35] (2)按配比将各原料混合，加入原料药总重量12倍的水，加热煮沸3h，过滤;再次加 入原料药总重量10倍的水，加热煮沸2.5h，再次过滤；
[0036] (3)合并两次过滤液，用浓度95%乙醇为溶剂，在75°C温浸提取，提取次数为5次， 每次提取时间为3h，每次溶剂用量为原料总重量的12倍，滤过，收集提取液；
[0037] (4)将提取液减压浓缩至相对密度为1.20~1.30,压力控制在0.5个大气压，过滤， 灌装，即得。
[0038]实施例4:考察本发明药物对淋巴囊肿病毒感染牙鲆鳍细胞的影响 [0039]试验药物:使用本发明实施例2中的药物，取1 OOmL加水稀释至10L。
[0040]试验方法：
[0041] 将淋巴囊肿病毒原液lmL添加9mL L-15进行10倍稀释到10mL作为病毒液。取对数 生长期TF细胞以0.8 X 105个/mL接种于96孔板，于22°C，5 %C02培养箱中培养，观察；当细胞 约长成单层时，用无血清L-15培养液清洗二遍;添加80yL病毒液，22 °C吸附2h后，去除病毒 液，加入10 %胎牛血清-L-15培养液180yL，22 °C培养，观察。设对照组，添加 PBS吸附2h后，去 除PBS，加入10 %胎牛血清-L-15培养液180yL培养。对照组设3个孔。每12h照相。
[0042] 取80yL病毒液与本发明药物溶液(终浓度为0.02g生药/mL)，22°C作用2h。以此混 合物感染对数生长期的TF细胞，22°C吸附2h后，去除混合物，加入新鲜细胞培养液继续培 养，每日观察细胞病变程度。每1组分重复4孔，同时设置不添加任何提取物组分或病毒液的 正常细胞对照和仅添加淋巴囊肿病毒吸附2h的细胞对照。
[0043]试验结果：
[0044] 通过用本发明药物预处理淋巴囊肿病毒，然后再感染TF细胞的方法来检测对淋巴 囊肿病毒的直接灭活作用。结果见表1.
[0045] 表1 TF细胞经本发明药物处理的淋巴囊肿病毒感染后的细胞病变程度
[0046]
[0047] 注：细胞病变程度：-，0% ; 土，1~9% ; +，10~19% ;++，20~39% ;+++，40~60% ; + +++，〉60% 〇
[0048] 结果显示，淋巴囊肿病毒感染细胞在72h后，TF细胞出现了皱缩、脱落和死亡等细 胞病变现象;而用本发明药物与淋巴囊肿病毒的混合物分别感染的TF细胞，其细胞病变程 度较低。此外，随着培养时间的延长，淋巴囊肿病毒感染细胞，其细胞病变程度逐渐加剧，而 用本发明药物与淋巴囊肿病毒的混合物分别感染的TF细胞，其细胞病变程度没有出现显著 加剧的现象。可见，本发明药物对淋巴囊肿病毒具有较强的抑制作用。
[0049] 实施例5
[0050] 浙江省台州市某鱼类养殖场有大菱虾鱼苗4.2万尾。从2014年开始进行本发明构 建的中药组合物的效果检测。在预防效果检测时，在幼苗时期给予实施例2中的药物预防， 采用药浴的方式浸泡给药（l-l〇〇ml)作为实验组；同时，在同一批幼苗，同样的养殖条件下 用目前已有的免疫制剂作为阳性对照组，共进行了5组平行试验;在养殖4-6个月后检测，实 验组和阳性对照组的抗病力上没有统计学意义上的差别。但由于本发明的中药制剂在配制 过程中考虑到应激反应对幼苗生长上的影响，兼顾了免疫力与生长率;因此，实验组的生长 速率明显高于阳性对照组。
[0051 ]而在发病鱼的治疗上，用淋巴囊肿病毒进行感染实验，实验组约有30%的牙鲆出 现囊肿症状(如:病鱼的头、皮肤、鳍、尾部及鳃上有单个或成群的珠状肿物，大多数分布在 血管附近，小如念珠，大如菜花;颜色有乳白色、粉红色和淡灰色，成熟的肿物可轻微出血）。 将病鱼给予实施例2中的药物治疗，采用药浴的方式浸泡给药（19-100ml稀释）。结果，最终 仅有约1.5~2.5%的牙鲆病鱼感染淋巴囊肿病毒死亡，未给养殖户造成大的损失。
[0052] 经多个实施例表明本发明制备的中药组合物能够有效预防和治疗牙鲆的淋巴囊 肿病，而不是因为个体或治疗方法上的差异造成的个案。本发明中药组合物具有很好的应 用推广价值。
[0053] 对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在 不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论 从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权 利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有 变化囊括在本发明内。
【主权项】
1. 一种治疗牙鲆淋巴囊肿病的中药组合物，其特征在于，由以下重量份的原料制备而 成：川芎40~60份，马钱子20~24份，千年健50~60份，藏红花30~40份，沙参20~30份，杜 仲50~60份，防风15~25份，牛膝6~8份，赤芍12~18份，厚朴18~24份，胆南星6~8份。2. 根据权利要求1所述的治疗牙鲆淋巴囊肿病的中药组合物，其特征在于，具体由以下 重量份的原料制备而成：川芎50份，马钱子22份，千年健55份，藏红花35份，沙参25份，杜仲 55份，防风20份，牛膝7份，赤芍15份，厚朴21份，胆南星7份。3. -种如权利要求1或2所述的治疗牙鲆淋巴囊肿病的中药组合物的制备方法，其特征 在于，具体步骤如下： (1) 取上述各原料，清洗干净后，自然晾干，粉碎，过30~40目筛； (2) 按配比将各原料混合，加入原料药总重量10~12倍的水，加热煮沸2~3h，过滤；再 次加入原料药总重量8~10倍的水，加热煮沸1.5~2.5h，再次过滤； (3) 合并两次过滤液，用浓度90~95%乙醇为溶剂，在70~80°C温浸提取，提取次数为3 ~5次，每次提取时间为2~3h，每次溶剂用量为原料总重量的10~12倍，滤过，收集提取液； (4) 将提取液减压浓缩至相对密度为1 · 20~1 · 30，压力控制在0 · 3~0 · 5个大气压，过 滤，灌装，即得。
【专利摘要】本发明公开了一种治疗牙鲆淋巴囊肿病的中药组合物及其制备方法，由川芎、马钱子、千年健、藏红花、沙参、杜仲、防风、牛膝、赤芍、厚朴和胆南星制备而成。取上述各原料，清洗干净后，自然晾干，粉碎过筛；按配比将各原料混合，加入水，加热煮沸提取两次，合并两次过滤液，用乙醇为溶剂进行温浸提取，滤过，收集提取液；将提取液减压浓缩过滤，灌装，即得。本发明中药组合物选用的药材价廉易得，可以有效降低鱼苗的治疗成本。本发明中药组合物制得的制剂可以提前用药以预防牙鲆的淋巴囊肿病，且不会因为免疫应激反应而降低生长速率；也可以得病后给药用于治疗，从而提高牙鲆的养殖成功率，降低渔民的损失。
【IPC分类】A61P31/20, A61K36/8884
【公开号】CN105582210
【申请号】CN201610044337
【发明人】王丹旎
【申请人】王丹旎
【公开日】2016年5月18日
【申请日】2016年1月22日