皮肤、肌肉、牙齿、器官和肿瘤。BGM从髂嵴收获，然后移植到动物的肾包膜下方(图7A)并允许在那里发育7天。BrdU掺入证明自体BGM中细胞的高有丝分裂活性(图7B)。Runx2 (图7C)、Sox9(图7D)和PPARy (图7E)的免疫染色证明BGM中的细胞亚集表达与成骨、软骨形成和成脂定型相关的基因标志物。在第7天，BGM-来源的细胞的亚群分化成骨(图7F)、软骨(图7G)和脂肪(图7H)。总的说来，这些数据证明BGM包含能够分化成所有三种谱系的干细胞/祖细胞。
[0114]骨移植物材料中的Wnt信号传导随年龄降低。Wnt是受到最多研究的诱导成骨分化的分子信号之一。使用AXin2&eERT2;R26mTmG报告小鼠，我们诱导重组(参见方法)，然后鉴别骨膜(图8A)和骨内膜(图8B)中的GFP+?前成骨细胞。骨内膜中GFP 细胞的频率是?0.1 % (图8C)。GFP+ve细胞也在新收获的BGM中鉴别(图8D)。因此，异质BGM中的细胞亚集是Wnt反应性的。我们比较了来自年轻(〈3月龄)和老年(>10月龄)小鼠的BGM的Wnt反应性状态。定量绝对RT-PCR证明Wnt靶基因Axin2和Lefl的表达在从老年小鼠中收获的BGM(BGM@)中相对于年轻小鼠(BGM@;图8F)几乎低两倍。蛋白质印迹分析确认，Wnt3a、磷酸化β连环蛋白和Axin2表达在BGM老年中与BGM^5相比全都显著较低(图8G)。因此，BGM的内源Wnt反应性状态随年龄退化。
[0115]成骨分化能力也随年龄下降。在人中，骨愈合率随年龄下降。我们发现BGM成骨能力相似的年龄相关性下降。新收获的示与新收获的比显著更低的成骨基因碱性磷酸酶、Osterix和骨钙蛋白的表达水平(图9A)。为测试成骨基因表达的降低是否影响BGM的成骨能力，我们回到SRC分析。但是，在小鼠中进行自体移植造成过度外伤。为模拟自体移植物，我们使用同系供体和宿主。因为同系动物如此紧密相关，它们的组织是免疫相容的且组织的移植不引起免疫反应。ACTB-eGFP小鼠用作供体且BGM可容易地在SRC中通过其GFP荧光鉴别(图9B、C)。
[0116]移植后七天，收获BGM并分析骨形成的证据。苯胺蓝染色的骨样基质在BGM_e (图9D)中是明显的，但在BGM—(图9E;在F中量化)中不存在。BGM@中的骨样基质如通过ALP染色显示的正发生矿化(图9G)，而BGM@未显示ALP染色(图9H ;在I中量化)。我们想知道是否间的移植物移入效率可以造成成骨分化的差异，但GFP免疫染色证明在BGM#5 (图9J)和(图9K)两者中，存在相似数目的存活供体细胞(在图9L中量化)。总的来说，这些数据表明BGM的成骨基因表达和成骨能力随年龄下降。
[0117]Wnt信号传导是BGM的成骨能力必须的。内源Wnt反应性及BGM的成骨能力随年龄减小。为测试是否降低的Wnt信号传导造成成骨潜能的这种年龄相关性下降，我们阻断BGM中的内源Wnt信号传导。其他人和我们已经使用Wnt抑制剂Dkkl的过表达以在体内瞬时消除Wnt信号传导。我们递送Ad-Dkkl或Ad-Fc (对照)到年轻小鼠的骨髓腔，然后在24h后收获BGM_e并移植等份样品到临界尺寸(未愈合)骨骼缺陷中。七天后，当对照BGM@对于ALP活性为强阳性时(图10A), Ad-Dkkl处理的BGM#5显示最低活性(图10B)。相反，Ad-Dkkl处理的BGM@显示成脂蛋白PPAR-γ (图10C、D)和Dlkl (图10E、F)的普遍表达。骨形成受到Ad-Dkkl处理的抑制，如通过BGM的微-CT(图10G、Η ;在I中量化)和组织形态测定分析(图10J、Κ ;在L中量化)显示的。因此，BGM的成骨能力依赖于内源Wnt信号。
