猪痢疾疫苗的制作方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明设及包含化achyspira hyodysenteriae(猪频疾短螺旋体)细菌的组合物， 尤其设及针对猪频疾的免疫领域。
【背景技术】
[0002] 猪频疾（SD)，由螺旋体化achyspira hyodysenteriae结肠感染引起，仍是全世界 范围内的重大问题。它主要影响育肥期的猪。Brachyspira hyodysenteriae是一种革兰氏 阴性耐氧厌氧螺旋菌，其定殖在猪大肠，引起猪频疾(SD)。此疾病的特征在于严重粘膜出血 性腹泻，主要影响生长育肥周期期间的动物，且在所有主要猪饲养国家中均有发现 (Hidalgo,A.et al.,Journal of clinical microbiologyUOlO),48(8):2859-2865)。
[0003] SD是一种在世界各地广泛分布的疾病，但有关的流行病学研究稀缺，且已报道的 患病率差异显著。因此已报道的，B. hyodysenteriae患病率范围在0 %至接近40 %之间。患 病率的变化可能源自诊断方法的不同，或各国之间的围栏、管理和饲养制度等差异。另外， 许多国家的患病率可能因使用抗微生物剂作为饲料添加剂而被掩盖，在其他国家，禁止抗 生素作为生长促进剂，则可能导致了SD患病率的提高（Alvarez-C)rd6fiez，A.etal.， International Journal of Environmental Research and Public Health(2013),10: 1927-1947)。
[0004] 带菌猪在猪频疾的流行中起到了主要作用，并且被认为是畜群之间的主要传染 源。B.hyodysenteriae能够长期存活在环境中，尤其是在粪坑和化粪池内所含的液体粪便 中，可W在其中保持传染性达60天。例如，它可W在猪的粪便中低溫存活数月。该螺旋体也 可自然地定殖于小鼠、美洲驼、鸡和野鸭，并通过物理载体或污染物增加，使得 B.hyodysenteriae可在畜群内部和畜群之间传播（Hidalgo,A.et al.,Journal of Clinical Microbiology(2010),48(8):2859-2865)〇
[0005] 运种疾病在食物转化率降低、死亡率、育肥期加长方面导致重大直接经济损失，同 时也导致间接损失，例如增加兽医费用、用药等，尤其是对规模化猪场而言。通过药物治疗 消灭疾病是相当困难的，因为许多临床上已恢复的动物在充当带菌体的同时，在很长时间 内持续排出该微生物。
[0006] SD的治疗设及抗生素的使用。欧盟巧U)已将截短侧耳素(泰妙菌素和沃尼妙林)用 于此目的。泰妙菌素和沃尼妙林是天然存在的二祗抗生素截短侧耳素的半合成衍生物，其 显示出抗厌氧菌优秀活性，仅用于动物中，主要是猪。还有大环内醋类(泰乐菌素，W及近年 来的泰伐洛星)和紧密相关的林可霉素(林可酷胺)也常被包括在SD的治疗策略中。然而，对 上述一种或多种抗生素的易感性降低的B.hyodysenteriae菌株的出现，W及基因多样性多 重抗药性菌株的存在，已经在一些国家得到了证实。运一事实使得SD的治疗和控制复杂化， 并应给兽医和养猪户带来警示，需要一种战略性方法来选择抗生素，其必须只能在适当的 现场和实验室诊断后用于严格的适应症，W保证其用于治疗SD的长期效力（Alvarez-Ordofiez,A. et al. , International Journal of Environmental Research and Public Health(2013),10:1927-1947)〇
[0007]药物成本高，再加上在许多情况下不可能完全根除感染，且对药物残留在肉类产 品和环境的忧虑越来越多，因此，需要开发有效的免疫预防方法来控制SD(Diego，R.et al.，化ccine(1995)，13(7):663-667)。
