一组与Th17分化相关的micro RNA在制备治疗和疗效判断药物中的应用
【专利摘要】本发明提供了一组与Th17分化相关的micro RNA，包括micro RNA 4426、micro RNA 3615、micro RNA 106b、micro RNA 590及micro RNA 573。上述micro RNA在Th17分化过程中发生了显著变化，可作为调控Th17的靶点，用于制备治疗或预防Th17相关疾病的药物，包括用于治疗红斑狼疮、皮肌炎、血管炎、干燥综合征、类风湿性关节炎、银屑病型关节炎、强制性脊柱炎、硬皮病、多发性硬化、疟疾、日光性皮炎、湿疹、白癜风、银屑病、异位性皮炎、扁平苔藓、糖尿病、冠心病和高脂血症等。该组micro RNA对羟氯喹干预敏感，可作为羟氯喹临床疗效判断的敏感指标，micro RNA临床检测方便，可快捷的用于判断羟氯喹的临床疗效。
【专利说明】
一组与Th17分化相关的micro RNA在制备治疗和疗效判断药物中的应用
技术领域
[0001 ]本发明涉及生物技术领域，具体地说，是一组与Thl7分化相关的micro RNA作为标靶在诊断和/或治疗由IL-17介导的自身免疫疾病和慢性炎症性疾病、以及作为羟氯喹临床疗效判断的诊断试剂中的应用。
【背景技术】
[0002]分泌IL-17的⑶4+T细胞(Thl7)是一群CD4+T细胞亚群，其主要通过分泌白细胞介素-17A(IL-17A)，白细胞介素-17F(IL-17F)，肿瘤坏死因子-a(TNF-a)和白细胞介素-6(IL-6)等细胞因子介导炎细胞对组织的浸润和损伤；同时Thl7细胞也可以分泌细胞毒物质直接损伤组织。大量研究表明Thl7细胞在一些自身免疫性疾病如:红斑狼疮、皮肌炎、血管炎、干燥综合征、硬皮病、类风湿性关节炎、银肩病型关节炎、强制性脊柱炎和多发性硬化，慢性炎症性疾病如:日光性皮炎、湿疹、白癜风、异位性皮炎、扁平苔藓、糖尿病和高脂血症发病中发挥重要作用。Th 17在广泛的自身免疫性疾病和慢性炎症性疾病发病中发挥关键作用，抑制Thl7分化或拮抗Thl7效应已经成为目前广泛关注的热点。在风湿性关节炎、牛皮癣、哮喘、炎症性肠炎等自免疫疾病中，Thl7细胞的特征细胞因子IL-17表达上调，而抑制IL-17表达和Thl7细胞形成可以减轻自免疫疾病的发生或临床严重程度(Bowmanetal.，2006;Kiklyetal.，2006)。近年来国外医药企业已经不断研发出针对IL-17的中和抗体用来治疗自身免疫性疾病和慢性炎症性疾病，因此可见Thl7和其效应分子可作为免疫炎症性疾病治疗靶点，以及疗效评价的关键分子之一。
[0003]羟氯喹最早发现是用来治疗疟疾的4-氨基喹酮类的化合物。越来越多临床研究证实羟氯喹可广泛应用于治疗红斑狼疮、皮肌炎、血管炎、干燥综合征、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病;也可应用于湿疹、结节性痒疹、扁平苔藓、日光性皮炎等皮肤病的治疗;近年来发现羟氯喹也具有降血脂和降血糖的作用。羟氯喹广泛应用于临床，目前认为羟氯喹治疗疾病的主要机制包括抗炎、免疫调节、抗增生、减低皮肤对紫外线的敏感性、抗血小板聚集、抗病原微生物作用、抗高血脂等作用。羟氯喹在风湿病学中属于慢作用药物，临床治疗的一重要缺点是起效较慢，一般起效时间在4-12周不等。因为羟氯喹缺少可靠、灵敏和早期的疗效预测指标或模型，患者和医师在羟氯喹治疗过程中无法早期判断疗效而都会丧失信心，不利于正确而合理的使用和判断是否继续羟氯喹维持治疗。因此寻找能早期、有效而可靠评判羟氯喹治疗效果的分子生物学指标具有切实的临床意义和广阔的临床推广应用价值。通过研究我们发现羟氯喹具有抑制Thl7的作用，因此我们推测Thl7分化过程中的关键分子可作为判断羟氯喹的临床疗效的有效生物标记物。
[0004]MicroRNA是一类由内源基因编码的长度约为22_24个核苷酸的非编码单链RNA分子，它们在转录后基因表达调控中发挥重要的负向调控作用。每个microRNA可以调控多个靶基因，其在细胞分化，生物发育及疾病发生发展过程中发挥巨大作用。通过高通量测序可对microRNA和疾病之间的关系进行研究，也可发现与疾病预后或对药物治疗敏感的microRNA。因此microRNA可作为疾病预后判断的新的生物学标记，对革El基因有特异性调控的microRNA也可成为药靶进行新药研发，这将可能会给人类疾病的治疗提供一种新的手段。
