Indianapolis, Indiana)测定。
[0065]组织制备。紧接在处死后(各试验中指定的时间点)，收获整个骨骼成分(包括肌肉、结缔组织和/或硬脑膜)，除去其表皮，并在4°C下4%多聚甲醛中固定12小时。样品在19%EDTA(乙二胺四乙酸)中脱钙，然后包埋在石蜡中或在最佳切割温度(0CT)化合物中。切片为10-μηι厚。
[0066]组织学、免疫组织化学和组织形态测定分析。免疫组织化学如之前所述进行。使用的抗体包括兔多克隆抗-绿色焚光蛋白(抗_GFP)(Cell Signaling Technology, Danvers,Massachusetts)、兔多克隆抗-DLK1 (EMD Millipore, Billerica, Massachusetts)、抗-过氧物酶体增殖物激活受体-y (抗-PPAR- γ ) (Millipore)和抗 _Ki67 (ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts)。按照制造商的说明进行溴脱氧尿苷(BrdU) (Invitrogen, Camarillo, California)和末端脱氧核苷酰转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL) (RocheDiagnostics)分析。
[0067]如之前所述进行Movat五色(pentachrome)、苯胺蓝、Xgal和碱性磷酸酶(ALP)染色。组织切片使用 Leica DM5000B 数字成像系统(Leica Microsystems, ffetzlar, Germany)拍照。最少每个样品五个组织切片用于组织形态测定分析。
[0068]微定量计算机断层扫描(微-CT)分析。小鼠用2 %异氟烷麻醉并用多模正电子发射断层扫描-计算机断层扫描数据采集系统(Irweon PET-CT ;Siemens, Erlangen, Germany)以 40-mm 分辨率进行扫描。数据用 MicroView 软件(GEHealthcare, Chicago, Illinois)分析。三维目标区域工具用于对各样品的结构和骨体积赋值。
[0069]再生骨体积分数(通过用总骨体积去除再生骨体积计算的百分比[BV/TV，％ ])的评估使用高分辨率微 _CT (vivaCT 40 ；Scanco Medical, Br " uttisellen, Switzerland)和采用70kVp，55 μ A, 200-ms积分时间和10.5-μπι各向同性体素尺寸进行。目标区域为2cm长并在缺陷边缘近端250 μπι开始和向远端延伸超出缺陷的相对边缘250 μηι(1.5cm总直径)。骨使用275mg/cm3羟磷灰石的阈值与软组织分割。扫描和分析遵循公布的指南进行。
[0070]定量反转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)。组织样品在TRIzol溶液(LifeTechnologies)中勾楽。如之前描述的分离 RNA (RNeasy ；Qiagen, Germantown, Maryland)并进行反车专录(SuperScript III Platinum Two-Step qRT-PCR Kit, Life Technologies)。
[0071]统计分析。结果作为平均值+标准差显示，“η”表示分析的样品的数目。数据集之间的显著差异使用双侧Student t检验和非参数Wilcoxon检验确定。显著性以p〈0.05达至丨J，且所有统计分析用GraphPad Prism软件(GraphPad Software, San Diego, California)进行。
