自体移植物与单独自体移植物相比显示优越的骨形成能力。因此，L-WNT3A中的简短孵育可靠地提高自体骨移植功效，这在老年人中具有显著改善患者保健的潜力。
[0094]对于骨不连接、延迟的连接和颈后脊柱融合的最常见治疗是自体骨移植或自体移植。自体移植物在绝大多数病例中是成功的，但其骨形成(成骨)能力的基础不是完全清楚的。自体移植物是骨髓血液产物、结缔组织基质、骨质细胞外基质及多种造血、血管和成骨干细胞群体的异质集合，且它们多样性地描述为骨诱导性的、骨传导性的和成骨的。但是，这些术语仅描述细胞过程；它们不提供对于自体移植物成骨潜能的深入认识。
[0095]自体移植物在老年患者中变成为不可靠的，且对于这种退化状态可能存在多种贡献因子。一些数据表明自体移植物的成骨能力依赖于骨移植物材料内包含的干细胞或祖细胞的存在，且干细胞数目被认为随年龄下降，这部分地是因为最终导致细胞周期停滞和细胞凋亡的累积的DNA损伤。其它数据论证了，并非干细胞数目的下降，而是它们的功能随年龄退化。老年干细胞也可能在其环境中对生长因子刺激具有较低反应性；类似地，这些生长因子刺激的局部或系统水平可能在老年人中下降。老化也影响干细胞的有丝分裂能力:干细胞衰老随年龄增加，部分地是因为端粒酶活性的降低和随后的端粒缩短。干细胞功能的这些降低制约了如肠和肌肉的组织的通常稳定的再生性反应。老化也影响干细胞的有丝分裂能力。类似的机制可能造成自体移植物成骨能力的损失。
[0096]此处，我们测试了以下假设:自体移植物的成骨潜能可归因于移植物材料中的成骨干细胞，老化影响这些干细胞/祖细胞群体的Wnt反应性状态，及WNT-介导的干细胞激活可恢复来自老年动物的自体移植物的骨形成潜能。
[0097]方法
[0098]动物护理。所有程序按照Stanford动物研究委员会批准的方案。使用β -肌动蛋白增强的绿色焚光蛋白(ACTB-eGFP ;The Jackson Laboratory, Sacramento, California)和CD1野生型同系小鼠。〈3个月龄的小鼠被认为是年轻的；>10个月的小鼠被认为是老年的。Axin2&eERT/+;R26RmTmG/+小鼠购自Jackson Labs。老年的野生型Lewis大鼠(来自Charles Rivers, MA 的“退出育种动物(retired breeders)”)用于按照 AAUC 和 IUPAC 指南(方案13146)的脊柱融合手术。
[0099]用于啮齿动物模型的骨移植物材料(BGM)的收集和处理。大鼠和小鼠用于这一研究中。小鼠模型的使用允许广谱的分子分析，但是因为自体移植物对于这些小动物是高度侵入性的，我们在进行自体移植时使用大鼠(例如，图7和12)，和在采用先进分子技术时使用同系小鼠(图8-11)。在所有情况中，骨移植物材料(BGM)通过纵向切开骨骼从股骨、胫骨和髂嵴，用尖锐器具轻缓地刮取骨内膜表面和冲洗骨髓内容物到收集盘中而收获。这一方法模拟用于人中的RIA技术。
[0100]为诱导Axin2&eERT/+;R26R mW+小鼠中的重组(图8)，动物连续5天通过IP注射或管饲给予160 μ g/g体重的它莫昔芬。组织在首次处理后7天收获并通过GFP免疫染色或荧光进行分析。
[0101]为确保用于移植到SRC中的BGM等份样品在细胞容量方面是等同的，来自3只小鼠(同窝)的BGM合并和然后正如在移植分析中一样分成20yL等份样品。DNA内容物用 DNeasy Tissue Kit (QIAGEN)提取且相对 DNA 浓度使用 Quant-1T PicoGreen dsDNAKit (Invitrogen)和微平板焚光阅读仪(BERTHOLD, Bad ffildbad, Germany)测量。DNA 含量的百分变化是〈20%。为获得BGMact，新收获的BGM置于包含磷酸盐缓冲盐水的脂质体制剂(L-PBS)或 WNT3A 的脂质体制剂(L-WNT3A，有效 L-WNT3A 浓度=0.15 μ g/mL)的 20 μ L 培养基中并保持在23°C下1小时。
