抗肌醇代谢药在构建神经管畸形小鼠模型中的应用
【专利摘要】本发明提供了一种获得神经管畸形(NTDs)小鼠模型的方法，在孕鼠胚胎发育至开始形成神经管时，将抗肌醇代谢药物施加给孕鼠，从而构建神经管畸形小鼠模型。该小鼠模型可用于神经管畸形的医学和生物学研究，有助于了解人类NTDs的病因及发病机制，为进一步研究肌醇代谢障碍在NTDs发生中的作用机制提供模型。并且，本发明方法神经管畸形率高、吸收胎少、对胚胎致死率低，并且对孕鼠毒副作用小。
【专利说明】
抗肌醇代谢药在构建神经管崎形小鼠模型中的应用
技术领域
[0001] 本发明设及一种构建神经管崎形小鼠模型的方法，尤其设及一种抗肌醇代谢药物 的应用，W及使用该药物构建神经管崎形小鼠模型的方法。
【背景技术】
[0002] 神经管崎形(Neural化be Defects,NTOs)是指在胚胎发育早期，由于遗传倾向和 环境因素的影响，神经管闭合不全而引起的一组出生缺陷，主要表型包括无脑儿、脊柱裂及 脑或脑脊膜膨出等，是胎儿和新生儿中最常见、最严重的中枢神经系统先天崎形，全世界范 围内发病率为〇.〇5%-〇.2%"NTDs危害极大，如无脑儿，脑膨出和烦脊柱裂的胎儿常常死产 或出生后很快死亡;而脊柱裂患儿虽然可W存活，但会导致神经功能缺损，设及感觉缺失、 无能力行走、尿失禁及脑积水等症状，严重影响患儿的生理发育和生活质量，也给患者家庭 带来称重的经济与精神负担。
[0003] 因此，建立合适的动物模型有助于了解人类NTDs的病因及发病机制，并且对于孕 前合理的预防干预减少NT化的发生具有重要的意义。
[0004] 除叶酸外，围孕期肌醇（inositol)缺乏与NTDs发生密切相关，目前通过限制食物 摄入肌醇直接建立肌醇缺乏的NTOs动物模型尚未见成功报道，虽然Greene等在小鼠怀孕期 间进行低肌醇饮食喂养已发现肌醇缺乏可导致死胎死产、发育迟缓及胚胎体重减轻等现象 产生，但是并未出现NTDs及其它出生缺陷等表型，运是因为动物体内营养状况及肌醇饮食 较难控制，短时间肌醇不足，动物可通过自身代偿机制，提高体内肌醇合成来满足机体的需 要。而利用基因敲除构建动物模型，目前设及到的有关基因已有200多种，但运些利用基因 工程技术构建的NTDs模型有破坏基因组结构的倾向。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了一种获得神经管崎形小鼠模型的方法，该小鼠模型可用于神经管崎 形的医学和生物学研究，有助于了解人类NTDs的病因及发病机制。
[0006] 本发明第一个方面是提供一种获得神经管崎形小鼠模型的方法，包括:提供孕鼠， 在胚胎发育至开始形成神经管时，对孕鼠施加抗肌醇代谢药物。
[0007] 本发明第二个方面是提供一种抗肌醇代谢药物在构建神经管崎形小鼠模型中的 应用，更优选为在制备构建神经管崎形小鼠模型试剂中的应用，包括：
[000引在孕鼠胚胎发育至开始形成神经管时，将抗肌醇代谢药物施加给孕鼠。
[0009]其中，所述抗肌醇代谢药物优选为裡盐，优选为能够在小鼠体内解离出Li +的裡 盐，更优选为包括但不限于碳酸裡、尿酸裡、构缘酸裡、醋酸裡、漠化裡中的任意一种或几 种，并优选为碳酸裡。
[0010] 其中，所述孕鼠选自C57BL/6 J小鼠。
[0011] 其中，所述施加可W优选为注射，更优选为腹腔注射。
[0012] 在本发明的一种优选实施例中，在胚胎发育7.5天时将抗肌醇代谢药物施加给孕 赢D
[0013] 在本发明的一种优选实施例中，抗肌醇代谢药物的给药剂量选自300-370mg/kg孕 鼠体重，更优选为320-350mg/kg孕鼠体重，更优选为330-350mg/kg孕鼠体重。
[0014] 在本发明的一种优选实施例中，所述小鼠选自7-8周龄成年小鼠。
[0015] 在本发明的一种优选实施例中，所述小鼠选自SPF级小鼠。
[0016] 在本发明上下文内容中，没有特别说明的情况下，所述胚胎发育计算时间为:发现 阴栓的第二天早晨8:00定义为孕0.5天，即胚胎发育0.5天。
[0017]在本发明上下文内容中，没有特别说明的情况下，剂量mg/kg或mg/kg体重均指的 是mg/kg孕鼠体重。
[0018] 本发明建立了肌醇代谢障碍NTOs出生缺陷小鼠模型，为进一步研究肌醇代谢障碍 在NTOs发生中的作用机制提供模型。并且，本发明方法神经管崎形率高、吸收胎少、对胚胎 致死率低，并且对孕鼠毒副作用小。
【附图说明】
[0019] 图1为本发明实施例中血清肌醇代谢检测结果；
[0020] 图2为Li2〇)3引起的正常和发育异常胚胎；
[0021] 图3为Li2〇)3引起的正常和发育异常胚胎肥染色结果；图3A为正常和NTOs小鼠胚胎 端脑的病理结果；图3B为正常和NTOs小鼠胚胎后脑的病理结果;a和b分别为胚胎形态；