[000引 Joens及其共同作者（Joens,L.A. ,et al. ,American Journal of Veterinary Research ( 1979 )，40 : I 352-I 35 4)报告了从急性SD康复的猪在此后再次接种 B. hyodysenter iae时不再得病，表明感染可能诱导保护性免疫应答(Al varez-0rci6fiez,A. et al.,International Journal of Environmental Research and Public Health(2013), 10:1927-1947)，此后，已有许多开发疫苗W控制SD的尝试。然而，开发用于控制SD的疫苗的 尝试仅获得了有限的成功。化dsorKHudson,M.J.et al.,British Veterinary Journal (1974),130:37-40;Hudson,M.J.et al.,Research in Veterinary Science(1976),21: 366-367)开发了一种减毒活疫苗，其无法预防后续接触感染。Glock(Glock，R. D. et al.， Proceedings of the 6th International Pig Veterinary Society Congress(1980), Copenhagen ,Denmark ,p. 521)报告了一种灭活疫苗在进行共六次每隔6天一次的静脉注射 后，对病菌起到了一定保护。减毒或遗传修饰的活无毒疫苗可能表现出定殖降低，并使得免 疫刺激降低（Alvarez-Ordoncz'A. et al. , International Journal of Environmental Research and Public Health(2013),10:1927-1947)0
[0009] 另一种替代性方法是，产生可W通过重组B. hyodysenteriae蛋白在细菌递送载体 上的表达来递送的亚单位疫苗。已有鉴别B.hyodysenteriae蛋白质W用于亚单位疫苗的尝 试，但W重组38kDa鞭毛蛋白进行疫苗接种，未能防止其在实验性感染的猪中定植(Gabe et alInfection and Immunity(1995) ,63:142-148)。另一方面，W重组29.7kDa外膜脂蛋白 (Bhlp29.7)进行疫苗接种，得到了部分保护，发展疾病的动物少于对照组。运项研究的作者 得出结论认为，免疫接种也倾向于延迟螺旋体随粪便排出的发作，但并不一定能阻止其发 生(Xa,T.et al. ,Veterinary Mic;robiology(2004) ,102:97-109)。由Holden等人进行的一 项研究中，评估了 WsmpB(B.hyodysente;riae的外膜蛋白）疫苗接种的疗效。然而，在蛋白质 疫苗接种后的应答只对疾病提供了中度保护（Ho Iden, J. et al . ,Veterinary Microbiology(2008) ,128:354-363)。在大多数情况下，测试的重组疫苗未能对猪提供足够 保护（Alv曰rez-Ord她ez,A. et 曰1International Journal of Environment曰I Research and Public Health(2013),10:1927-1947)〇
[0010]由全细胞菌苗组成的疫苗能诱导对化achyspira hyodysenteriae的血清抗体反 应，但通常不能预防猪感染疾病。使用从全细胞裂解物中制备的B.hyodysenteriae菌苗，甚 至可能加剧疾病感染(Waters,W.R.et al.，Vaccine(2000) ,18:711-719)。此外，菌苗疫苗 往往是脂多糖血清群特异性的，其需要使用自体菌苗。此外，由于厌氧螺旋体挑剔的增长需 求(Xa,T.et al. ,Veterinary Mic;robiology(2004), 102:97-109) ,B.hyodysenteriae菌苗 的生产大规模相当困难和昂贵。在一些国家中，SD菌苗疫苗可购得，并提供一定程度的保 护。然而，如上所述，其往往是脂寡糖化OS)血清群特异性的，需要使用自体或多价制剂化a, T.et al. ,Veterinary Microbiology(2004), 102:97-109)。本领域中的SD疫苗其它参考文 献可在下列专利文献中找到：
