通过单步过程制备双层支架的方法以及利用由该制备方法获得的双层支架进行组织再生 ...的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及通过单步过程制备双层支架的方法W及利用由该制备方法获得的双 层支架进行组织再生的方法。
【背景技术】
[0002] 支架是为了对组织细胞进行体外培养和移植而制备的物理支撑和贴附基底;支架 用于为人组织再生进行的细胞移植;并且，支架对于细胞的大量培养和增殖十分重要。其原 因在于上皮细胞的细胞贴附W及相伴的迁移和增殖发生在细胞和基底之间的接触部分。
[0003] 在体内或体外与物质相接触时，大部分具有生物活性的细胞首先通过细胞贴附而 存活。特别地，在成纤维细胞和组织细胞的存活中，细胞优先贴附至基底，随后细胞质中的 细胞器代谢变得活跃，并移向新的位点，从而促进增殖和营养供应。
[0004] 因此，用于使细胞有效堆积的表面对于细胞的增殖而言是最基本的手段。可借助 基底的组分对细胞基底的贴附性能进行人为控制。支架是细胞再生和生长的支撑载体(即， 人工基底中作为基础的材料），近来被用作大量培养和增殖的容器或烧瓶的涂层。
[0005] 另一方面，韩国专利公开号2004-0016984公开了用于培养细胞和组织的载体及其 培养方法，其中，成纤维细胞的过度生长可被阻抑，并且祀组织或器官可有效再生。然而，上 述支架存在诸多问题:其贴附性并不足W对细胞进行大量培养，其物理性质并不出众，制备 方法也并不简便和符合期望。
[0006] 此外，传统的双层支架是通过在分别制造各聚合物支架后将其彼此附着来制备 的，然而，所述双层支架不能完全附着，存在很大的分离可能，并且，由于聚合物支架的制备 为两步法，工艺很复杂。
[0007] 因此，本发明的发明人通过将阴离子表面活性剂加入至两种聚合物共混的溶液 中，在高溫高速下揽拌反应W诱导相分离，并确认了由此产生的支架是结构和化学上特异 的双层支架，从而完成了本发明。
【发明内容】
[000引技术问题
[0009] 本发明的一个目的在于提供通过简单的单步过程制备结构和化学上特异的、不会 分离的双层支架的方法。
[0010] 此外，本发明的另一目的在于提供利用所述双层支架进行组织再生的方法。
[00川技术方案
[0012]为了实现本发明的目的，本发明提供了通过简单的单步过程制备双层支架的方 法，所述方法包含:制备第一聚合物水性溶液;将第二聚合物加入至所述第一聚合物水性溶 液中，并对反应物进行揽拌;将表面活性剂加入至经揽拌的反应物中，并对所述反应物进行 高溫高速揽拌;对经揽拌的反应物进行冷冻干燥，从而获得海绵状物(sponge);将所述海绵 状物浸溃于交联剂中，使其交联;W及对经交联的反应物进行冷冻干燥。
[0013] 本发明提供了制备双层支架的方法，所述方法包含:通过在60-70°C的溫度下W 100-30化pm的速度对水中的明胶进行揽拌W使其完全溶解，制备明胶水性溶液;将聚乙締 醇(PVA)加入至所述明胶水性溶液中，并对溶液进行揽拌;将十二烷基硫酸钢加入至经揽拌 的溶液中，并在80-120°C的溫度下W800-2000rpm进行揽拌;对经揽拌的溶液进行冷冻干 燥，从而获得海绵状物;将所述海绵状物浸溃于交联剂中，使其交联，所述交联剂选自于由 戊二醒或乙基二乙基氨基丙基碳化二亚胺化DC)所组成的组；W及对经交联的反应物进行 冷冻干燥。
[0014] 本发明提供了通过在由上述制备方法制备的双层支架中培养细胞进行组织再生 的方法。
[0015] 此外，本发明提供了用于组织再生和创伤愈合的组合物，所述组合物包含上述双 层支架。
[0016] 有益效果
[0017] 与通过分别制造各聚合物支架后将其粘合的两步过程而制备的传统双层支架不 同，根据本发明的制备方法，可通过单步过程制备完全附着的双层支架，并且，可通过在制 备的双层支架中培养细胞，并将其施用至进行组织再生或创伤愈合的皮肤缺陷位点；或者 在制备的双层支架中对软骨细胞和骨细胞进行共培养，并将其施用至组织(例如骨和软骨） 彼此接触的位点，促进由于创伤、烧伤、肿瘤等损失的皮肤组织的再生。
