生物相容性高分子多孔体的制造方法、生物相容性高分子多孔体、生物相容性高分子块体 ...的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种生物相容性高分子多孔体的制造方法、生物相容性高分子多孔 体、生物相容性高分子块体及细胞构建体。详细而言，本发明设及一种能够制造显示较高的 细胞数量及较高的血管数量的细胞构建体的生物相容性高分子多孔体及其制造方法、W及 由所述生物相容性高分子多孔体得到的生物相容性高分子块体及细胞构建体。
【背景技术】
[0002] 帮助陷入功能障碍和功能不全的生物组织、器官再生的再生医疗的实际应用目前 正在进行中。再生医疗是新的医疗技术，其使用细胞、支架及生长因子运=种因子来使生物 组织恢复与原组织相同的形式和功能，所述生物组织无法仅通过活体所具有的自然治愈能 力来恢复。近年来，已经逐渐实现使用细胞的治疗。例如，可W举出使用自体细胞的培养表 皮、使用自体软骨细胞的软骨治疗、使用间充质干细胞的骨再生治疗、使用成肌细胞的屯、肌 细胞片治疗、使用角膜上皮片的角膜再生治疗、W及神经再生治疗等。运些新的治疗与现有 的使用人造材料的代替医疗(例如，人工骨修补剂、透明质酸注射等)不同，是帮助生物组织 的修复与再生的技术，可得到较高的治疗效果。实际上，使用自体细胞的培养表皮、培养软 骨等产品已有销售。
[0003] 例如，在使用细胞片的屯、肌再生中，为了使有厚度的组织再生，认为需要细胞片的 多层构建体。
[0004] 另外，专利文献1及专利文献2中记载有通过W镶嵌状=维配置具有生物相容性的 高分子块体和细胞来制造的细胞=维构建体。在该细胞=维构建体中，能够从外部向细胞 =维构建体的内部递送营养，具有充分的厚度，并且细胞在构建体中均匀地存在。并且，专 利文献1的实施例中，使用由重组明胶或天然明胶材料构成的高分子块体证实了较高的细 胞生存活性，专利文献2中公开有移植细胞=维构建体之后能够在移植部位形成血管。
[000引 W往技术文献
[0006] 专利文献
[0007] 专利文献1:国际公开W02011/108517号公报
[0008] 专利文献2:美国专利申请公开第2013/071441号说明书
[0009] 发明的概要
[0010] 发明要解决的技术课题
[0011] 专利文献1及2中所公开的细胞=维构建体显示较高的细胞生存活性及血管形成 能力，但期待显示更高的细胞生存活性及血管形成能力的生物相容性高分子块体及细胞构 建体。
[0012] 因此，本发明所要解决的课题在于提供一种可W提供显示较高的细胞数量及较高 的血管数量的细胞构建体的生物相容性高分子多孔体及其制造方法。另外，本发明的课题 在于提供一种由所述生物相容性高分子多孔体得到的生物相容性高分子块体及细胞构建 体。
[0013] 用于解决技术课题的手段
[0014] 本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，其结果发现通过W下工序制造 的生物相容性高分子多孔体中，多孔气孔的大小偏差较小，即多孔体的结构均匀性较高： (a)将生物相容性高分子的溶液冷却成未冷冻状态的工序，其中，溶液中液溫最高的部分的 溫度与溶液中液溫最低的部分的溫度之差为2.5°C W下，且溶液中液溫最高的部分的溫度 为溶剂的烙点W下；（b)对工序(a)中所得到的生物相容性高分子的溶液进行冷冻的工序； 及(C)对工序(b)中所得到的冷冻的生物相容性高分子进行冷冻干燥的工序。并且，本发明 人等发现使用如此得到的生物相容性高分子多孔体来制造的细胞构建体显示较高的细胞 数量及较高的血管数量。本发明是基于运些见解而完成的。
[0015] 目P，根据本发明，提供一种生物相容性高分子多孔体的制造方法，所述制造方法包 含：
