br>[0035] 所述细胞可为选自于由如下细胞所组成的组中的任意一种或两种W上：软骨细 胞、骨细胞、皮肤细胞。可通过在双层支架的上层和下层分别培养不同的细胞，对所述细胞 进行共培养。
[0036] 此外，本发明提供了用于组织再生和创伤愈合的组合物，所述组合物包含由上述 方法制备的双层支架。
[0037] 将具体描述根据本发明的双层支架制备方法的一个实施方式，其中，所述第一聚 合物为明胶，所述第二聚合物为聚乙締醇(PVA)，所述表面活性剂为十二烷基硫酸钢(SDS)， 并且所述交联剂为戊二醒或乙基二乙基氨基丙基碳化二亚胺化DC)。
[0038] 根据本发明的一个实施方式，双层支架可通过如下方式制备:通过在60-70°C的溫 度下W100-30化pm的速度对水中的明胶进行揽拌W使其完全溶解，制备明胶水性溶液;将 聚乙締醇(PVA)加入至所述明胶水性溶液中，并对溶液进行揽拌;将十二烷基硫酸钢加入至 经揽拌的溶液中，并在80-120°C的溫度下W800-2000巧m进行揽拌;在-80°C下对经揽拌的 反应物进行冷冻干燥24-4化，从而获得海绵状物;将所述海绵状物浸溃于交联剂中，使其交 联，所述交联剂选自于由戊二醒或乙基二乙基氨基丙基碳化二亚胺巧DC)所组成的组；W及 在-80°C下对经交联的反应物进行冷冻干燥。
[0039] 首先，通过将天然聚合物明胶加入至水中，并在60-70°C的溫度下W100-30化pm进 行揽拌W使其完全溶解，制备明胶水性溶液。所述明胶水性溶液可为l-99wt %、优选 2.5wt%。如果明胶水性溶液中的明胶含量落在上述范围之外，可能会发生无法在视觉上确 认分层的问题。
[0040] 如果未在该条件下进行揽拌，明胶水性溶液不能均匀溶解，或者分层可能出现问 题。
[0041] 通过将聚乙締醇(PVA)加入至明胶水性溶液中并揽拌，从而制备含有l-99wt%、优 选12.5wt%的PVA的聚合物共混溶液。如果PVA含量落在上述范围之外，可能会发生无法在 视觉上确认分层的问题。
[0042] 将作为阴离子表面活性剂的十二烷基硫酸钢(SDS)加入至经揽拌的聚合物共混溶 液中，并在80-120°C的高溫下W800-2000rpm的高速进行揽拌。SDS的加入使得基于聚合物 共混溶液的总量含有0. 〇l-2wt %的SDS。如果SDS含量落在上述范围之外，不能对分层反应 进行控制，并且可能发生难W操控的问题。
[0043] 此外，如果未在所述高溫高速的条件下进行揽拌，不会发生均匀的分层，并且不能 对分层反应进行控制。
[0044] 在-80°C下将经揽拌的反应物进行冷冻干燥24-4化，从而获得海绵状物;并将所述 海绵状物浸溃于交联剂中，使其交联，所述交联剂选自于戊二醒或抓C(乙基二乙基氨基丙 基碳化二亚胺）。此时，使用含有0.1-lwt%的交联剂的水性溶液进行3-2地来产生交联，所 述交联剂例如为戊二醒或抓C(乙基二乙基氨基丙基碳化二亚胺）。如果交联剂含量落在上 述范围之外，不发生交联反应，导致溶液降解;或者，由于未反应的交联剂残留，可能导致细 胞培养有问题。
[0045] 在-80°C下对经交联的反应物再次进行冷冻干燥，从而制备双层支架。
[0046] 根据所述实施方式，可简单地通过单步过程制备如图2和图3中示出的未出现层脱 离的双层支架，运与通过分别制造各聚合物支架后将其粘合的传统双层支架工艺过程不 同。特别地，图2证实了双层支架具有位于左侧的多孔明胶层和位于右侧的高密度PVA层。
[0047] 进而，图4和图5分别展示了根据本发明的双层支架的FT-IR显微图像中的明胶层 和PVA层，并将它们与分别制备的明胶支架对照和PVA支架对照进行了比较。
[0048] 此外，图6为根据本发明的双层支架的显微CT图像(A:双层支架;B:明胶层），其中， 红色部分和灰色部分代表多孔明胶层和高密度PVA层。
[0049] 并且，作为利用双层支架培养细胞的结果，如图7所示，在细胞接种后1天细胞开始 贴附至支架并增殖;如图8所示，证实了在细胞接种后5天细胞分泌的细胞外基质巧CM)堆积 至支架中。
