专利名称：用酶使油脱胶的方法
用酶使油脱胶的方法
本申请是申请日为2005年7月18日，题为“用酶使油脱胶的方法”的中国专利申请200580023982. 5号的分案申请。
相关申请
本申请参考了以下相关申请1999年7月20日提交的美国申请序列号 09/750, 990,美国申请序请号 10/409，391，W02004/064537，W02004/064987，PCT/ IB2004/004378和PCT/IB2004/004374。每一篇申请和这些申请的每一篇中引用的每个文献(申请引用的文献)，每一篇本发明所参考和引用的每篇文献，无论在文本中或者在那些申请的诉讼(prosecution)过程中，以及在这些诉讼过程中提出的所有支持专利性的论证，都包含在本文中作为参考。本文文本也引用了各种文件(“本文引用的文件”)。每一篇“本文引用文件”和每一篇在“本文所引用文件”中引用或者参考的文献都并入本文中作为参考。发明领域
本发明涉及使用脂质酰基转移酶(lipid acyltransferase)通过酶促反应使食用油油脱胶的方法。
本发明进一步涉及一种或多种脂质酰基转移酶。
本发明进一步涉及脂质酰基转移酶用于脱胶食用油油的应用。技术背景
传统上有两种方法用于油类的脱胶，是物理脱胶和化学脱胶方法。在1990年代基于胰腺磷脂酶(pancreatic phospholipase)的使用出现了酶脱胶方法。由于该酶按犹太教规不是清洁可食的(non-kosher),所以该磷脂酶最后由微生物的磷脂酶Al (Lecitase UltraTM-N0V0Zymes，丹麦)代替。与化学或物理脱胶方法相比，酶方法具有若干优点，包括成本节省，产率更高，更环保。发明内容
在一个方面，本发明提供一种使用如本文定义的脂质酰基转移酶对植物油或食用油进行酶脱胶的方法。
本发明还提供一种植物油或食用油的酶脱胶方法，其包括用本发明的脂质酰基转移酶处理食用油或植物油，从而去除大部分的磷脂。
本发明还提供一种植物油或食用油的酶脱胶方法，其包括用本发明的脂质酰基转移酶处理食用油或植物油，从而将来自大部分磷脂的酰基转移到一种或多种酰基受体上， 例如转移到一种或多种留醇(stenol)和/或留烧醇(stanol)上。
另一方面，本发明提供一种或多种脂质酰基转移酶。
在一个方面，本发明提供脂质酰基转移酶，其包括SEQ ID No. 16所示的氨基酸序列。
另一方面，本发明提供含有SEQ ID No 16所示的氨基酸序列的脂质酰基转移酶， 或与SEQ ID No. 16具有75%或更多，优选85%或更多，更优选90%或更多，还更优选95% 或更多，还更优选98 %或更多，或还更优选99 %或更多同源性的氨基酸序列。
在又一个方面，本发明提供脂质酰基转移酶在食用油脱胶中的应用，用来(i)去除磷脂(例如磷脂酰胆碱)和/或(ii)提高固醇酯和/或留烷醇酯在油中形成和/或(iii) 去除磷脂(例如磷脂酰胆碱)和/或提高固醇酯和/或留烷醇酯在油中形成，而不会显著增多油中的游离脂肪酸。
优选的方面
用于本发明的脂质酰基转移酶可以是天然脂质酰基转移酶，也可以是变体脂质酰基转移酶。
例如用于本发明方法和用途的脂质酰基转移酶可以是如W02004/064537或 W02004/064987,或 PCT/IB2004/004378 或 GB0513859. 9 所述的脂质酰基转移酶。
本文使用的术语“脂质酰基转移酶”是指一种具有酰基转移酶活性(通常分类为 E. C. 2. 3. I. x)的酶，该酶能够将酰基从脂质转移到一个或多个受体底物，例如以下物质的一种或多种固醇；留烷醇；碳水化合物；蛋白质；蛋白质亚基；甘油；优选固醇和/或甾烷醇。
优选地，本发明的脂质酰基转移酶或用于本发明的方法和/或用途的脂质酰基转移酶能够将酰基从脂质(如本文定义的)转移到一种或多种下述酰基受体底物固醇或甾烷醇，优选固醇。
在一些方面中，本发明的“酰基受体”可以是包含羟基(-0H)的任何化合物，例如多价醇类包括甘油、固醇、留烷醇、碳水化合物；羟基酸包括果酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸和抗坏血酸；蛋白质或其亚基如氨基酸、蛋白质水解物和肽(部分水解的蛋白质)，及其混合物和衍生物。优选地，本发明的“酰基受体”不是水。
优选酰基受体不是甘油单酯。