[0016] (a)将生物相容性高分子的溶液冷却成未冷冻状态的工序，其中，溶液中液溫最高 的部分的溫度与溶液中液溫最低的部分的溫度之差为2.5°C W下，且溶液中液溫最高的部 分的溫度为溶剂的烙点W下；
[0017] (b)对工序(a)中所得到的生物相容性高分子的溶液进行冷冻的工序;及
[0018] (C)对工序(b)中所得到的冷冻的生物相容性高分子进行冷冻干燥的工序。
[0019] 优选在工序(a)中，即将产生凝固热之前的溶液中液溫最高的部分的溫度与溶液 中液溫最低的部分的溫度之差为2.5 °C W下。
[0020] 优选在工序(a)中，溶液中液溫最低的部分的溫度为溶剂烙点-5°C W下。
[0021 ]根据本发明，还提供一种通过本发明的生物相容性高分子多孔体的制造方法来制 造的生物相容性高分子多孔体。
[0022] 根据本发明，还提供一种生物相容性高分子多孔体，其中，对于通过对生物相容性 高分子多孔体的剖面结构的图像的1.5mm见方视场实施二维傅立叶变换而得到的二维傅立 叶变换图像制作谱线轮廓时，在谱线轮廓上的X的最大值的一半的位置不存在峰值，所述谱 线轮廓是从二维傅立叶变换图像的y轴下端开始，对于图像像素尺寸的10分之1像素宽度， 将X轴坐标周边的亮度值进行平均并绘制在y轴上而得到的。该生物相容性高分子多孔体优 选通过本发明的生物相容性高分子多孔体的制造方法来进行制造。
[0023] 优选将谱线轮廓的基本偏差值设为O时，将在谱线轮廓上的X的最大值的一半的位 置检测不到2. Oo W上的峰值的情况视为不存在峰值。
[0024] 优选生物相容性高分子为明胶、胶原、弹性蛋白、纤连蛋白、Pronectin、层粘连蛋 白、腫生蛋白、纤维蛋白、丝蛋白、巢蛋白、血小板反应蛋白、Retro化ctin、聚乳酸、聚乙醇 酸、乳酸-乙醇酸共聚物、透明质酸、糖胺聚糖、蛋白聚糖、软骨素、纤维素、琼脂糖、簇甲基纤 维素、甲壳素、或壳聚糖。
[002引优选生物相容性高分子为重组明胶。
[0026] 优选重组明胶由下式表示。
[0027] 式:A-[(Gly-X-Y)n]m-B
[0028] (式中，A表示任意氨基酸或氨基酸序列，B表示任意氨基酸或氨基酸序列，n个X分 别独立地表示氨基酸中的任意一种，n个Y分别独立地表示氨基酸中的任意一种，n表示3~ 100的整数，m表示2~10的整数。另外，n个Gly-X-Y可W分别相同也可W不同。）。
[0029 ]优选重组明胶为W下中的任意一种：
[0030] (a)具有序列号1所记载的氨基酸序列的蛋白质；
[0031] (b)具有在序列号1所记载的氨基酸序列中缺失、取代或附加了一个或多个氨基酸 的氨基酸序列且具有生物相容性的蛋白质;或
[0032] (C)具有与序列号1所记载的氨基酸序列具有80% W上的同源性的氨基酸序列且 具有生物相容性的蛋白质。
[0033] 优选重组明胶为具有与序列号1所记载的氨基酸序列具有90% W上的同源性的氨 基酸序列且具有生物相容性的蛋白质。
[0034] 优选重组明胶为具有与序列号1所记载的氨基酸序列具有95% W上的同源性的氨 基酸序列且具有生物相容性的蛋白质。
[0035] 优选多孔体中的生物相容性高分子通过热、紫外线或酶进行交联。
[0036] 根据本发明，还提供一种生物相容性高分子块体，其通过粉碎本发明的生物相容 性高分子多孔体来得到。
[0037] 根据本发明，还提供一种细胞构建体，其含有:本发明的生物相容性高分子块体； 及至少一种细胞，并且在多个细胞间的间隙中配置有多个生物相容性高分子块体。
[0038] 优选一个生物相容性高分子块体的大小为20皿W上且200皿W下。
[0039] 优选一个生物相容性高分子块体的大小为50皿W上且120皿W下。
[0040] 优选本发明的细胞构建体的厚度或直径为400mW上且3cmW下。