[0102]定量反转录-聚合酶链式反应(qRT-PCR)。组织样品在TRIzol溶液(Invitrogen)中匀浆。如之前描述的分离RNA (RNeasy ；Mini Kit ；QIAGEN, MD, USA)并进行反转录(SuperScript III First-Strand Synthesis Supermix for qRT-PCR, Invitrogen)。定量实时 PCR 使用 Prism 7900HT Sequence Detect1n System (Applied B1systems, FosterCity, CA, USA)和 Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied B1systems)进行。基因表达的水平通过CT方法测定并针对其GAPDH值归一化。所有反应一式三份进行，计算平均值和标准差。引物序列(5，-3’ )如下:Axin2, [for-TCATTTTCCGAGAACCCACCGC], [rev-GCTCCAGTTTCAGTTTCTCCAGCC] ；Lefl, [for-AGGAGCCCAAAAGACCTCAT], [rev-CGTGCACTCAGCTATGACAT] ；GAPDH, [for-ACCCAGAAGACTGTGGATGG], [rev-GGATGCAGGGATGATGTTCT] ；ALP[for-ACCTTGACTGTGGTTACTGC], [rev-CATATAGGATGGCCGTGAAGG] ；0sterix, [for-GGAGACCTTGCTCGTAGATTTC], [rev-GGGATCTTAGTGACTGCCTAAC];骨钙蛋白，[for-TGTGACGAGCTATCAAACCAG]，[rev-GAGGATCAAGTTCTGGAGAGC]。
[0103]蛋白质印迹分析。BGM从年轻(N = 5)和老年(N = 5)小鼠收获且然后置于包含 10%胎牛血清(FBS)、100U/mL 青霉素和 100 μ g/mL 链霉素的 Dulbecco’s ModifiedEagle Medium (DMEM)中，并在37 °C下在5% 0)2中孵育。24小时后，除去非粘附细胞，更换培养基，并传代粘附细胞它们达到汇合。培养基每3天更换。在一些试验中，第3代后的细胞用L-PBS或L-WNT3A(有效浓度=0.03 μ g/mL)处理。在这些试验中，细胞在24小时后收集并使用RIPA缓冲液(Sigma-Aldrich, St.Louis, M0, USA)裂解。提取总蛋白质用于蛋白质印迹分析。泛-肌动蛋白用作内部对照并用于确保蛋白质完整性。使用抗WNT3A (R&D, Minneapolis, MN, USA)、非磷酸化β -连环蛋白(CellSignaling, Danvers, MA, USA)和 Axin2 (Abeam, Cambridge, MA, USA)的抗体。积分强度通过Image J (Nat1nal institute of Health, USA vers1n 1.47v)进行分析以定量蛋白质印迹结果。
