专利名称：磷脂酰肌醇蛋白激酶类的活性测定试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物化学酶试剂盒检测领域，具体适合于磷脂酰肌醇蛋白激酶类，以及各种相关脂酶活性的固相法测定。
面对日益增加的磷脂酰肌醇激酶在细胞信号转导过程中起中心作用被人们所重视，磷脂酰肌醇代谢过程中的重要蛋白激酶(PI4k，PI3K，PIP5K等)它的活性测定需求日益上升；然而，传统的磷脂酰肌醇蛋白激酶活性测定所用的方法存在许多缺点如操作繁琐，重复性差，以及不能大规模活性测定，而且对于操作者存在着放射性同位素辐照损伤的危险。为此改进传统蛋白激酶活性测定方法。特别在临床的靶向药物的选择中显得特别重要。
磷脂酰肌醇激酶活性试剂盒的设计1.底物的包被由有机溶剂将磷脂溶解后在放入96孔板中在4℃条件下过夜，然后用PBS洗涤三遍。
2.封闭多余的空间为了封闭多余的空间再加入3％的牛血清白蛋白，室温下孵浴一小时后，用PBST(0.02％Tween)洗涤三遍。
3.磷脂酰肌醇激酶(或膜样品，或细胞裂解液)的吸附然后加入需要测定的磷脂酰肌醇激酶(或膜样品，或细胞裂解液)在室温下孵浴一小时将其吸附在固体板上后，再移去多余的溶液；4.活性的测定然后加入测活的溶液Tris-HCl 20mM，pH7.4；10mMDTT，50mM ATP，10mM MgCl2，2mM EGTA和32P-r-ATP(50-100μl)，在36℃条件下反应10分钟。中断反应用预先冷致4℃的终止反应与洗涤溶液0.01N HCl洗涤五遍。洗去未反应的32P-r-ATP。反应产物32PIP簿层滴样用专用氯仿浓HCl液溶解，并用TLC薄板分离后，(用标准PIP为对照)进行同位素计数。
按上述条件我们进行了不同磷脂酰肌醇激酶浓度与测活性的相关性，不同底物浓度与磷脂酰肌醇激酶的活性相关性，以及固相磷脂在不同浓度的去污剂对其稳定性的试验；上述试验表明本发明的实验重复性可靠性适合实验要求，不但可以用纯化的磷脂酰肌醇激酶进行试验，而且可以用细胞的裂解液中PIK的活性测定，以及快速和适用性广泛。本方法极大地减少了放射性同位素辐射造成对操作人员健康的危害程度，以及适合于大规模生物样品实验；因此该方法对于磷脂酰肌醇蛋白激酶(或其它磷脂蛋白激酶的活性的测定均可以应用，但是需要各自活性测定试剂盒。)
图4为用固相法对巨噬细胞裂解液中PI4K的活性测定首先将人红细胞制备成血影膜，然后制备成内翻外血影膜，目的是为了将要测试的磷脂酰肌醇激酶暴露在外。其它条件同上。加入需要的测定的内翻外血影膜，0，0.1；0.3，1，10ug在室温下一小时后，起移去多余的溶液，然后加入测活性的溶液，(50-60μl)，包含32P-r-ATP，在36℃条件下反应10分钟。中断反应用4℃蒸溜水洗涤三遍。洗去未反应的32P-r-ATP。反应产物32PIP用三氯甲烷溶解，并在TLC薄板，用标准PIP为对照，用同位素仪进行计数。实验结果见图3。
图3我们可以看到本发明不但适合纯化的PI4K应用，而且也可以用于人细胞膜的样品。该样品随着蛋白浓度增加而酶的活力也增加，并且它们之间存在线性关系。说明该方法的应用可靠性。图3B是应用本法明方法与传统的方法对于正常人红细胞与夜间阵发性出血证病人红血球中PI4K活性的对比。结果表明两种方法同时证明病人红血球种的PI4K活性要明显高于正常人红血球中PI4K活性。实施例3巨噬细胞裂解液中PI4K的活性测定上述已经证明了本发明可以应用在纯化或不纯化的样品PI4K酶活的测定，下面用细胞的体系制备的样品研究本方法的适用性。
用1％Triton X-100将小鼠腹腔巨噬细胞(预先制备与纯化)溶解，然后用PBS将其配成0.1％Triton X-100，其它同上进行操作，结果见图4。图4.3×106的小鼠巨噬细胞用30μl 1％Triton X-100将细胞溶解，然后将样品用PBS将其配成1％Triton X-100，加入到反应试剂盒。其它操作同上。结果表明固相法可以测到细胞水平PI4K酶的活性，PAO为PI4K的以抑制剂。该结果与正常方法得到结果相一致。
权利要求
1.一种用于磷脂酰肌醇蛋白激酶类及其亚类的活性快速测定的试剂盒，其特征在于该测定试剂盒有如下组成一块由待测的磷脂酰肌醇蛋白激酶相对应的底物和磷脂预先包埋好的96孔板；酶活性测定Tris-HCl溶液；酶反应终止与洗涤HCl液以及簿层滴样用氯仿-HCl专用液所组成。
2.根据权利要求1中所述的试剂盒的组成，其中所述的由待测的磷脂酰肌醇蛋白激酶相对应的底物和磷脂预先包埋好的96孔板，其中相对应的底物为PI或PIP或PIP2。
3.根据权利要求1中所述的试剂盒的组成，其中所述的酶活性测定溶液组成为Tris-HCl 20mM，pH7.4；10mM DTT，50mM ATP，10mMMgCl2，2mM EGTA和32P-r-ATP。
4.根据权利要求1中所述的试剂盒的组成，其中所述的酶反应活性终止与洗涤液为0.01N HCl。
5.根据权利要求1中所述的试剂盒的组成，其中所述的簿层滴样用专用液为氯仿加浓HCl。
6.根据权利要求1所述的试剂盒在磷脂酰肌醇蛋白激酶类PI3K，PI4K，PIP5K以及它们亚类活性测定中应用。
全文摘要
一种用于磷脂酰肌醇蛋白激酶类及其亚类的活性快速测定的试剂盒，其特征在于该测定试剂盒有如下组成一块由待测的磷脂酰肌醇蛋白激酶相对应的底物和磷脂预先包埋好的96孔板；酶活性测定Tris－HCl溶液；酶反应终止与洗涤HCl液以及簿层滴样用氯仿－HCl专用液所组成。
文档编号C12Q1/25GK1418967SQ01134920
公开日2003年5月21日 申请日期2001年11月14日 优先权日2001年11月14日
发明者乐加昌 申请人:中国科学院生物物理研究所