[0011] US4748019:研究人员发现，接种疫苗的有效方案包括肠胃外给予猪能有效刺激猪 免疫反应的灭活强毒或病原T.hyodysente;riae(菌株"P18A"，NCTC11615)初次剂量，并在 大约同时或其后给药无毒或非致病活菌株的T.hyodysenteriae后续剂量(菌株"VSr，NCTC 11628)。
[0012] US5750118:本发明设及包含灭活且含佐剂的有效剂量T.hyodysenteriae抗原(强 毒或减毒的菌株)的用于皮内给药的SD疫苗。疫苗抗原是从灭活的菌株27164ATCC制备的。
[0013] US5281416:本发明设及抗SD的猪免疫接种方法，其特征在于通过非肠道方式，优 选为肌内给药方式，^T.hyodysenteriae活菌株或氧处理的非活性株向猪给药的方法。可 使用的代表性菌株为参考菌株ATCC 31287,ATCC 31212和参考无毒菌株ATCC 27164。
[0014] 但是，据发现，运些疫苗的效力是可变的。自体制剂(也称为"自体疫苗"，可W定义 为使用从患病动物自身组织或分泌物中分离的生物体的培养物制备的疫苗）已被用于进一 步改善运些疫苗。运种方法虽然有效，却具有极高的金钱和时间成本，且仅能针对 B.hyodysenteriae单一菌株提供保护。此外，免疫接种发生在致病菌株已被鉴定后的一段 时间W后，运可能需要几个星期(例如，按照标准程序，从农场样品的分离过程、初始培养和 自体疫苗的生产，可能需要至少6周）。运一延迟时间往往造成细菌从牛群传播到其他动物， 或在极端情况下，甚至传播到其他养猪场。运还引发严重的经济损失，且其本身作为常规应 用是一种昂贵的过程。SD因而仍然是许多养猪国家的一个重要流行传染病。有效的经济适 用CD疫苗具有巨大的必要性。
【发明内容】
[0015] 猪频疾（SD)是由化achyspira hyodysenteriae导致的一种严重的猪出血性肠道 疾病，对猪生产有很大的影响，并通过死亡率和次佳绩效而导致重大损失。考虑到多重耐药 菌株的出现，W及对药物残余可W存在于肉制品或环境中的担忧，迫切需要高效的免疫预 防方法来控制SD。然而，现有的疫苗无法W令人满意的程度赋予针对感染的保护，而且即使 它们赋予了一定程度的保护，却不提供针对不同血清群菌株的充足交叉保护免疫。此外，自 体疫苗的制造和商业化目前存在许多不便。因此，需要一种能够针对不同血清型提供强力 保护的抗SD疫苗，即一种有效的通用SD疫苗。
[0016] 本发明人已经开发了针对SD的疫苗，出乎意料的是，其与自体疫苗一样有效，尽管 其组合物中不具有能导致该感染的菌株。运种效果是非常令人惊奇的，因其与自体疫苗理 论矛盾。本发明提供了一种具有抗化achyspira hyodysenteriae的高效普遍保护的疫苗， 即"通用疫苗"。
[0017] 在第一方面，包含来自化achyspira hyodysenteriae的至少两种基因多样菌株的 细菌的组合物。本发明的组合物可包含灭活的菌株，且所述基因多样性可通过从不同克隆 复合体中筛选所述来自化achyspira hyodysenteriae的至少两种基因多样菌株而获得的。 在一个优选的方面中，所述基因多样性菌株在目标区域中检测为占总检测菌株的比例为至 少1%。目标区域可W是任意区域，优选为西班牙。
[0018] 在第二方面中，本发明设及本发明的组合物及其作为疫苗的用途，优选为一种针 对Rrachyspira hyodysenteriae所引起的猪频疾的疫苗。
[0019] 此外，本发明提供了用于生产本发明的组合物的方法，其包括选取至少两种基因 多样性菌株，并将其等量混合，W达到至少在IO 8至IO9总细菌数/mL之间的浓度。
【附图说明】
[0020] 图1.本研究中发现并Wupgma聚类的44种B.hyodysenteriae MLVA类型的系统树 图。罗马数字I至VI表示在单位点变异体水平上定义的克隆复合体。比例尺表示遗传距离， 显示为基因型之间的标记等位基因差异的绝对数量。图中所示为含40%的自展支持