[0041 ]优选本发明的细胞构建体中，相对于一个细胞，包含0.000000Iyg W上且化gW下 的生物相容性高分子块体。
[0042] 优选本发明的细胞构建体含有血管生成因子。
[0043] 优选细胞为选自多能细胞、体干细胞、前体细胞及成熟细胞中的细胞。
[0044] 优选细胞仅为非血管系细胞。
[004引优选细胞包含非血管系细胞及血管系细胞运两者。
[0046] 优选在细胞构建体中具有中屯、部的血管系细胞的面积大于周边部的血管系细胞 的面积的区域。
[0047] 优选具有中屯、部的血管系细胞的比例相对于血管系细胞的总面积为60%~100% 的区域。
[0048] 优选具有细胞构建体的中屯、部的血管系细胞密度为1.0 X ICT4CelIs/皿3 W上的区 域。
[0049] 优选在细胞构建体的内部形成有血管。
[0050] 发明效果
[0051] 通过使用生物相容性高分子多孔体来制造的细胞构建体在细胞构建体中能够显 示较高的细胞数量及较高的血管数量，所述生物相容性高分子多孔体通过本发明的生物相 容性高分子多孔体的制造方法来进行制造。根据由本发明提供的细胞构建体，能够进行更 有效的细胞移植治疗。
【附图说明】
[0052] 图I表示"A"中所记载的实验的液溫轮廓。
[0053] 图2表示"B"中所记载的实验的液溫轮廓。
[0054] 图2表示"护中所记载的实验的液溫轮廓。
[0055] 图4表示"护中所记载的实验的液溫轮廓。
[0056] 图5表示"护中所记载的实验的液溫轮廓。
[0057] 图6表示"F"中所记载的实验的液溫轮廓。
[0058] 图7表示"AA"中所记载的实验的液溫轮廓。
[0059] 图8表示"BB"中所记载的实验的液溫轮廓。
[0060] 图9表示"A"及"B"中所得到的CBE3多孔体的均匀性评价仁维傅立叶变换与轴向 功率谱）。
[0061] 图10表示"C"及"护中所得到的CBE3多孔体的均匀性评价仁维傅立叶变换与轴向 功率谱）。
[00叫图11表示"护及"F"中所得到的CBE3多孔体的均匀性评价仁维傅立叶变换与轴向 功率谱）。
[00間图12表示"AA"及"BB"中所得到的CBE3多孔体的均匀性评价(二维傅立叶变换与轴 向功率谱）。
[0064] 图13表示使用差溫大块体A及B的hMSC镶嵌细胞块中的细胞数量和血管的评价。
[0065] 图14表示使用差溫大块体C的hMSC镶嵌细胞块中的细胞数量和血管的评价。
[0066] 图15表示使用差溫小块体E及F的hMSC镶嵌细胞块中的细胞数量和血管的评价。
[0067] 图16表示使用差溫大块体A及B的hMSC+hECFC镶嵌细胞块中的细胞数量和血管的 评价。
[0068] 图17表示使用差溫小块体E及F的hMSC+hECFC镶嵌细胞块中的细胞数量和血管的 评价。
【具体实施方式】
[0069] W下，对本发明的实施方式进行详细说明。
[0070] (1)生物相容性高分子多孔体的制造方法
[0071] 本发明的生物相容性高分子多孔体的制造方法包含：
[0072] (a)将生物相容性高分子的溶液冷却成未冷冻状态的工序，其中，溶液中液溫最高 的部分的溫度与溶液中液溫最低的部分的溫度之差为2.5°C W下，且溶液中液溫最高的部 分的溫度为溶剂的烙点W下；
[0073] (b)对工序(a)中所得到的生物相容性高分子的溶液进行冷冻的工序;及
[0074] (C)对工序(b)中所得到的冷冻的生物相容性高分子进行冷冻干燥的工序。
[0075] 本发明的方法中，当将生物相容性高分子的溶液冷却成未冷冻状态时，通过将液 溫最高的部分的溫度与溶液中液溫最低的部分的溫度之差为2.5°C W下(优选2.3°C W下， 更优选2. TC W下）即溫度差设为较小，能够减少所得到的多孔气孔的大小偏差。另外，液溫 最高的部分的溫度与溶液中液溫最低的部分的溫度之差的下限并没有特别限定，只要是0 °(：^上即可，例如可^是0.1°(：^上、0.5°(：^上、0.8°(：^上、或0.9°(：^上。由此，使用利用 通过本发明的方法来制造的多孔体制造的生物相容性高分子块体的细胞构建体可W实现 显示较高的细胞数量及较高的血管数量的效果。