[0118]增强BGM—中的内源Wnt信号恢复其成骨能力。内源Wnt信号传导是BGM显示其成骨能力所必须的(图10J-L)。我们接着测试是否Wnt刺激足以增强BGM功效。收获BGM*年，用L-WNT3A或脂质体PBS (L-PBS)处理，然后在37Γ下孵育(图11A)。绝对qRT-PCR分析揭示Axin2表达的小的但显著的提升(图11B)。Lefl响应于L-WNT3A适度地提升(图11B)。蛋白质印迹分析表明β连环蛋白和Axin2蛋白两者响应于L-WNT3A而升高(图11C)。BGM中的有丝分裂活性通过L-WNT3A处理提高。在移植后第4天，细胞增殖在L-WNT3A处理的BGM—中与LPBS-处理的BGM—相比显著提高(图11D、E ;在F中量化)。对于细胞周期的作用是瞬时的:到移植后第7天，BrdU掺入在L-PBS和L-WNT3A样品之间是等同的(图11G、Η ;在I中量化)。BGM—中的细胞分化提高。在脂蛋白Dlkl的表达较低(图11J、K ;在L中量化)且成骨蛋白骨钙蛋白的表达在L-WNT3A处理的BGM^^中较高(图11M、N;在0中量化)。新骨形成仅在L-WNT3A处理的中发现(图11P、Q ;在R中量化)。LWNT3A的处理不影响移植物移入效率，但程序性细胞死亡的分析证明L-WNT3A处理的BGM^^具有比L-PBS处理的样品显著更少的TUNEL+TC细胞。降低的细胞凋亡也在移植后第7天观察到。新骨形成用作破骨细胞介导的骨重建的刺激物，且我们仅在L-WNT3A处理的BGM^^样品中观察到新形成的骨样基质周围的TRAP活性。因此，我们得出结论，L-WNT3A足以增强BGM的成骨能力。
[0119]L-WNT3A激活BGM—中的干细胞并在脊柱融合模型中改善骨生成。我们试图鉴别BGM中负责L-WNT3A介导的成骨能力增强的细胞群体。我们使用标准程序从BGM分离三种干细胞群体，然后使用LPBS(作为对照)或L-WNT3A评估它们的Wnt反应性。在之前的试验中，我们确定了可靠地激活干细胞群体中的Axin2表达的L-WNT3A剂量。时程分析揭示干细胞对L-WNT3A处理的反应:在L-WNT3A暴露的15h内，观察到Axin2的4-倍激活，且最大Axin2激活在36h获得(图12A)。该效应是瞬时的，如通过60h时间点时干细胞中减少的Axin2表达显示的(图12A)。
[0120]我们使用从BGM分离的第二干细胞群体来验证干细胞对L-WNT3A的反应(图12B)。BGM的激活状态通过qRT-PCR显示。收获BGM—，用L-WNT3A或L-PBS处理，然后使用Axin2和Lefl表达分析其Wnt反应性状态(图12C)。在12h内，Lefl的显著提高是可检测的；在24h内，Axin2和Lefl两者显著升高(图12C)。这些分析确认BGM的WNT-介导的激活状态；下面我们将这一材料称为BGMact。我们的下一试验测试BGMact在大鼠脊柱融合模型中的治疗潜能。第四和第五腰椎(例如，L4-5)脊椎骨的横突被脱壳(图12D)，并在这一过程中，收获来自髂嵴的自体和用L-WNT3A(或L-PBS)处理lh。所得的材料BGMact(或BGM—)然后移植到L4-5突起上和其之间(图12E)。在手术后第2天，BGM的体积通过微-CT评估；这些分析证实(图12F)和BGMact(图12)在最初包含相当量的矿化组织。新骨形成的体积在手术后第49天再次评估。微-CT数据的三维重建证明在用BGM^^处理的位点中差的骨再生(灰色；图12G)，这与来自经历脊柱融合的老年患者的相似数据一致。相反，用BGMACT处理的位点显示出稳定的骨形成和横突的融合的证据(蓝色；图12H)。横突之间新骨的体积被量化；与BGM^^相比，BGMACT产生显著更多的矿化基质(图121)。因此，L-WNT3A处理改善来自老年动物的自体移植物的成骨能力。