[0022] 图4为Li2〇)3引起的神经管崎形照片，其中图4A和4B为正常胚胎侧面和背面神经管 照片，4C和4D为NTDs胚胎正面和侧面神经管照片。
【具体实施方式】 [002；3] 实施例1
[0024] 实验材料；
[0025] 7-8周龄SPF级成年巧7BL/6J小鼠适应性喂养后，将雌鼠与雄鼠按1:1或2:1的比例 合笼过夜。
[0026] 第二天清晨检查雌鼠阴道口有无阴栓，存在阴栓表示有过交配行为，将发现阴栓 的第二天早晨8:00定为孕0.5天巧0.5天），然后孕鼠分笼饲养，随机分为实验处理组和对照 组。
[0027] 在孕7.5天化7.5天)时，给予实验组雌鼠不同剂量（l〇〇mg/kg-400mg/kg)的Li2C〇3 腹腔注射，正常对照组雌鼠给予等体积的生理盐水。
[00%]怀孕13.5化13.5天)天时，对孕鼠进行摘眼球采血;采血后的小鼠 W颈椎脱白法处 死，腹部向上置于手术台上，75%酒精消毒。沿腹中线剖腹取出妊娠子宫，将子宫成串取下 置于盛有预冷PBS的培养皿中，体视显微镜下小屯、取出胚胎，并仔细观察每窝胚胎，记录活 胎数、死胎数、吸收胎数、崎形胎数，观察体视显微镜下可见的崎形情况。
[0029] 一、Li2〇3 剂量实验
[0030] 在100mg/kg-400mg/kg区间进行剂量条件实验。表1，表2反映了交配后E7.5天腹腔 注射不同剂量Li2C〇3,在E13.5天取材时观察到的胚胎发育情况。
[0031] 表1结果显示Li2C〇3剂量在250mg/kg、300mg/kg和400mg/kg均出现崎形胚胎，崎形 表型包括无眼崎形和NTDs，其中300mg/kg剂量的崎形比率最高为12.1%DLi2C〇3剂量在 250mg/kg和300mg/kg体重小鼠的存活率差异不大，分别为69.6%和63.6%，而在400mg/kg 剂量的小鼠存活率有上升的趋势，因此最佳建模剂量应在250mg/kg和400mg/kg之间。
[0032] 表1，Li2〇)3剂量对构建NTOs模型的影响(括号内为百分比）
[0033]
[0034] ~表1中，*表示无眼崎形，#表示神经管崎形(NTOs) ' '
[0035] 表2,建立小鼠模型最佳剂量(括号内为百分比）
[0036]
[0037] 表2中，*表示眼部崎形;#表示唇裂;§表示发育迟缓;&表示颜面崎形
[003 引表 2 结果显示 Li2C03 剂量在 250mg/kg、300mg/kg、330mg/kg 和 350mg/kg 体重时，随着 药物剂量增加，胚胎崎形率的比率出现增高的趋势，350mg/kg体重组崎形率的比率明显增 高，达到了50 %。然而，Li2C03剂量在370mg/kg和400mg/kg体重时，崎形率的比率却出现下降 趋势。350111旨/1^体重组^化的发生率最高，达到了26.7%，其他崎形的发生率也高于其他实 验组，且无死胎。
[0039] 选择Li2〇)3 350mg/kg体重剂量作为造模剂量，并进行了重复试验，结果如表3所 示，各批次之间差异不显著(P〉〇.05)。说明此剂量的重复性好。
[0040] 表3，Li2〇)3 350mg/kg体重剂量诱导NTD重复实验结果(括号内为百分比）
[0041]
[0042] 表3中，*表示眼部崎形;#表示唇裂;§表示发育迟缓;&表示颜面崎形
[0043] 另外，孕鼠未发现毒副作用导致死亡。
[0044] 实施例2
[0045] 参照实施例1，CD-1孕鼠在孕8天巧8天)时，注射Li2〇)3，300mg/kg体重剂量W下，未 发现对孕鼠的明显毒副作用，给药剂量350mg/kg体重时，孕鼠出现毒副作用导致死亡率 13.3%，如表4所示。
[0046] 表4，不同剂量Li2C〇3对CD-1孕鼠毒副作用
[0047]
[0化0] 表5也证明了裡盐能够用于构建神经管崎形模型，但是相比于实施例1中的巧7BL/ 6J小鼠，CD-1小鼠神经管崎形发生率明显更低一些，而且吸收胎比例相对较高。另外，裡盐 对CD-1孕鼠毒副作用更强。
[0051 ] 二、小鼠模型鉴定
[0052] 为了确定Li2〇)3抑制IMPase活性后肌醇的代谢水平，本研究应用GC-MS技术检测了 实施例1中E7.5天母鼠在腹腔注射Li2C化350mg/kg体重剂量之后，不同时间点母鼠血清中 肌醇含量的改变。即检测母鼠血清在注射Li2〇)3后0(注射Li2〇)3前）、4、8、1化时肌醇的水 平，结果如图1显示:肌醇水平在4-化后降到最低，仅为正常血清的1/2,之后开始恢复，但在 注射Li2〇)3 1化后，肌醇水平仍低于正常水平。