[0005]中国专利201410349266.7公开了一种非编码小RNA基因miR-20b在制备抗炎药物中的应用，所述炎症是主要由反应性Thl7细胞广泛参与并发挥重要致病作用的炎症反应，该miR-20b在反应性Thl7细胞中特异性低表达，且分别给naive⑶4+T细胞转染miR-20b模拟体或miR-20b阴性对照后，miR-20b模拟体能够显著减少细胞因子白介素17A基因水平以及蛋白水平表达，且miR_20b不改变Thl7细胞增殖和凋亡的水平。中国专利200910194914.5公开了一种小RNA-326在制备药物中的应用，其提供了用于治疗由IL-17介导的自身免疫疾病的核酸序列、载体和药物组合物，还提供了筛选治疗由IL-17介导的自身免疫疾病的潜在物质的方法。然而，关于本发明的与Thl7分化相关的micro RNA，及其作为标革E在诊断和/或治疗由IL-17介导的自身免疫疾病、以及作为羟氯喹临床疗效判断的诊断试剂中的应用，目前还未见相关报道。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供micro RNA 4426、micro RNA 3615、micro RNA 106b、micro RNA 590、micro RNA 573的用途。
[0007]为实现上述目的，本发明采取的技术方案是:
[0008]micro RNA 4426、micro RNA 3615、micro RNA 106b、micro RNA 590、micro RNA573或其抑制剂在制备治疗和/或预防Thl7相关的疾病药物中的应用。
[0009]micro RNA 4426、micro RNA 3615、micro RNA 106b、micro RNA 590或micro RNA573在制备Thl7相关的疾病预后判断试剂中的应用。
[0010]micro RNA 4426、micro RNA 3615、micro RNA 106b、micro RNA 590或micro RNA573在制备调控Thl7分化药物或试剂中的应用。
[0011]micro RNA 4426、micro RNA 3615、micro RNA 106b、micro RNA 590或micro RNA573在制备羟氯喹对IL-17介导的自身免疫疾病和慢性炎症性疾病患者临床疗效判断试剂中的应用，所述临床疗效判断试剂通过检测micro RNA 4426、micro RNA 3615、micro RNA106b、micro RNA 590、micro RNA 573的表达水平对羟氯喹治疗效果进行判断。
[0012]micro RNA 4426、micro RNA 3615、micro RNA 106b、micro RNA 590或micro RNA573在制备用于诊断由IL-17介导的自身免疫疾病和慢性炎症性疾病的诊断试剂中的用途，所述诊断试剂通过检测micro RNA 4426、micro RNA 3615、micro RNA 106b、micro RNA590,micro RNA 573的表达水平对自身免疫疾病和慢性炎症性疾病进行诊断。
[0013]micro RNA 4426、micro RNA 3615、micro RNA 106b、micro RNA 590或micro RNA573在制备幼稚性T细胞向Thl7分化的检测试剂中的应用，所述检测试剂通过检测microRNA4426、micro RNA 3615、micro RNA 106b、micro RNA 590、micro RNA 573的表达水平进行检测。
[0014]所述Thl7相关的疾病或自身免疫疾病和慢性炎症性疾病如红斑狼疮、皮肌炎、血管炎、干燥综合征、类风湿性关节炎、硬皮病、多发性硬化、疟疾、日光性皮炎、湿疹、异位性皮炎、银肩病、白癜风、扁平笞藓、糖尿病、冠心病或尚脂血等。
[0015]所述表达水平为外周血中microRNA 4426、micro RNA 3615、micro RNA 106b、micro RNA 590或micro RNA 573的表达水平。
[0016]本发明提供了一组与Thl7分化相关的micro RNA，包括micro RNA 4426、microRNA 3615、micro RNA 106b、micro RNA 590及micro RNA 573。上述micro RNA在Thl7分化过程中发生了显著变化，可作为调控Thl7的靶点，用于制备治疗或预防Thl7相关疾病的药物，包括用于治疗红斑狼疮、皮肌炎、血管炎、干燥综合征、类风湿性关节炎、银肩病型关节炎、强制性脊柱炎、硬皮病、多发性硬化、疟疾、日光性皮炎、湿疹、银肩病、白癜风、异位性皮炎、扁平笞藓、糖尿病、冠心病和高脂血症等。该组micro RNA对轻氯喹干预敏感，可作为轻氯喹临床疗效判断的敏感指标，micro RNA临床检测方便，可快捷的用于判断羟氯喹的临床疗效。