[0050] 此外，如反映了使用双层支架在创伤组织中的组织再生效果的图9和图10所示的， 在利用根据本发明的双层支架处理1天后，组织开始从皮下鼓泡;5天后，组织整合至双层支 架中；10天后，组织再生，同时，明胶层借助自发降解(然而不完全降解)开始脱离。15天后， 双层支架的明胶层几乎完全降解并自发脱离，创伤周围的组织几乎完全再生。另一方面，即 使在5天后，对照也维持了 80 %的创伤区域。
[0051] 特别地，本发明在不使得创伤收缩的情况下使组织再生，创伤收缩与组织再生和 愈合的概念不同，其通过创伤收缩而使创伤区域变硬且密度变高，从而成为通常的瘤痕组 织。
[0052] 此外，图11示出了利用根据本发明的双层支架对损伤区域处理后I天，对具有双层 支架的部位的组织进行的RT-PCR分析，结果:第1天表达ITGA3，ITGA3为在与ECM(细胞外基 质）蛋白反应的整合蛋白的形成过程中表达的；未显示口 GA3在第5天的表达，化-8在第5天 不表达，证实根据本发明的双层支架不引起免疫应答，并且，CD55的表达升高，其抑制与形 成ECM的主要成分胶原的原纤维(門bril)的C0L16A1、血管内皮生长因子VEGF和血液凝固相 关的炎性物质巧a的形成。
[0053] 因此，根据本发明的双层支架在组织工程学、医学、药学和材料科学领域中广泛地 用作药物、细胞、蛋白和生长因子的递送材料或人工皮肤等，特别是有利地用作用于组织再 生和创伤愈合的组合物。
[0054] 也就是说，通过在由上述制备方法制备的双层支架中培养细胞，可将所述双层支 架用于组织再生和创伤愈合。所述细胞可为选自于由如下细胞所组成的组中的任意一种或 两种W上:软骨细胞、骨细胞、皮肤细胞;并且，可通过在双层支架的上层和下层分别培养不 同的细胞，对所述细胞进行共培养。
[0055] 特别地，可将根据本发明的双层支架施用于皮肤缺陷。换句话说，在由天然聚合物 制得的下层支架中对细胞进行培养，将其用作组织再生层;并将药物加载至由合成聚合物 制得的上层支架，从而在组织再生中阻断细菌感染。所述天然聚合物支架在组织再生过程 中通过生物降解而被去除，所述合成聚合物支架则在组织再生完成时去除。
[0056] 此外，根据本发明的双层支架可通过对两种细胞进行共培养并将其施用至组织 (例如骨和软骨)彼此接触的位点来帮助再生。也就是说，在由天然聚合物制得的下层支架 中培养软骨细胞，并在由合成聚合物制得的上层支架中培养骨细胞，将该双层支架施用至 组织彼此接触的位点，从而帮助组织再生。
[0057] 下文将根据W下实施例对本发明进行更为详细的说明。然而，运些实施例对本发 明并不是限制性的。
[005引实施例
[0059] <实施例1〉制备双层支架
[0060] 1)制备双层支架
[0061] 制备2.5wt%的明胶水性溶液，在80°C下W30化pm进行揽拌。明胶完全溶解后，加 入聚乙締醇(PVA) W使其为lOwt%，并揽拌。加入十二烷基硫酸钢W使其为0.2wt%，并在95 °(：的高溫下W90化pm的高速进行揽拌。将经揽拌的溶液倾倒入培养皿，并在-80°C冷冻干燥 至少24小时，获得海绵状物。将该海绵状物浸溃于含有戊二醒(0.5wt%)的水性溶液中至少 12小时，使其交联。在-80°C再次冷冻干燥，产生双层支架。
[0062] 2)双层支架的沈M和数字图像
[0063] 借助场致发射型扫描电子显微镜(FE-SEM) (S-4100，HITACHI ,LTD)对如上制备的 双层支架进行观测，获得的SEM图像示于图2中；借助场致发射型扫描电子显微镜(FE-WM) (S-4100，HITACHI，LTD)获得的数字图像示于图3中。换句话说，证实了该双层支架W-体化 的形式完全附着，成为没有脱离可能的安全的双层结构支架。
[0064] 3)双层支架的FT-IR图像分析
[00化]借助显微FTIR分光光度计（Spectrum 100 ,PerkinElmer, USA)/成像系统 (Spotlight 200，Perki址Imer，USA)，在含