[0072]结果
[0073]骨髓移植物具有成骨潜能。为追踪骨移植物材料的命运，我们从ACTB-eGFP转基因小鼠收获全骨髓，将其细分成等同大小的等份样品(图1-A)，然后移植到在同系宿主小鼠的颅盖中形成的未愈合的临界尺寸骨骼缺陷中(图l-Β)。存活的移植细胞及其后代可通过其GFP标记在损伤位点内鉴别(图1-C)。当供体和宿主遗传上不相同时，大多数的移植细胞死亡；出于这一原因，仅使用同系的免疫相容的供体-宿主组合。
[0074]在移植后第1天，GFP-阳性细胞以及来自GFP-阳性供体的基质组织占据损伤位点(图1-C)。在第5天，BrdU染色确认缺陷位点中稳定的细胞增殖(图1-D)。在第7天，GFP免疫染色确认移植的细胞或其后代保留在缺陷位点(图1-E和1-F)。移植的细胞和/或其后代最终分化成成骨细胞并使缺陷愈合(图l-Η和1-J);在不存在骨移植物的情况下，缺陷不愈合(图1_G和1-1)。
[0075]老年骨移植物表现出脂肪变性。随着老化，人骨髓发生脂肪变性和成骨潜能的损失。相当的年龄相关性变化在小鼠中观察到，其中鼠骨髓的总体外观从年轻动物中的富含血红素的无脂肪组织变化为老年动物中的脂肪骨髓。构成骨移植物的异质细胞群体的定量RT-PCR分析表明，相对于来自年轻动物的样品，来自老年动物的样品显示显著更高的生脂基因脂肪酸结合蛋白4(Fabp4)的表达(p〈0.01)和过氧物酶体增殖物激活受体γ (PPAR-γ)的表达(ρ〈0.01)。与这种成脂偏移同时，来自老年小鼠的骨移植物也显示出显著降低的成骨基因ALP(p〈0.05)、骨钙蛋白(p〈0.01)和osterix(p〈0.05)的表达水平。因此，在人中观察到的骨髓的脂肪变性在小鼠中在总体形态学水平和在可量化的分子水平上重演。
[0076]脂肪变性与骨移植物中降低的成骨潜能相关。与来自年轻动物的移植物的成骨能力相比，来自老年动物的移植物生成显著更少的新骨(图2-A和2-B ;在2-C中量化；p〈0.05)。成骨潜能的这种年龄相关性降低不可直接归因于移植物移入效率的差异。使用GFP免疫染色鉴别移植的细胞，GFP-阳性细胞的分布和数目在来自年轻和老年小鼠的骨移植物之间几乎是等同的(图2-D和2-E ;在图2-F中量化)。成骨潜能的年龄相关性改变也不可归因于移植物扩增的差异:使用BrdU掺入(图2-G和2-H)和增殖细胞核抗原(PCNA)的qRT-PCR (图2-1)，我们发现来自年轻和老年动物的骨移植物几乎等同的细胞增殖水平。
[0077]当我们评估骨髓细胞中19种哺乳动物Wnt基因的表达水平时，我们获得了对于老年骨移植物的脂肪变性和成骨潜能损失的基础的深入认识。Wnt基因的子集在来自老年动物的骨髓中与年轻动物相比弱表达(P〈0.05 ;图3-A)。Wnt基因表达的这种降低与Wnt反应性的降低平行，如通过显著降低的Wnt直接靶基因Tcf4、Lefl和Axin2的表达(p〈0.05 ；图3-B)测量的。这些结果证明Wnt信号传导在老年骨髓中降低。
[0078]L_Wnt3a恢复来自老年小鼠的骨移植物的成骨能力。待纯化的第一种Wnt蛋白是Wnt3a。Wnt3a通过“标准”或β -连环蛋白依赖性途径发挥作用并且是公知的成骨刺激。考虑到老年骨髓中降低的Wnt信号传导，我们想知道外源Wnt蛋白的添加是否足以重建源自老年动物的骨移植物的成骨潜能。
[0079]所有脊椎动物Wnt蛋白是疏水性的；在没有载体的情况下，疏水性Wnt3a快速变性并变成非活性的。我们通过将疏水性Wnt3a包裹在脂质颗粒中解决了这一体内递送问题。人Wnt3a蛋白的这种制剂，脂质体Wnt3a(L-Wnt3a)，在体内是稳定的并在改良的骨折模型中促进稳定的骨再生。虽然外源施加的Wnt3a作为治疗性蛋白质具有大的潜能，但安全性仍然是首要的考虑因素。将高浓度的高效生长因子递送到骨骼损伤位点随之对于患者带来潜在的肿瘤学风险。为回避与延长的或非受控的生长因子暴露相关的问题，我们在活体外递送L-Wnt3a。这通过在收获后立即用L_Wnt3a(n = 30)孵育老年骨移植物来完成，同时准备接受位点。对照骨移植物暴露于L-PBS(n = 30)相同的持续时间。