[0017]本发明的技术方案是:
[0018](I)提供与Thl7分化密切相关的一组关键micro RNA，包括micro RNA 4426、microRNA 3615、micro RNA 106b、micro RNA 590、micro RNA 573等五个，该组micro RNA可作为疾病治疗的靶点；
[0019](2)该组micro RNA对羟氯喹治疗敏感，可作为生物标记物早期敏感的判断羟氯喹的治疗效果；
[0020](3)该组micro RNA可作为治疗靶点或开发为药物应用于红斑狼疮、皮肌炎、血管炎、干燥综合征、硬皮病、多发性硬化、类风湿性关节炎、银肩病型关节炎、强制性脊柱炎、湿疹、银肩病、结节性痒疹、异位性皮炎、白癜风、扁平苔藓、日光性皮炎、高血脂和糖尿病等的治疗。也可作为羟氯喹治疗疾病的疗效判断指标。
[0021 ] 本发明以Thl7为革El点，发现与Thl7分化相关的一组micro RNA，并发现该组microRNA可作为羟氯喹干预Thl7的敏感靶点。这一组micro RNA可作为Thl7相关疾病治疗的靶点或开发为药物应用于疾病的治疗，也可作为羟氯喹治疗疾病的疗效判断指标。
[0022]本发明优点在于:
[0023]1、新颖:本发明发现了新的5个与Thl7分化相关的micro RNA，包括micro RNA4426、micro RNA 3615、micro RNA 106b、micro RNA 590、micro RNA 573，这组micro RNA可作为调控Thl7的靶点，开发用于治疗Thl7相关的自身免疫性疾病和慢性炎症性疾病的药物。
[0024]2、可靠:micro RNA4426、micro RNA 3615、micro RNA 106b、micro RNA 590、micro RNA 573在Thl7分化中表达显著差异，而羟氯喹干预后也发生显著的变化。表明该五个micro RNA可作为羟氯喹干预Thl7分化的有效而可靠的靶点，故可作为羟氯喹临床疗效判断的敏感指标，并开发成试剂盒，方便快捷的判断轻氯喹的临床疗效。
[0025]3、方便快捷:临床应用过程中只需要抽取少量外周血，提取RNA，通过实时定量聚合酶联反应就可以方便快捷而高通量的进行检测micro RNA。
[0026]4、临床应用和推广前景广阔:Thl7与一系列自身免疫性疾病或慢性炎症性疾病如红斑狼疮、皮肌炎、血管炎、干燥综合征、类风湿性关节炎、银肩病型关节炎、强制性脊柱炎、硬皮病、多发性硬化、疟疾、日光性皮炎、湿疹、异位性皮炎、银肩病、白癜风、扁平苔藓、糖尿病、冠心病和高脂血症发病密切相关，而micro RNA4426、micro RNA3615、micro RNA 106b、micro RNA 590、micro RNA 573与Thl7分化密切相关。因此该组micro RNA可作为上述疾病治疗靶点，也可把该micro RNA开发为药物用于上述疾病的治疗，同时可以用来该类疾病病情活动和预后的判断。
【附图说明】
[0027]附图1为流式细胞仪检测羟氯喹体外能抑制Thl7的分化。
[0028]附图2为流式细胞仪检测羟氯喹体外能时间依赖的抑制Thl7的分化。
[0029]附图3为转录组测序研究幼稚性T细胞诱导向Thl7后的差异基因表达谱。
[0030]附图4为测序结果，提示轻氯喹对Thl7分化过程中micro RNA4426、micro RNA3615、micro RNA 106b、micro RNA 590、micro RNA 573的调控作用。
【具体实施方式】
[0031]下面结合【具体实施方式】，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0032]本发明通过以下实验证实羟氯喹抑制Thl7分化，并对Thl7分化过程中的5个关键Micro RNA发挥显著的调控作用。
[0033]实施例1羟氯喹对幼稚性T细胞向Thl7分化的影响