【附图说明】
[0018] 图1描绘了根据本发明的双层支架制备过程的示意流程图。
[0019] 图2为根据本发明的双层支架的扫描电子显微图像。
[0020] 图3为根据本发明的双层支架的数字图像(A:含水的双层支架;B:干燥的双层支 架;C:交联前的干燥的双层支架）。
[0021] 图4为根据本发明的双层支架的FT-IR显微图像和曲线图（明胶层）。
[0022] 图5为根据本发明的双层支架的FT-IR显微图像和曲线图(PVA层）。
[0023] 图6为根据本发明的双层支架的显微CT图像(A:双层支架;B:明胶层）。
[0024] 图7为在根据本发明的双层支架中培养1天的细胞的扫描电子显微图像。
[0025] 图8为在根据本发明的双层支架中培养5天的细胞的扫描电子显微图像。
[00%]图9和10展示了利用根据本发明的双层支架处理的创伤组织中的组织再生效果。
[0027] 图11为利用双层支架处理创伤组织后将其切下进行的RT-PCR分析。
【具体实施方式】
[0028] 本发明提供了通过单步过程制备双层支架的方法，所述方法包含：制备第一聚合 物水性溶液;将第二聚合物加入至所述第一聚合物水性溶液中，并对反应物进行揽拌;将表 面活性剂加入至经揽拌的反应物中，并对所述反应物进行高溫高速揽拌;对经揽拌的反应 物进行冷冻干燥，从而获得海绵状物;将所述海绵状物浸溃于交联剂中，使其交联；W及对 经交联的反应物进行冷冻干燥。
[0029] 所述第一聚合物和所述第二聚合物可彼此不同，并可选自于由如下聚合物所组成 的组：明胶、壳聚糖山111*03曰11)、弹性蛋白、透明质酸、径基憐灰石、藻酸盐、胶原、纤维素、聚 乙二醇(PEG)、聚环氧乙烧(PEO)、聚己内醋(PCL)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚（乳酸-共-乙醇酸）（化64)、聚[(3-径基下酸醋)-共-(3-径基戊酸醋）](P皿V)、聚二嗯烧酬(PD0)、 聚[化-丙交醋）-共-(己内醋）]、聚醋型聚氨醋（9〇17(63*61'山"61：11日]16)，？61]1])、聚[化-丙交 醋)-共-(D-丙交醋）]、聚（乙締-共-乙締醇KPV0H)、聚丙締酸(PAA)、聚乙締醇(PVA)、聚乙 締化咯烧酬(PVP)、聚苯乙締(PS)和聚苯胺(PAN)。优选地，所述第一聚合物可W是明胶，所 述第二聚合物可W是聚乙締醇(PVA)。
[0030] 所述表面活性剂可W是阴离子表面活性剂，例如可选自于由如下表面活性剂所组 成的组：十二烷基硫酸钢（SDS)、月桂基硫酸锭(ALS)、月桂基乙締硫酸钢（Sodium Lauryl Ethylene Sulfate，化ES)、直链烷基苯横酸盐化AS)、a-締控横酸盐(AOS)、烷基硫酸盐 (AS)、烷基酸硫酸盐(AES)和链烧横酸钢(Sodium A化ane Sulfonate，SAS);优选地，所述表 面活性剂为十二烷基硫酸钢(SDS)。
[0031] 高溫高速揽拌优选在80-12(TC的溫度下W800-2000巧m进行。
[0032] 所述交联剂可选自于由如下交联剂所组成的组:戊二醒、乙基二乙基氨基丙基碳 化二亚胺化DC)、京尼平(gen巧in)和转谷氨酷胺酶(TG)。
[0033] 此外，本发明提供了制备上述双层支架的方法，其中，所述方法包含:通过在60-70 °(：的溫度下W100 -3(K)rpm的速度对水中的明胶进行揽拌W使其完全溶解，制备明胶水性溶 液;将聚乙締醇(PVA)加入至所述明胶水性溶液中，并对溶液进行揽拌;将十二烷基硫酸钢 加入至经揽拌的溶液中，并在80-120°C的溫度下W800-2000rpm进行揽拌;对经揽拌的溶液 进行冷冻干燥，从而获得海绵状物;将所述海绵状物浸溃于交联剂中，使其交联，所述交联 剂选自于由戊二醒或乙基二乙基氨基丙基碳化二亚胺化DC)所组成的组；W及对经交联的 反应物进行冷冻干燥。
[0034] 进而，本发明提供了通过在由上述方法制备的双层支架中培养细胞进行组织再生 的方法。<