[0080]与用L-PBS处理的老年移植物(图4-A)相比，用L_Wnt3a处理的老年移植物显示出新骨形成的急剧增加(图4-B)。在7天内，接受L-Wnt3a处理的移植物的缺陷位点与接受L-PBS处理的移植物的位点相比具有两倍多的新骨(图4-C)。到第12天，L-ffnt3a-处理的移植物与L-PBS处理的移植物相比具有1.5-倍多的新骨(图4-D和4-E ;在4-C中量化)。
[0081 ] 骨髓来源的干细胞是Wnt反应性的。为获得骨移植物中的哪些细胞群体对Wnt刺激有反应的深入了解，我们分析骨髓不同部分的Wnt反应性。在全骨髓中，Wnt反应性低于可检测水平。我们将全骨髓分离成非粘附群体；Wnt反应性再一次低于检测限(图4-F)。但是在包含结缔组织祖细胞53，54的粘附群体中，检测Wnt反应性(图4-F)。我们然后使用建立的方案进一步富集来自粘附群体的骨髓干细胞和/或基质细胞。使用CD45(-)、CD73(+)、CD105(+)和Strol (+)的免疫染色，我们确认这一群体是骨髓干细胞富集的(图
4-G)。相对于 PBS 处理的 CD45 ( - )、CD73 (+)、CD105 (+)和 Strol (+)细胞，Wnt3a_ 处理的群体显示出Wnt反应性10倍的提高(图4-H)。
[0082]我们还使用来自Αχ?η2^ζ/+小鼠的骨髓的Xgal染色来监测骨移植物中的Wnt反应性。非常少的Xgal+?细胞在老年骨移植物中发现(图4-1)，但Xgal细胞在年轻骨移植物中是丰富的(图4-K)。老年骨移植物能够对L-Wnt3a刺激作出反应，如通过暴露后Xgal+?细胞的增加所显示的(图4-J)。因为鼠骨髓腔中干细胞的存在率是非常低的，很可能Wnt反应性群体包括⑶45 (-)、⑶73 (+)、⑶105 (+)和Strol (+)群体以外的更多细胞。
[0083]L-ffnt3a防止骨移植物中的细胞凋亡。L_Wnt3a的稳定骨诱导能力提示我们将我们的研究扩展到大动物的长骨模型中。如在人中，老年兔发生其骨髓的脂肪变性。我们利用临界尺寸尺骨缺陷模型并将用L-PBS或L-Wnt3a孵育的老年骨移植物移植到缺陷中。我们首先注意到，在收获骨移植物时，在整个聚集体(aggregate)中存在广泛的程序性细胞死亡(图5-A)。加入L-Wnt3a显著减少这种移植物细胞凋亡(p〈0.05)(图5-B)。我们使用半胱天冬酶活性作为细胞凋亡的量度验证了 L-Wnt3a的这种促存活效应。L_Wnt3a显著降低骨移植物的细胞中的半胱天冬酶活性(p〈0.05 ;图5-C)。
[0084]L_Wnt3a赋予老年骨移植物成骨能力。L_Wnt3a和L-PBS处理的兔骨移植物引入临界尺寸缺陷中并在多个时间点评估再生。在四周时的放射影像学评估揭示了接受L-Wnt3a处理的移植物的位点中桥接愈伤组织(bridging callus)的存在(图5_E);比较而言，接受L-PBS处理的骨移植物的位点显示最小的愈伤组织形成(图5-D)。
[0085]在八周时，微-CT分析显示了用L-PBS骨移植物处理的位点中的持续间隙(图
5-F)，而用L-Wnt3a骨移植物处理的位点显示稳定的骨形成(图5-G)。组织形态测定分析确认两个组之间在骨体积和骨体积除以总体积(图5-H)两个方面中的显著差异。