[0034]从健康人外周血中分选外周血单个核细胞，通过流式细胞仪进一步分选CD4+幼稚性T细胞进行体外培养。第O天，将分选到的幼稚性CD4+T细胞重悬于含10 %胎牛血清的RPMI1640培养基，加入ant1-CD3/CD28活化磁珠(5yl/ml)、IL-10(5Ong/ml)、TGF_0( lng/ml)、IL-6(30ng/ml)、IL-23(30ng/ml)、ant1-1L_4(5ng/ml)、ant1-1L_12(5ng/ml)和ant1-1L-2(20U/ml)进行诱导分化;第6、9天半量换液，补充相应的细胞因子;第12天，收获细胞。羟氯喹干预组在培养的第O天加入20μΜ的羟氯喹，半量换液时补充羟氯喹。结果提示幼稚性T细胞可以被有效的诱导向Th 17分化，而羟氯喹可有效抑制Th 17的分化。结果如图1所示。该图说明了羟氯喹能够体外抑制幼稚性T细胞向Thl7转化。
[0035]实施例2羟氯喹时间依赖的抑制幼稚性T细胞向Thl7分化
[0036]于第O天，将分选到的幼稚性⑶4+T细胞重悬于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，加入ant1-Q)3/a)28活化磁珠(5yl/ml)、IL_10(5Ong/ml)、TGF_P(lng/ml)、IL_6(30ng/ml)、IL_23(30ng/ml)、ant1-1L_4(5ng/ml)、ant1-1L-12(5ng/ml^Pant1-1L-2(20U/ml)jJ行诱导分化;第6和12天，分别收获细胞，12天组于第6天半量换液，补充相应的细胞因子和羟氯喹。结果提示细胞因子可时间依赖的诱导Thl7的分化，而羟氯喹可时间依赖的抑制Thl7的分化。结果如图2所示。该图说明了羟氯喹能够时间依赖的抑制幼稚性T细胞向Thl7转化。
[0037]实施例3幼稚性T细胞向Thl7诱导分化后的差异表达基因
[0038]从健康人外周血中分选外周血单个核细胞，通过流式细胞仪进一步分选CD4+幼稚性T细胞进行体外培养。于第O天，将分选到的幼稚性CD4+T细胞重悬于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，加入311衍-003/^028活化磁珠(541/1111)、11^-10(50叫/1111)、了6卩-0(1即/ml)、IL_6(30ng/ml)、IL_23(30ng/ml)、ant1-1L_4(5ng/ml)、anti_IL_l2(5ng/mlWPant1-IL-2( 20U/ml)进行诱导分化;第6、9天半量换液，补充相应的细胞因子;第12天，收获细胞。通过华大基因行RNA-Seq 了解基因表达情况。具体步骤为提取样品总RNA并使用DNaseI消化DNA后，用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA，向得到的mRNA中加入适量打断试剂高温条件下使其片断化，再以片断后的mRNA为模板，合成cDNA，经过磁珠纯化、末端修复、3’末端加碱基A、加测序接头后，进行PCR扩增，从而完成整个文库制备工作。构建好的文库用Agilent2100B1analyzer和ABI StepOnePlusReal-Time PCR System进行质量和产量检测，文库质控合格后进行测序。质控后，经过滤得到的clean reads比对到参考序列。然后进行基因定量分析、基于基因表达水平的各项分析(主成分、相关性、条件特异表达、差异基因筛选等等)，并对筛选出的样品间差异表达基因，进行GO功能显著性富集分析、pathway显著性富集分析、聚类、蛋白互作网络和转录因子等更深入的挖掘分析。结果提示一共1812个基因发生了表达异常，其中1151个基因上调，661个基因表达下调，结果如图3所示。该图说明了幼稚性T细胞向Thl7诱导过程中大量的基因发生了显著的转录变化。
[0039]实施例4羟氯喹调控Thl7分化过程中的5个关键Micro RNA
[0040]如上所述，T细胞诱导向Th17分化，在分化过程中加入羟氯喹，培养12天。收集细胞，提取RNA，通过华大基因RNA-Seq 了解羟氯喹干预后的差异基因表达情况。通过对测序结果分析我们发现羟氯喹影响了 59个关键基因，37个基因上调，22个基因下调。进一步分析发现micro RNA4426、micro RNA 3615、micro RNA 106b、micro RNA 590、micro RNA 573等五个micro RNA在轻氣卩奎干预Thl7后发生了显著变化，其中micro RNA4426、micro RNA 3615和micro RNA 106b显著下调，而micro RNA 590和micro RNA 573显著上调，结果如图4所不。该图说明了micro RNA4426、micro RNA3615、micro RNA 106b、micro RNA 590、microRNA 573五个micro RNA在幼稚性T细胞向Thl7诱导过程中发生了显著的变化，而羟氯喹能显著的逆转其变化，提示该五个micro RNA对羟氯喹的干预敏感，可作为羟氯喹治疗效果的敏感指标。