在一个方面，本发明的脂质酰基转移酶或用于本发明方法和/或用途的脂质酰基转移酶既能够将酰基从脂质转移到固醇和/或留烷醇，还能够将酰基从脂质转移到下列物质中的一种或多种碳水化合物，蛋白质，蛋白质亚基，甘油。
优选地，本发明脂质酰基转移酶作用的脂质底物是下列脂质中的一种或多种磷脂例如卵磷脂(lecithin)，如磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine)。
该脂类底物在此可以被称为“脂质酰基供体”。这里使用的术语卵磷脂包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺，磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰甘油。
对于一些方面，优选地，本发明的脂质酰基转移酶或用于本发明方法和/或用途的脂质酰基转移酶对其起作用的脂质底物是磷脂，诸如卵磷脂，例如磷脂酰胆碱。
对于一些方面，优选地，本发明的脂质酰基转移酶或用于本发明方法和/或用途的脂质酰基转移酶不能或基本不能作用于甘油三酯和/或I-甘油单酯和/或2-甘油单酯。
适宜地，本发明的脂质酰基转移酶或用于本发明方法和/或用途的脂质酰基转移酶可显示出下列脂酶的活性中的一种或多种磷脂酶A2活性(E. C. 3. I. I. 4)，磷脂酶Al活性(E. C. 3. I. I. 32)。
适宜地，对于一些方面，本发明的脂质酰基转移酶或用于本发明方法和/或用途3/63 页的脂质酰基转移酶可将酰基从磷脂转移到固醇和/或留烷醇。
对于一些方面，优选本发明的脂质酰基转移酶或用于本发明方法和/或用途的脂质酰基转移酶可将酰基从磷脂转移到固醇和/或留烷醇，以形成至少固醇酯和/或留烷醇酯。
对于一些方面，优选本发明的脂质酰基转移酶或用于本发明方法和/或用途的脂质酰基转移酶不表现三酰甘油脂肪酶活性(E. C. 3. I. I. 3)，或不表现显著的三酰甘油脂肪酶活性(E. C. 3. I. I. 3)。
本发明的脂质酰基转移酶或用于本发明方法和/或用途的脂质酰基转移酶可将酰基从脂类转移到固醇和/或留烷醇。因此，在一个实施方案中，本发明的“酰基受体”既可为固醇又可为留烷醇，或固醇和留烷醇二者的组合。
优选地，本发明的脂质酰基转移酶或用于本发明方法和用途的脂质酰基转移酶可用下列标准表征
(i)该酶具有酰基转移酶活性，该活性可定义为酯转移活性，凭借该活性，脂质酰基供体的原始酯键的酰基部分被转移到酰基受体以形成新的酯；以及
(ii)该酶含有氨基酸序列基序GDSX，其中X是下列氨基酸残基中的一种或多种 L，A，V，I，F，Y，H，Q，T，N，M 或 S。
优选地，⑶SX基序的X是L或Y。更优选地，⑶SX基序的X是L。因此，优选本发明的酶含有氨基酸序列基序GDSL。
GDSX基序由四种保守氨基酸构成。优选地，所述基序中的丝氨酸是脂质酰基转移酶的催化性丝氨酸。适宜地，⑶SX基序中的丝氨酸可以在与嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)脂肪分解酶中与Ser-16相对应的位置，如Brumlik和Buckley (Journal of Bacteriology Apr. 1996，Vol. 1，No. 7，p 2060-2064)的教导。
为确定蛋白质是否具有本发明所述⑶SX基序，根据W02004/064537或 W02004/064987教导的方法,将该序列优选与Pfam数据库中的隐藏markov模型图谱(model profile) (HMM图谱)进行比较。
Pfam是蛋白质结构域家族的数据库。Pfam包括为每个家族的辅助(curated)多重序列比对以及用于在新序列中鉴定这些结构域的隐藏Markov模型图谱(HMM图谱)。对 Pfam 的介绍可见于 Bateman A 等 (2002) Nucleic Acids Res, 30 ;276_280。隐藏 Markov 模型被应用于许多旨在对蛋白质进行分类的数据库中，综述见Bateman A和Haft DH (2002) BriefBioinform 3 ;236_245。
http://www.nchi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi cmd = Retrieve& db = PuhMed&list_uids = 12230032&dopt = Abstract
