胞，用浓度为0.0 lM的PBS冲洗3次。
[0143] 2)加入适量TRIzol试剂，室溫放置5min裂解细胞，吹打均匀。
[0144] 3) Wlml/管分装至1.5ml EP管中。每管加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15s，室溫放置2-：3min。
[0145] 4)4°C、12000rpm离屯、15min。
[0146] 5)将上层水相移至干净EP管中，加入0.5ml异丙醇，轻轻混匀，室溫放置IOmin。
[0147] 6)4°C、7500巧m离屯、lOmin。
[0148] 7)弃上清，75 %乙醇洗涂RNA沉淀，7500巧m离屯、5min。
[0149] 8)室溫干燥RNA沉淀，5-lOmin后溶于适量DEPC水。
[0150] 9 )质量分数为1 . 0 %的琼脂糖凝胶电泳检测RM样本的完整性，应用B i O -化Otometer对提取的RNA进行定量测定。
[0151] 3.2逆转录步骤同实施例2。
[0152] 3.3 QPCR扩增步骤同实施例2。
[0153] 4、统计学方法
[0154] 实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是W平均值±标准差的方式来表示， 采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，干扰GRIK3基因表达组与对照组之间的差异采 用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
[01巧]5、结果
[0156] 结果如图 2 显示，相比 siRNAl-GRIK3、siRNA3-GRIK3，siRNA2-GRIK3 能够更有效抑 审化RIK3基因的表达，差异具有统计学意义(P<0.05)。
[0157] 实施例4划痕实验检测转染SiRNA后直肠腺癌细胞增殖、迁移能力
[0158] 1、将HRC-99细胞平铺于六孔板中，每孔密度为5X IO5个，加入含10%胎牛血清的 RPMI1640培养，37 °C，5 % C〇2条件下培养2地。
[0159] 2、转染按照脂质体转染试剂2000(购自于Invitrogen公司）的说明书转染，实验分 为阴性对照组(S iRNA-NC)和实验组(20nM) (S iRNA2-GRIK3) W及空白对照组。
[0160] 3、用IOiil移液枪头在单层细胞上画"一"字痕，用PBS溶液缓慢冲洗3次。分别选取 培养24、48、72h的细胞置于倒置显微镜下观察拍照。计算划痕愈合率=(0h划痕宽度-24h (或4她或72h)划痕宽度VOh划痕宽度X 100%。
[0161] 4、结果
[0162] 结果如表2所示，随着培养时间的增长，siRNA2-GRIK3组的划痕愈合率明显低于 SiRNA-NC组和空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。此结果表明，抑制GRIK3的表达可 W抑制直肠腺癌细胞的迁移增殖，GRIK3促进直肠腺癌细胞的迁移和增殖。
[0163] 表2 siRNA2-GRIK3对HRC-99迁移增殖的影响
[0165] 实施例5 GRIK3基因对直肠腺癌细胞调亡的影响
[0166] 使用流式细胞仪检测GRIK3基因对细胞调亡的影响。
[0167] 1、细胞培养步骤同实施例3。
[016引2、细胞转染步骤同实施例3。
[0169] 3、步骤
[0170] 1)细胞转染72h后，使用预冷PBS洗涂细胞两次，膜酶消化，再用预冷PBS洗细胞两 次，于细胞沉淀中加入预冷70 %乙醇，于4 °C固定过夜。
[0171] 2)细胞染色:离屯、收集细胞，W Iml的PBS洗细胞一次，加入50化1含50iig/ml舰化丙 晚(PI)的PBS，4°C避光解育30min。
[0172] 3)取20化1细胞悬液加入到EP管中，加入IOiil Annexin-V-門TC混匀。
[0173] 4)流式分析：W标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2~3万个细胞，结果用软件 Mod Fit分析，观察调亡细胞百分比。
[0174] 3、统计学方法
[0175] 实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是W平均值±标准差的方式来表示， 采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用的t检验，认为当P<0.05时 具有统计学意义。
[0176] 4、结果：
[0177] 转染siRNA2-GRIK3组的细胞调亡率为(30.39±0.021)%，转染SiRNA-NC组的细胞 调亡率为(7.34±0.15)%，上述差异具有统计学意义(P<0.05)，上述结果表明，GRIK3表达 有利于直肠腺癌细胞存活，通过抑制GRIK3基因的表达可W促进直肠腺癌细胞的调亡。
