具有电刺激作用的仿生纳米纤维支架制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医用材料和神经组织工程领域，涉及一种静电纺丝技术制备具有电刺激作用的仿生纳米纤维支架。
【背景技术】
[0002]周围神经损伤在临床上十分常见，尤其长段距离的神经缺损修复一直医学界攻克的难题。迄今为止，经历了神经吻合、自体神经移植、同种异体神经移植、自体非神经组织移植和生物材料替代等几个过程，但几种治疗方式各有利弊，未使神经缺损的问题得到根本性的解决。静电纺丝技术制备的混纺支架材料，孔隙率高，比表面积大，可将天然材料和合成材料结构杂化和优势互补，因此具有良好生物相容性和降解性的电纺纳米纤维材料接种种子细胞或生长因子在生物医用材料方面和用于修复神经缺损具有广阔的应用前景。
[0003]静电纺丝技术因其设备简单和可操作性强等优点被广泛研究并应用于制备组织工程支架。采用此技术制备的纳米纤维支架仿生天然细胞外基质，并且孔隙相互连通，具有高孔隙率、高比表面积、较好的力学性能和特定的生物学性能等优点。在组织工程中，支架中相互连通的孔隙有利于细胞长入和新生组织的形成;较高的孔隙率和比表面积有利于细胞的粘附、增殖、迀移和分化。
[0004]理想的神经组织工程支架材料要求具有如下性能:(I)能负载生长因子和活体细胞，从而保证神经修复所需的营养供应；(2)具有良好的生物相容性、生物可降解吸收性，对材料进行加工，能够提高支架材料的力学性，利用支架里面定向分布的纤维结构，引导神经纤维定向生长；(3)有利于代谢产物的交换和营养物质的输送，并保证良好的血液供应；(4)比表面积及孔隙率较高，更能促进细胞的點附、增殖和分化及电刺激作用。
[0005]碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在体内分布广泛，尤其是在神经组织中含量十富且具有广泛的生物学作用，它在血管形成、促进创伤愈合与组织修复、促进组织再生和神经组织生长发育过程中起着十分重要的作用。在周围神经损伤修复的研究中，有资料表明，bFGF可以激活神经细胞、雪旺细胞及成纤维细胞，并促进神经残端的轴突生长，还可以延长培养液中多种外周神经元的存活，刺激胆碱乙酰化酶的合成以及突起的生长，为体外细胞培养提供微环境，但由于bFGF易被酶分解，其在体内作用的发挥需持续长时间与靶细胞受体结合，该发明设计的复合纳米纤维支架可实现bFGF的缓控释释放，充分发挥其神经营养效应，到达提高神经损伤修复的目的
[000?]壳聚糖(chi tosan, CS)是一种阳离子碱性天然多糖，无毒、具有生物功能性、无免疫原性、组织相容性、缓控释作用等优点。研究表明，一些组织细胞易黏附于壳聚糖表面并促进其增殖，还具有药物活性和促进伤口愈合及软、硬组织的重建等生物活性。不足的是其力学性能比较差，单一材料纺丝纤维用于组织与器官的修复不是特别理想。聚乳酸(polylactic acid，PLA)有较好的机械强度及可塑性，可塑造成膜、管以及囊性形状。它是当下应用最多的人工合成材料之一，但由于聚乳酸材料细胞亲和性差，并且降解产物呈酸性，易引发无菌性炎症反应而不利于细胞的生长，使其应用受到限制。通过适当的方法将PLA、壳聚糖、β-TCP三者复合使之兼具多重优点，可制备出多种高性能优良共混物支架材料。
[0007]β-磷酸三钙(β-TCP)化学成分接近生物骨的无机盐成份，其生物相容性好，生物可降解性能优异，降解速率适中，当它被植入人体后，通过物理化学溶解，吞噬细胞吞噬等方式而逐渐被溶解降解，降解出来的钙离子、磷离子可以进入到循环系统参与损伤神经的修复。
【发明内容】
[0008]本发明所要解决的技术问题是提供一种具有电刺激作用的复合仿生纳米纤维支架的制备方法，该仿生纳米纤维支架能够起到支撑细胞生长、引导组织再生、控制组织结构和释放活性因子等作用，从而达到神经组织修复的作用。
[0009]为解决上述技术问题，采用技术方案如下:
[0010]具有电刺激作用的仿生纳米纤维支架制备方法，包括以下步骤:
[0011]I)将β-磷酸三钙(β-TCP)置于直径2-8cm，高0.5-3cm氧化铝环中，在2?8KV/cm-l直流电场作用下，于200?600 °C空气中进行极化0.5?3h，得到极化后的β-TCP ；
[0012]2)聚乳酸(PLA)溶解于有机溶剂，再加入上述极化后的β-TCP粉末，制备得到PLA/β-TCP预电纺液I;在壳聚糖醋酸水溶液(CS)中加入生物活性药物，搅拌分散均匀，制备得到CS/生物活性药物预电纺液2;
[0013]3)以PLA/i3-TCP为皮层预电纺液1，以CS/生物活性药物为芯层预电纺液2，通过同轴电纺丝制备PLA/CS/0-TCP ；