[0104]肾包膜下(Sub-renal capsule)移植手术。在一些情况中，肾包膜下分析(SRCA)用于测定其分化潜能。在同系宿主小鼠吸入麻醉后，在紧接肋架尾侧的左侧腹形成皮肤切口。打开腹腔以暴露肾。在肾包膜中形成小切口且BGM使用软塑料管小心地置于包膜下。然后将肾返回到腹腔，且腹膜和皮肤用缝线封闭。丁丙诺啡(0.05mg/kg)用于镇痛。在其中BGM从Axin2&sERT2;R26 mTm(:供体收获的情况中，随后在第0天开始通过管饲对宿主提供它莫昔芬(100 μ L的10mg/mL)共5天。SRC移植物在所示的时间点收获。2.6腺病毒-介导的Wnt信号传导抑制DKK1和阴性对照Fc腺病毒构建体之前已描述。腺病毒构建体转染到293T细胞中。2天后，收集细胞、裂解和通过离心沉淀。纯化的腺病毒等分并储存在_80°C下。Wnt抑制通过用Ad-Dkkl和对照Ad-Fc体外孵育BGM 2小时实现，且BGM等份样品然后移植到颅盖缺陷中。
[0105]烦盖临界尺寸缺陷手术。小鼠被麻醉，且形成3-mm切口以暴露顶骨。2_mm直径的圆形全厚度缺陷使用微解剖环锯形成，不干扰硬脑膜。BGM等份样品用Ad-Dkkl和对照Ad-Fc孵育2小时。BGM等份样品然后移植到颅盖缺陷中且皮肤用缝线封闭。在从手术恢复后，小鼠接受丁丙诺啡用于镇痛。微-计算机断层扫描(微-CT)分析如之前所述进行。
[0106]脊柱融合手术。Lewis大鼠使用氯胺酮70_100mg/kg和甲苯噻嘆5-lOmg/kg的混合物进行麻醉。大鼠的腰部剃毛，然后用碘伏(Betadine)浸泡的纱布消毒。在皮肤切开前，大鼠注射镇痛剂丁丙诺啡0.02mg/kg SC/IPo首先，骨移植物材料(BGM)从髂嵴收获；简言之，触摸左髂骨棘(iliac spine)并形成垂直皮肤切口 ；髂骨棘的背侧嵴可达并通过钝器解剖暴露。附着的肌肉和骨膜被提升且0.3g的BGM用骨钳收获和颗粒化(morselized)。BGM然后用100 μ L L-PBS或100 μ L的[0.15 μ g/mL]L-ffNT3A孵育，同时暴露横突。为暴露横突，完成后外侧钝器解剖，且反映的脊椎旁肌肉通过牵开器保持定位。L4-L5的横突被清除骨膜，并用高速圆头锉(high-speed burr)去壳。BGM展开在L4-L5横突上及其之间。脊椎旁肌肉用可吸收的缝线(4-OVicryl)封闭，且皮肤用中断的不可吸收的缝线(4_0Nylon)封闭。手术部位用抗生素软膏处理。10mg/kg Baytril皮下递送。丁丙诺啡(0.02mg/kg)在手术后施用3天，且后续剂量按照需要给予以控制疼痛。
[0107]样品制备、组织加工、组织学。组织在4°C下在4%多聚甲醛(PFA)中固定过夜。样品在19%EDTA中脱钙1天。样本在石蜡包埋之前通过升高的乙醇系列脱水。切割8微米厚的纵向切片并收集在Superfrost-plus载玻片上用于组织学分析。番红0、苯胺蓝和Gomori染色如之前所述进行。组织切片使用Leica DM5000B数字成像系统(LeicaMicro-systems, ffetzlar, Germany)拍照。
[0108]ALP、TRAP和TUNEL染色。碱性磷酸酶(ALP)活性通过在氯化氮蓝四唑(NBT ；Roche, Indianapolis, IN, USA)、5_ 溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯(BCIP ；Roche)和 NTM 缓冲液(lOOmM NaCl, 100mM Tris pH 9.5, 5mM MgCl)中孵育进行检测。耐酒石酸盐酸性磷酸酶(TRAP)活性使用白细胞酸性磷酸酶染色试剂盒(Sigma, St.Louis, M0，USA)按照制造商的说明来观察。在显色后，载玻片在系列乙醇中脱水，在Citrisolv(Fisher Scientific)中清洁，并用Permount封片介质(Fisher Scientific)盖片。