[0121]在美国每年进行几乎五十万骨移植手术，使得自体移植物为第二最常见的移植组织(AATB Annual Survey)。自体移植物具有优于同种异体移植物和合成骨替代品的显著优势。但它们在老年人中和在具有基础骨或代谢疾病的患者中是禁忌的。此处，我们致力于理解对于自体移植物功效重要的因素和毒力于验证改善自体移植物功效的方法。四种主要的因素影响自体移植物的成骨能力:首先，自体移植物从其收获的位点；第二，自体移植物在收获后如何操作；第三，自体移植物的生长因子选项(constituency);和第四，自体移植物中干细胞的激活状态。此处，我们提供了 WNT信号可影响这四种关键变量中的三种的证据。
[0122]优化自体移植物收获和操作。成骨能力及因此自体移植物的功效受到收获位点和方法的影响。大多数非血管化的自体移植物从髂嵴收获，但采用扩髓/灌注/抽吸(RIA)方式，股骨和胫骨髓质腔也可以利用。通过RIA和常规收获方法收集的自体移植物的成骨能力是等同的。使用模拟的RIA方式，我们在从髂嵴、股骨和胫骨收获的BGM的细胞选项中观察到明显的不同。此外，髂嵴BGM与来自股骨或胫骨的BGM相比具有显著更高的合成代谢成骨基因表达水平(图7)。但是，所有这些BGM等份样品在肾包膜下(SRC)分析中表现出骨形成潜能(图7)。自体移植物的功效也可以在移植回到患者中之前受到对该材料的不适当操作的损害。例如，甚至在新收获的BGM保持在室温下时，存在显著的细胞凋亡。用L-WNT3A处理BGM显著提高细胞存活:例如，与单独BGM相比，BGMAe^现低?50%的TUNEL-阳性细胞。有丝分裂活性在BGMACT中相对于用L-PBS处理的BGM显著更高(图11D-F)。总的来说，这种细胞增殖的提高和伴随的细胞死亡的降低转化成提高的BGM生存力并因此提高自体移植物功效。
[0123]优化自体移植物中的生长因子活性。自体移植物功效也表现为依赖于材料中生长因子的存在。在新收获的自体移植物中，已经鉴定了多种多样的生长因子，包括转化生长因子β、骨形态发生蛋白、血管内皮生长因子和血小板源生长因子。但是，在脱矿的(demineralized)冷冻干燥同种异体移植物中，这些因子缺乏或以最小可测量量存在。据我们所知，还没有报告自体移植物或同种异体移植物中的内源WNT信号传导水平的研究。但是，有多项研究清楚地证明Wnt抑制剂的血清水平在老年人中升高，这据推测降低Wnt信号传导活性。这些临床发现与显示BGM中的Wnt活性随年龄下降的我们的数据一致(图8)。因此，升高WNT反应性的方法恢复自体移植物的成骨能力。我们证明L-WNT3A的处理激活BGM中的Wnt信号传导，其与SRC中(图11)和脊柱融合模型中(图12)的稳定骨发生相关耳关。
[0124]用L-WNT3A激活自体移植物干细胞。自体移植物的至少部分功效可以追溯到材料内的干细胞/基质细胞。在骨髓腔中，成骨/骨骼干细胞粘附于骨内膜表面或嵌于骨内膜表面上。结果，依赖于单独抽吸的收获方法通常不能收集这些粘附的干细胞群体。事实上，当前的估计将骨髓抽吸物中干细胞的数目置于低至1/50，000有核细胞；在老年患者中，该数目下降至仅1/1，000, 000有核细胞。RIA收获有意地除去骨内膜表面并因此更可能包含成骨干细胞群体。我们使用除去其中Wnt反应性细胞驻留的骨内膜表面的改进RIA方法(图8)，然后证明以这种方式收集的BGM包含干细胞/祖细胞群体且是稳定成骨的(图7)，特别是因为内源Wnt信号(图10)。
[0125]自体移植物继续代表骨重建的经典样本；但是，对于改善自体移植物功效仍存在相当的空间。此处显示的数据证明活体外暴露于L-WNT3A提高细胞存活力并激活新收获的自体移植物中的干细胞群体，这使得提高的成骨活性达到顶点。这些数据具有直接的临床应用，特别是对于来自其固有骨形成能力由于病态、疾病或老化而降低的风险患者群体的自体移植物。
【主权项】