[0014]其中，取两个规格2?1ml的注射器，分别吸取皮层预电纺液I和芯层预电纺液2，插入规格18G?26G的不锈钢针头，调节电压1KV?30KV;
[0015]调节注射栗速率，使注射器中溶液匀速流出，皮层预电纺液I推注流速为0.0I?2ml/h，芯层预电纺液2推进速度0.02?2ml/h，皮层的流速大于芯层；
[0016]取1cmX1cm细质铜网在接地滚轴上作为接收装置，控制喷丝头与接收装置的接收距离10?25cm，得到电纺纤维膜；
[0017]真空干燥12?48h去除溶剂，浸没在EDC和NHS的乙醇水溶液中交联24h，去离子水洗涤、冻干得到仿生纳米纤维支架。
[0018]按上述方案，步骤2)所述有机溶剂为N-N-二甲基甲酰胺与或四氢呋喃或丙酮或氯仿或二氯甲烷的混合。
[0019]按上述方案，步骤2)溶剂中聚乳酸质量浓度为5%?30%，电极化β-TCP质量浓度为2 %?20 % ;壳聚糖醋酸水溶液质量浓度2 %?10 %。
[0020]按上述方案，步骤2)所述的生物活性药物为神经生长因子(NGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、神经营养因子、表皮生长因子中的一种。
[0021 ] 按上述方案，步骤3)所述EDC和NHS浓度均为0.lmol/L，乙醇与水的体积比为7:3?9:1。
[0022]按上述方案，步骤3)电纺丝制备PLA/CS/f3_TCP过程中温度:25?40°C ；相对湿度:30 ?70%。
[0023]按上述方案，所述仿生纳米纤维支架用于外周围神经损伤修复。
[0024]适度电刺激的效果等同于多种生长因子的作用，能有效增强损伤神经的再生，寻求一种具有生物相容性和降解性，同时又有相似于人体的生物电性的生物材料，故引入电极化β-TCP，但β-TCP的不足是其脆性大和不易成型，据仿生原则，在一定条件下，把β-TCP与韧性良好的有机物复合，制备无机/有机复合生物材料，不但能够使β-TCP的脆性问题得到解决，也能够利用有机物使材料的生物学活性得以增强。β-TCP的合成方法主要有水热法、液相沉淀法、溶胶凝胶法以及干法等，其中液相沉淀法以反应平稳，产物粒度均匀、颗粒细小，过程可控性高等优点，因此采用改进后的液相沉淀方法制备β-TCP。制备预电纺液过程利用热致相分离技术和模板法，及同轴电纺过程调节接受装置的转速，可以获得多孔、比表面积大、定向仿生结构。
[0025]设计一种具有电刺激作用的组织工程复合神经支架材料，首先，通过材料组合和改性，运用静电纺丝技术制备出无毒且具有高度的生物相容性和易塑性的可降解纳米纤维仿生材料，然后再选择一种能够提高神经生长能力的物质如神经营养因子、神经生长因子、转化因子、雪旺细胞等，并负载到复合纳米纤维支架材料中，以增加神经支架内容物的方法达到模拟自体神经的目的。
[0026]本发明的有益效果在于:
[0027]电极化β-TCP与其他导电材料相比，易制备、物理化学和生物学性能好，β-TCP降解的时候释放钙离子、磷酸根离子，有望发挥电刺激作用，更好的诱导神经再生，为探索电刺激调控干细胞促周围神经再生的作用机制和改进周围神经修复用材料提供新思路。
[0028]本发明制备的具有电刺激的纳米纤维支架具有双层内部结构、表面积大可以实现对神经营养因子及各类药物的适时、适量的控制释放，生物相容性好，性能稳定易于保存，在外周围神经损伤修复等生物医学领域中具有良好的应用前景。
[0029]本发明采取的方法操作简单，工艺省时，原材料价格适中易获得，反应条件温和，绿色友好，经济性好，适于工行业生产。
【具体实施方式】
[0030]为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
[0031]β-磷酸三钙的制备
[0032]以Ca/P摩尔比为1:1.5，将(NH4)2HPO3滴加到Ca(NO3)2水溶液中，充分搅拌后向溶液中加入聚苯乙烯(分散剂)，制成混合液，并且置于水浴锅中，保持35?38°C，强力搅拌下，在上述搅拌过程中，加入PH调节剂(氨水)，调节PH为7.0，静置过夜，得到悬浮液，减压抽滤，乙醇洗涤，得到滤饼，放入120 0C干燥箱中干燥12h，得到β-TCP粉末。将粉末放人马弗炉中。在8000C下，煅烧2h，随炉冷却，从炉中取出，得到β-TCP粉末。研磨，控制β-TCP粉末的粒径为1nm?10nm0
[0033]下述实施案例中制备的同轴电纺丝纤维支架(PLA/CS/i3-TCP)中所用的聚乳酸分子量为5 X 14?4 X 15，壳聚糖分子量为1.0 X 14?3.0XlO50
[0034]实施例1:
[0035](I)将磷酸三钙(β-TCP)置于直径2cm，高0.5?11氧化铝环中，在21^/011—1直流电场作用下，100°C空气中进行极化I小时，得到的极化后的β-TCP，备用。
[0036](2)室温下，以二氯甲烷