对于TUNEL染色，切片使用0.1 % Triton X-100 (Sigma)和0.1 %柠檬酸钠(sigma)渗透，并用TUNEL反应混合物(In Situ Cell Death Detect1n Kit, Roche)孵育。切片用 DAPI 封片介质(VectorLabs, Burlingame, CA, USA)封片，并在落射焚光显微镜下目测检验。对于溴脱氧尿苷(BrdU)分析，小鼠腹膜内注射给予BrdU标记试剂(Invitrogen, CA, USA)并在注射后4小时处死。BrdU检测使用BrdU染色试剂盒(Invitrogen, CA, USA)按照制造商的说明进行。
[0109]免疫组织化学。组织切片脱蜡和在PBS中复水。内源过氧化物酶活性通过3%过氧化氢淬灭5min，和然后在PBS中洗涤。载玻片在室温下用5 %山羊血清(Vectorlaboratories)封闭1小时。添加适宜的一级抗体并在4°C下孵育过夜。样品然后用适宜的生物素化二级抗体(Vector Laboratories)和抗生物素蛋白/生物素化酶复合物(VectorLaboratories)孵育并通过DAB底物试剂盒(Vector Laboratories)显色。使用的抗体包括 GFP(Cell Signaling)和 DLK1 (Millipore)、Runx2 (Santa Cruz)、Sox9 (Abeam)和PPAR-γ (Cell Signaling)。
[0110]微-CT分析和移植物生长的定量。扫描和分析遵循公布的指南。小鼠用2%异氟烷麻醉并用多模正电子发射断层扫描-计算机断层扫描数据采集系统(Inveon PET-CT ；Siemens, Erlangen, Germany)以 40-mm 分辨率进行扫描。为定义各样品中发生的移植物生长，P0D2和P0D49时间点扫描数据输出到Osirix软件版本5.8 (Pixmeo, Bernex, Switzerland)中并登记用于沿相同的定向分段。形成的新骨与移植的初始BGM体积进行比较。数据集之间的差异通过使用XLStat软件版本(Addinsoft, Paris, France)中的Mann-Whitney检验确定。p-值〈0.05被认为是统计学显著的。
[0111]定量和统计分析。GFP、BrdU、TUNEL、DLK1、骨钙蛋白和苯胺蓝染色进行定量。Photoshop CS5 (Adobe,版本10.0.1)用于确定损伤位点处目标区域(R0I)中的像素数目。魔术棒工具用于指定R0I内的阳性像素区域。阳性信号的像素与R0I的像素的比率表示为百分比。跨损伤位点的至少5均匀间隔的个切片进行定量以确定各样品的平均值。五个样品包括在各组中(η = 5)。结果表示为平均值土SD。Student’s t_检验用于定量该文献中描述的差异。0.05被认为是显著的。
[0112]结果
[0113]骨移植物材料包含多种干细胞/祖细胞群体。用于收获自体移植物的最佳解剖位点取决于多种因素，包括供体位点发病率和骨原料的可得性。我们使用改良的扩髓-灌注-抽吸(RIA)技术从三个解剖位点收获BGM并注意到股骨、髂嵴和胫骨产生具有明显不同组织学外观的BGM。除了造血细胞外，股骨BGM包含脂肪细胞，即使在从年轻动物收获时(图7A)。髂嵴BGM主要由紧密粘附细胞中覆盖的松质骨片段组成(图7B)。来自胫骨的BGM包含相当量的纤维基质和小的无核细胞(图7C)。我们使用定量RT-PCR来评估内源成骨基因表达，并发现在三种来源中，髂嵴BGM以显著更高的水平表达碱性磷酸酶和骨钙蛋白(图7D)。一般地，广泛相信的是自体移植物的生骨性能可归因于骨移植物材料(BGM)内的干细胞/祖细胞群体和成骨细胞。我们通过移植BGM到肾包膜下(SRC)分析中直接测试这一假设。SRC向移植的组织提供血管供应并支持细胞分化成多种组织，包括骨、