[0041]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.microRNA 4426、micro RNA 3615、micro RNA 106b、micro RNA 590、micro RNA573在制备治疗和/或预防Thl7相关的疾病药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Thl7相关的疾病为红斑狼疮、皮肌炎、血管炎、干燥综合征、硬皮病、多发性硬化、类风湿性关节炎、银肩病型关节炎、强制性脊柱炎、疱疾、日光性皮炎、湿疹、异位性皮炎、银肩病、白癜风、扁平苔藓、糖尿病、冠心病或高脂血症。3.microRNA 4426、micro RNA 3615、micro RNA 106b、micro RNA 590或micro RNA573在制备Thl7相关的疾病预后判断试剂中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述Thl7相关的疾病为红斑狼疮、皮肌炎、血管炎、干燥综合征、硬皮病、多发性硬化、类风湿性关节炎、银肩病型关节炎、强制性脊柱炎、疱疾、日光性皮炎、湿疹、异位性皮炎、银肩病、白癜风、扁平苔藓、糖尿病、冠心病或高脂血症。5.microRNA 4426、micro RNA 3615、micro RNA 106b、micro RNA 590或micro RNA573在制备调控Thl7分化药物或试剂中的应用。6.microRNA 4426、micro RNA 3615、micro RNA 106b、micro RNA 590或micro RNA573在制备羟氯喹对IL-17介导的自身免疫疾病患者临床疗效判断试剂中的应用，所述临床疗效判断试剂通过检测micro RNA 4426、micro RNA 3615、micro RNA 106b、micro RNA590,micro RNA 573的表达水平对羟氯喹治疗效果进行判断。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述表达水平为外周血中microRNA4426、micro RNA 3615、micro RNA 106b、micro RNA 590或micro RNA 573的表达水平。8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述免疫炎症性疾病如红斑狼疮、皮肌炎、血管炎、干燥综合征、类风湿性关节炎、硬皮病、疟疾、日光性皮炎、湿疹、异位性皮炎、扁平苔藓、糖尿病、冠心病或高脂血症。9.microRNA 4426、micro RNA 3615、micro RNA 106b、micro RNA 590或micro RNA573在制备用于诊断由IL-17介导的自身免疫疾病和慢性炎症性疾病的诊断试剂中的应用，所述诊断试剂通过检测micro RNA 4426、micro RNA 3615、micro RNA 106b、micro RNA590,micro RNA 573的表达水平对自身免疫疾病和慢性炎症性疾病进行诊断;所述自身免疫疾病和慢性炎症性疾病如红斑狼疮、皮肌炎、血管炎、干燥综合征、类风湿性关节炎、银肩病型关节炎、强制性脊柱炎、硬皮病、多发性硬化、疟疾、日光性皮炎、湿疹、异位性皮炎、银肩病、白癜风、扁平笞藓、糖尿病、冠心病或尚脂血。10.microRNA 4426、micro RNA 3615、micro RNA 106b、micro RNA 590或micro RNA573在制备幼稚性T细胞向Thl7分化的检测试剂中的应用，所述检测试剂通过检测microRNA 4426、micro RNA 3615、micro RNA 106b、micro RNA 590、micro RNA 573的表达水平进行检测。
【文档编号】A61P17/00GK105879061SQ201610407015
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年6月8日
【发明人】杨骥, 李明
【申请人】复旦大学附属中山医院