[0086]我们评估了骨再生的质量。与对照(图6-A)相比，L_Wnt3a处理的损伤位点充满新骨(图6-B)。宿主兔的骨髓已发生脂肪变性(图6-C)，且在L-PBS处理的再生中注意到类似的外观(图6-D)。在L-Wnt3a处理的样品中(图6-E)，宿主骨髓显示出如在对照动物中看到的相似的脂肪变性水平，但L-Wnt3a骨移植物的再生是编织骨(图6-F)且可与预先存在的板层骨通过其在片段缺陷位点中的位置和其编织外观区分开来。在偏振光下，天狼猩红染色区分L-Wnt3a处理的骨移植物中发现的成熟的类骨组织(图6-H)与L-PBS处理的骨移植物的纤维性组织(图6-G)。
[0087]骨移植物中的干细胞和/或祖细胞群体。哺乳动物骨髓腔是支持多种干细胞和/或祖细胞群体的功能性小生镜。骨髓来源的骨移植物(其性质上是异质的)包含多种群体，包括一些干细胞和/或祖细胞。但是，这些干细胞和/或祖细胞对于骨再生的贡献仍然是未知的。多种骨髓来源的干细胞群体是Wnt-反应性的，且我们使用已建立的方案确认骨髓中的至少⑶45 (-)、⑶73 (+)、⑶105 (+)和Strol (+)干细胞和/或基质细胞群体是Wnt-反应性的(图4)。
[0088]Wnt信号传导和骨髓的年龄相关性脂肪变性。在体外，Wnt信号传导的消除引起间充质干细胞分化成脂肪细胞，而Wnt信号传导的强化引起间充质干细胞分化成成骨细胞。这具有直接的临床相关性:随着年龄增长，人骨髓发生脂肪变性并丧失其成骨潜能。我们的数据显示，老年骨移植物的成骨潜能的这种损失部分地依赖于降低的Wnt信号传导水平:与来自年轻小鼠的骨移植物相比，老年骨移植物显示Wnt基因表达和Wnt反应性的急剧降低(图3)。添加L-Wnt3a到老年骨髓重建其骨形成能力(图4、5和6)。
[0089]与降低的移动性(如长期卧床和骨质疏松症)相关的状况也与骨髓的脂肪变性相关。一些数据表明脂肪变性是可逆的，至少在试验上是如此。显然地，了解这种变性的基础-及骨骼中的年龄相关性改变可以降低的程度-在设计老年患者中骨损伤的新治疗方面是相当重要的。
[0090]生长因子加强的骨再生:安全性第一。安全性的关注当前在围绕使用生长因子加强骨骼愈合方面增加。生长因子刺激主要认为诱导驻留于损伤位点中的细胞的增殖；因为不受控的增殖是致癌转化的特征，这种增殖爆发必须在空间和时间上受到控制。出于这一原因，我们设计了限制L-Wnt3a的整个身体暴露的方式。被靶向的细胞是骨移植物本身(其在活体外用L-Wnt3a孵育)中的那些细胞。然后激活的细胞一而非生长因子本身一重新引入到缺陷位点中。这一活体外途径从空间上(限制到移植物本身，而非宿主组织)和从时间上(对Wnt刺激的暴露仅在孵育期间发生)限制L-Wnt3a刺激。这种活体外方式针对临床应用进行调整且不需要二次手术。因此，将Wnt蛋白包裹到脂质颗粒中构成了用于治疗骨骼损伤的可行策略，特别是在具有降低的治愈潜能的个体中的那些骨骼损伤。
[0091]实施例2
[0092]用干细胞激活剂WNT3A重建自体骨移植物
[0093]自体骨移植物是治疗骨缺陷的最常使用的程序，但被认为在老年患者中是不可靠的。自体移植物的功效可以追溯到存在于材料内的多能干细胞。老化减弱这些干细胞的存活力和功能，导致骨性愈合(bonu un1n)的不一致率。我们证明自体移植物功效的年龄相关性改变伴随材料中内源Wnt信号传导的损失。我们通过过表达Wnt抑制剂Dkkl模拟这种内源Wnt信号传导的损失并发现Wnt信号传导是自体移植物的成骨分化所必须的。我们开发了活体外药物递送系统，其中自体移植物在WNT3A蛋白的稳定制剂中孵育，且然后体内引入。生物工程化的自体移植物显示在接受位点中显著提高的存活。有丝分裂活性和成骨分化在WNT-激活的自体移植物中与单独自体移植物相比显著增强。在脊柱融合模型中，用L-WNT3A处理的老年