1.一种增强骨移植物中的细胞存活的方法，包括使所述骨移植物经历有效剂量的Wnt多肽的活体外处理足以增强所述骨移植物在移植时的细胞存活的时间段。2.—种增强骨移植物的成骨潜能的方法，包括使所述骨移植物经历有效剂量的Wnt多肽的活体外处理足以增强所述骨移植物在移植时的细胞存活的时间段。3.一种复活来自具有降低的治愈潜能的受试者的骨移植物的方法，包括使所述骨移植物经历有效剂量的Wnt多肽的活体外处理足以增强所述骨移植物在移植时的细胞存活的时间段。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述骨移植物是自体移植物。5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述骨移植物是同种异体移植物。6.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述骨移植物包括干细胞群体。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述骨移植物包括骨髓来源的干细胞群体。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述骨移植物包括骨髓来源的间充质干细胞。9.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述骨移植物来自人类受试者。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述人类受试者是老年患者。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述人类受试者至少60岁。12.根据权利要求10所述的方法，其中所述人类受试者至少65岁。13.根据权利要求10所述的方法，其中所述人类受试者至少70岁。14.根据权利要求10所述的方法，其中所述人类受试者至少75岁。15.根据权利要求10所述的方法，其中所述人类受试者至少80岁。16.根据权利要求10所述的方法，其中所述人类受试者至少85岁。17.根据权利要求8所述的方法，其中所述人类受试者具有降低的治愈潜能。18.根据权利要求16所述的方法，其中所述人类受试者是吸烟者。19.根据权利要求16所述的方法，其中所述人类受试者是糖尿病患者。20.根据权利要求16所述的方法，其中所述人类受试者具有营养缺陷。21.根据权利要求1-19任一项所述的方法，其中所述Wnt多肽是Wnt3a。22.根据权利要求20所述的方法，其中所述Wnt多肽是人Wnt3a。23.根据权利要求21所述的方法，其中所述Wnt多肽是脂质体人Wnt3a(LWnt3a)。24.根据权利要求1-23任一项所述的方法，进一步包括将所述骨移植物引入接受者中的步骤。25.根据权利要求24所述的方法，其中所述接受者是人类患者。26.根据权利要求25所述的方法，其中所述骨移植物用于支持牙种植体或增强牙种植体的支持。27.根据权利要求25所述的方法，其中所述骨移植物用于修复骨折。28.根据权利要求25所述的方法，其中所述骨移植物用于修复或重建病变的骨骼。29.根据权利要求27或28所述的方法，其中所述骨移植物用于接受者的髋部、膝部或脊柱中。
【专利摘要】本发明涉及通过用Wnt多肽如脂质体Wnt多肽的活体外处理增强骨移植物的细胞存活和成骨潜能。特别地，本发明涉及骨移植物用人Wnt3a蛋白，优选脂质体人Wnt3a(LWnt3a)进行的活体外处理。
【IPC分类】A61P19/08
【公开号】CN105431202
【申请号】CN201480040557
【发明人】G·达姆德赫瑞, J·赫尔姆斯
【申请人】小利兰斯坦福大学托管委员会
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2014年7月16日
【公告号】CA2916898A1, EP3021943A2, US9301980, US20150050249, WO2015009829A2, WO2015009829A3