[0076]工序(a)的冷却例如优选经由导热系数低于水的材料(优选特氣龙(注册商标））进 行冷却，溶液中液溫最高的部分可视为最远离冷却侧的部分，溶液中液溫最低的部分可视 为冷却面的液溫。
[OOW]在工序(a)中，即将产生凝固热之前的溶液中液溫最高的部分的溫度与溶液中液 溫最低的部分的溫度之差优选为2.5°C W下，更优选为2.3°C W下，进一步优选为2. TC W 下。在此，"即将产生凝固热之前的溫度差"是指产生凝固热时的1秒前~10秒前期间溫度差 最大时的溫度差。
[0078] 在工序(a)中，溶液中液溫最低的部分的溫度优选为溶剂烙点-5 °C W下，更优选为 溶剂烙点-5 °C W下且溶剂烙点-20°C W上，进一步优选为溶剂烙点-6 °C W下且溶剂烙点-16 "CU上。另外，溶剂烙点的溶剂是指生物相容性高分子溶液的溶剂。
[0079] 在工序(b)中，对工序(a)中所得到的生物相容性高分子的溶液进行冷冻。在工序 (b)中用于冷冻的冷却溫度并没有特别限制，虽然也与冷却设备有关，但优选比溶液中液溫 最低的部分的溫度低3°C至30°C的溫度，更优选为低5°C至25°C的溫度，进一步优选为低10 °(：至20°(：的溫度。
[0080] 在工序(C)中，对工序(b)中所得到的冷冻的生物相容性高分子进行冷冻干燥。冷 冻干燥能够通过常规方法来进行，例如能够通过在低于溶剂的烙点的溫度下进行真空干 燥，进而在室溫(20°C)下进行真空干燥来进行冷冻干燥。
[0081 ] (2)生物相容性高分子多孔体
[0082] 根据本发明，提供一种通过上述生物相容性高分子多孔体的制造方法来制造的生 物相容性高分子多孔体。
[0083] 根据本发明，还提供一种生物相容性高分子多孔体，其中，对于通过对生物相容性 高分子多孔体的剖面结构的图像的1.5mm见方视场实施二维傅立叶变换而得到的二维傅立 叶变换图像制作谱线轮廓时，在谱线轮廓的X为最大值的一半的位置不存在峰值，所述谱线 轮廓是从二维傅立叶变换图像的y轴下端开始，对于图像像素尺寸的10分之1像素宽度，将X 轴坐标周边的亮度值进行平均并绘制在y轴上而得到的。
[0084] 在此，"在谱线轮廓的X为最大值的一半的位置不存在峰值"优选是指将谱线轮廓 的基本偏差值设为O时在谱线轮廓的X为最大值的一半的位置检测不到2.OoW上的峰值的 情况。
[0085] 生物相容性高分子多孔体的剖面结构的图像的获得方法并没有特别限定，例如能 够通过制作冷冻切片并制作皿化ematoxylin-eosin)染色标本来获得。通过对所得到的标 本图像中的1.5mm见方视场实施二维傅立叶变换来获得二维傅立叶变换图像。二维傅立叶 变换例如能够使用图像分析软件Image J来进行。
[0086] 在所得到的二维傅立叶变换图像中，生物相容性高分子多孔体中确认到不均匀的 方向性时，尤其在轴向上观测到较强的功率谱。关于轴向有无功率谱，能够通过在二维傅立 叶变换图像的y轴下端取谱线轮廓来规定。具体而言，从y轴下端开始，对于图像像素尺寸的 10分之1像素宽度，将X轴坐标周边的亮度值进行平均并绘制在y轴上，由此能够制作谱线轮 廓。谱线轮廓的制作例如能够使用软件"Gwyddion2.31"来进行。如上所述，在图像横向上从 图像的一端至另一端获得亮度值并进行数值化(线谱），由此能够规定有无功率谱。另外，就 谱线轮廓的X坐标而言，将二维傅立叶变换图像中的左端设为零，将向右前进I像素的位置 设为0.000001。即，在二维傅立叶变换图像中从左端前进512像素的位置在谱线轮廓上的X 坐标为0