[0053] 体视显微镜下观察小鼠胚胎外部发育情况，结果如图2显示。E13.5天正常小鼠胚 胎（图2A为正常胚胎脊柱、B为正常胚胎侧面)外观较为饱满圆滑，头部前、中、后脑室均已形 成，脊柱表面完整无裂口，神经管闭合完全，可见明显的耳泡、眼泡，尾部弯曲细长。此外，正 常活胚胎在镜下可W观察到屯、脏搏动。崎形胚胎均有不同程度的发育迟缓，表现为身长比 正常胚胎短，体重比正常胚胎低，发育迟滞，仅相当于E12.5左右的发育状态。NTOs崎形胚胎 中，露脑(前脑和全脑)崎形（图2C为神经管未闭合前脑崎形、D为神经管未闭合全脑崎形）的 发生率最高，可见少数NTOs表现为脊柱裂（图沈为神经管未闭合脊柱崎形）；除了 NTOs外，还 观察到无眼崎形（图2F)、颜面部(烦面部)崎形（图2G)和发育迟缓（图2H)。
[0054] Li2〇)3引起胚胎神经管发育异常的病理改变结果见图3。低倍镜(40X)下，正常对 照组小鼠神经管发育良好，管腔形状规则，神经上皮的内、外界膜平整，神经管均闭合，已经 分化为明显的端脑、中脑和后脑，且神经管周围的间充质细胞分布均匀密集(图3A中a-1、图 3B中a-1)。露脑崎形小鼠胚胎端脑虽然已经分化发育，但是端脑神经管完全没有闭合，神经 腔面不平整，管壁薄厚不一致，各脑室形状不规则，同时中脑神经管也未闭合(图3A中b-1); 正常胚胎后脑室为规则菱形，而露脑崎形胚胎的后脑顶板未融合，呈"一字"腔室形状，仅被 一层羊膜和间质所包裹(图3B中b-1)。
[00对在100 X和200 X放大倍数下，正常神经管的神经上皮细胞和间质层细胞排列整齐 紧密，且神经上皮室管膜边缘整齐，未见有脱落的细胞（图3A和3B中的a-2、a-3)。而NTDs神 经上皮细胞和间质层细胞排列素乱，细胞核小，神经上皮室管膜边缘不整齐，可见有脱落的 细胞，并且存在多处血管破裂，血细胞外渗进入中胚层结构，运种病理变化在端脑表现的尤 为显著，且端脑神经管未闭合程度更严重（图3A和3B中的b-2、b-3)。病理结果显示，肌醇缺 乏可能影响神经管Closed或前后脑神经孔融合更严重，导致崎形表型多为露脑崎形。
[0056] 为了进一步验证，采用体式显微镜观察胚胎发育第9.5天时神经管发育状态，结果 如图4所示。相比于正常胚胎（图4A和B)，NTOs胚胎神经管发育明显出现崎形（图4C和D)。
[0057] 综上所述，本发明构建神经管崎形小鼠模型的方法，能够获得理想的小鼠模型，崎 形率高、重复性好，对孕鼠毒副作用小，对胚胎致死率低。
[0058] W上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限 制于W上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和 替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和 修改，都应涵盖在本发明的范围内。
【主权项】
1. 一种获得神经管畸形小鼠模型的方法，其特征在于，包括： 提供孕鼠，在胚胎发育至开始形成神经管时，对孕鼠施加抗肌醇代谢药物。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在孕鼠胚胎发育至开始形成神经管时，将 抗肌醇代谢药物施加给孕鼠。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在胚胎发育7.5天时将抗肌醇代谢药物施 加给孕鼠。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述孕鼠选自C57BL/6 J小鼠。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗肌醇代谢药物为能够在小鼠体内解 离出Li+的锂盐。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述锂盐为碳酸锂。7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述施加为腹腔注射。8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，根据权利要求8所述的应用，其特征在于， 抗肌醇代谢药物的给药剂量选自300-370mg/kg孕鼠体重。9. 一种抗肌醇代谢药物在构建神经管畸形小鼠模型中的应用，其特征在于，包括:在孕 鼠胚胎发育至开始形成神经管时，将抗肌醇代谢药物施加给孕鼠。10. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述锂盐为碳酸锂，并且在胚胎发育7.5 天时施加给C57BL/6J小鼠；抗肌醇代谢药物的给药剂量选自300-370mg/kg孕鼠体重。
【文档编号】A61K45/06GK105920605SQ201610407640
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月12日
【发明人】王建华, 郭金, 石英飞, 王芳, 刘赛, 官臻, 王秀伟, 张霆, 牛勃, 安彦新
【申请人】王建华