[0178] 实施例6 Transwe 11侵袭小室实验
[01巧]1、用无血清RPMI1640稀释matrigel胶（稀释比例6:1)，按50iU/孔均匀地铺在 1王11山611小室膜上，在小室另一面涂上10肖/1纤维连接蛋白3〇41。
[0180] 2、实验设为S组：阴性对照组(SiRNA-NC)和实验组(siRNAl-GRIK3) W及空白对照 组，每组设3个复孔。各组细胞经培养化，除对照加2ml RPMI1640培养基外，其余各组加Iml 培养基及Iml指示的培养上清。收集各组细胞2 X IO5个，用40化1无血清RPMI1640稀释，接种 到上室中，将小室置于加有趋化因子(NIH-3T3)60化1的24孔板内，37°C、5%C02解育16h。
[0181] 3、取出小室，小屯、擦掉上室细胞，PBS洗3次，95%乙醇固定，肥染色，显微镜下随机 计数5个视野的细胞数，求出每个视野的平均穿膜细胞数。
[0182] 4、结果
[0183] 实验组（S iRNA2-GRIK3)细胞穿膜数为（38 ± 2)个，阴性对照组（S iRNA-NC)细胞穿 膜数为(97±3)个，空白对照组细胞穿膜数为（105±3)个，实验组与对照组相比，差异具有 统计学意义(P<〇. 05)。运表明GRIK3表达促进直肠腺癌细胞的侵袭和转移。
[0184] 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核屯、思想。应当指出，对于本 领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可W对本发明进行若干改进 和修饰，运些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
【主权项】
1. GRIK3基因在制备治疗直肠腺癌的药物中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物包含GRIK3基因和/或其表达产 物的抑制剂。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抑制剂是针对GRIK3的siRNA。4. 一种用于治疗直肠腺癌的药物，其特征在于，所述药物包括权利要求2或3所述的抑 制剂。 5 .GRIK3在制备诊断直肠腺癌的产品中的应用。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述产品能够通过检测直肠组织中GRIK3 基因的表达水平来诊断直肠腺癌。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述检测直肠腺癌组织中GRIK3基因的表 达水平包括:通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片进行检测。8. 根据权利要求5-7任一项所述的应用，其特征在于，所述产品包括芯片、试剂盒。9. 一种诊断直肠腺癌的产品，其特征在于，所述产品能够通过检测直肠组织中GRIK3基 因的表达水平来诊断直肠腺癌。10. 根据权利要求9所述的产品，其特征在于，所述产品包括芯片、试剂盒。其中，所述芯 片包括基因芯片、蛋白质芯片;所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷 酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测GRIK3基因转录水平的针对GRIK3基因的寡核苷酸 探针;所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的GRIK3蛋白的特异性抗体;所述 试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒;所述基因检测试剂盒包括用于检测 GRIK3基因转录水平的试剂;所述蛋白免疫检测试剂盒包括GRIK3蛋白的特异性抗体。
【专利摘要】本发明公开了一种直肠腺癌的分子标记物GRIK3。本发明通过实验证明GRIK3在直肠腺癌组织中呈高表达，通过检测GRIK3的表达水平可以诊断直肠腺癌，本发明同时公开了GRIK3基因可用于制备治疗直肠腺癌的药物。
【IPC分类】G01N33/68, C12Q1/68, A61P35/00, A61K45/00
【公开号】CN105664162
【申请号】CN201610068833
【发明人】肖枫, 宋宏涛, 杨承刚
【申请人】北京泱深生物信息技术有限公司
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年2月1日