7)，绿色荧光蛋白(GFP)免疫染色鉴别在供体年轻时源自骨移植物的细胞，与老年供体(图2-E)相比。图2-F.当移植物从年轻供体(蓝色条，η = 13)收获时与老年供体(白色条，η = 13)相比损伤位点中的GFP-阳性(GFP+ve)细胞数。在移植后第5天(d5)，溴脱氧尿苷(BrdU)染色鉴别来自年轻供体(图2-G)和老年供体(图2-H)的骨移植物中的增殖细胞。图2-1.来自年轻和老年动物的骨移植物中增殖细胞核抗原(PCNA)的定量反转录聚合酶链式反应(qRTPCR)是等同的。单一星号表示p〈0.05。箭头标明完整骨骼的边缘。标尺:200 μπι(图2-A。[图2-Α中的标尺也应用于图2-B]、2-D[图2-D中的标尺也应用于图2-E]和2-G[图2-G中的标尺也应用于图2-H])。
[0015]图3.Wnt信号传导在老年骨移植物中减少。图3-A.评估从年轻供体(蓝色条，η = 3)和老年供体(白色条，η = 3)收获的骨髓(ΒΜ)中Wnt配体和Wnt靶基因(图3-B)相对表达水平的定量RT-PCR。基因表达水平相对于甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)归一化。星号表不p〈0.05。
[0016]图4.脂质体Wnt3a恢复老年骨移植物的成骨能力。图4_A.L-PBS处理的老年骨移植物(η = 5)的苯胺蓝染色。图4-B.L-Wnt3a处理的骨移植物(η = 8)中新的苯胺蓝阳性骨样基质。图4-C.在移植后第7和12天新骨基质的组织形态测定定量。图4-D.L-PBS和L-Wnt3a(图4-E)处理的骨移植物中移植后第12天(dl2)的苯胺蓝染色。图4-F.相对于如在来自收获的骨髓的细胞群体(未粘附的浮动细胞和粘附的细胞)中测量的总DNA归一化的β半乳糖苷酶(β -gal)活性。白色条(η = 4)代表L-PBS处理后的Wnt反应性；蓝色条(η = 4)代表L_Wnt3a处理(有效浓度0.15 μ g/mL Wnt3a)后的Wnt反应性。图4-G.源自骨髓的粘附细胞中干细胞标志物⑶45、⑶73、⑶105和Strol的免疫染色。图4-H.相对于L-PBS处理后(白色条，n = 4)或L_Wnt3a处理后(η = 4 ;有效浓度0.15 μ g/mL Wnt3a)粘附细胞群体中的总DNA归一化的β半乳糖苷酶(β-gal)活性。图4-1.代表性组织切片上的Xgal染色鉴别来自老年Αχ?η2^ζ/+小鼠的L-PBS处理的骨移植物中的Wnt反应性细胞，与L-Wnt3a处理(图4-J)相比较。图4-K.代表性组织切片上的Xgal染色鉴别来自年轻Axin2taeZ/+小鼠的L-PBS处理骨移植物中的Wnt反应性细胞。单一星号代表 ρ〈0.05 ;四星号代表 ρ〈0.0001ο 缩写:L-PBS =脂质体 PBS ；L-ffnt3a =脂质体 Wnt3a ；BM=骨髓jPDAPI = 4’，6-二脒基-2-苯基吲哚，二氢氯化物。箭头标明完整骨骼的边缘。标尺:100mm (图4-A [图4-A中的标尺也应用于图4-B]) ；200mm (图4-D [图4-D中的标尺也应用于图4-E]) ； 100mm(图4-G)和40mm(图4-1，[图4-1中的标尺也应用于图4-J和4-K])。
[0017]图5.L_Wnt3a处理恢复来自老年动物的骨移植物的成骨潜能。来自老年兔供体的骨髓，测定与细胞凋亡相关的DNA断裂。图5-A.末端脱氧核苷酰转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)染色(η = 4)证明L-PBS(lOmL)处理的老年骨髓中的凋亡程度，与L_Wnt3a处理(图5-B)(有效浓度=0.15 μ g/mL Wnt3a)相比。图5_C.L-PBS处理(白色条)或L-Wnt3a处理(蓝色条)的老年骨移植物样品中半胱天冬酶活性的测量。图5-D至5-G.骨髓从老年兔收获，用L-PBS或L-Wnt3a孵育最多lh，然后移植到尺骨中形成的临界尺寸缺陷中。图5-D.骨移植后四周时的放射影像学评估。将L-PBS处理与L-Wnt3a处理(图5-E)相比较。图5-F.骨移植后八周时的微-CT等值面重建(iso-surface reconstruct1n)。将L-PBS处理与L-Wnt3a处理(图5-G)相比交。图5-H.骨体积(BV)和骨体积/总体积(BV/TV)使用GE MicroView软件中的骨分析工具计算。单一星号表示p〈0.05。缩写:L_PBS=脂质体PBS和L-Wnt3a =脂质体Wnt3a。箭头标明完整骨骼的边缘。标尺:40mm(图5-A和 5-B)及 5mm (图 5-F 和 5-G)。
[0018]图6.源自L_Wnt3a处理老年骨移植物的再生骨的组织学外观。用在L_PBS(图6-A)或L-Wnt3a(图6-B)中孵育的老年骨髓处理的损伤位点(加框区域)的苯胺蓝染色。图6-C.老年主体脂肪骨髓腔及接受L-PBS处理的老年骨移植物的邻近