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi cmd = Retrieve&db = PubMed&list_uids = 11752314&dopt = Abstract
对隐藏Markov模型的详细解释和这些模型如何在Pfam数据库中应用参见Durbin R, Eddy S,和 Krogh A(1998)Biological sequence analysis !probabilistic models of proteins and nucleic acids. Cambridge University Press, ISBN 0-521-62041-4。 Hammer 软件包可从华盛顿大学(Washington University), St Louis, USA 获得。
可选择地，⑶SX基序可以使用Hammer软件包识别，说明由Durbin R, Eddy S,和7Krogh A(1998)Biological sequence analysis !probabilistic models of proteins and nucleic acids. Cambridge University Press, ISBN 0-521-62041-4 及其中的参考文献， 以及本说明书中提供的HMMER2的资料中提供。
PFAM数据库可以通过，例如，目前位于如下网址的几个服务器进行访问
http://www. sanger. ac. uk/Software/Pfam/index, shtml
http://pfam.wustl.edu/
http://pfam. jouy. inra. fr/
http://pfam.cgb.ki.se/
数据库提供了检索工具，在此可以输入蛋白质序列。然后使用数据库的默认参数， 对蛋白质序列中Pfam结构域的存在进行分析。GDSX结构域是在数据库中已建立的区域，因此任何查询序列中存在的该结构域可以得到识别。数据库将返回Pfam00657共有序列与查询序列的比对。
优选用于本发明方法和用途的脂质酰基转移酶可以用Pfam00657共有序列进行比对(详细描述参见 W02004/064537 或 W02004/064987)。
优选地,与pfam00657结构域家族的隐藏markov模型图谱(HMM图谱)的阳性匹配表明本发明的GDSL或GDSX结构域的存在。
优选地，当与Pfam00657共有序列比对时，用于本发明的方法或用途的脂质酰基转移酶可具有至少一个，优选一个以上，优选两个以上下列区域，⑶Sx区(block)、GANDY 区、HPT区。适宜地，脂质酰基转移酶可具有⑶Sx区和GANDY区。可选择地，所述酶可具有 ⑶Sx区和HPT区。优选地，所述酶至少含有⑶Sx区。
优选地，GANDY基序的残基选自GANDY，GGNDA, GGNDL,最优选GANDY。
优选地，当与Pfam00657共有序列比对时，用于本发明方法或用途中的酶与对照嗜水气单胞菌(A. hydrophilia)多肽序列即SEQ ID No. I比较时具有至少一个,优选一个以上，优选两个以上，优选三个以上，优选四个以上，优选五个以上，优选六个以上，优选七个以上，优选八个以上，优选九个以上，优选十个以上，优选十一个以上，优选十二个以上，优选十三个以上，优选十四个以上下列氨基酸残基28hid, 29hid, 30hid, 31hid, 32gly, 33Asp,34Ser,35hid,130hid,131Gly,132hid,133Asn,134Asp,135hid, 309His。
Pfam00657⑶SX结构域是将具有该区域的蛋白与其它酶区分的独特标识。
Pfam00657共有序列，表示为
图12的SEQ ID No. 2。这是从Pfam00657家族第6 版数据库的鉴定衍生出来的，本文也称其为pfam00657. 6。
共有序列可通过使用新版Pfam数据库来更新(如参见W02004/064537或 W02004/064987)。
发现来自两个版本(release)的数据库的Pfam00657家族中都存在⑶Sx区、 GANDY区和HPT区。其它版本的pfam数据库可用来鉴定pfam00657家族。
在一个实施方案中，用于本发明方法和用途的脂质酰基转移酶可用下列标准来表征
(i)该酶具有转移酰基的活性，其可定义为酯转移活性，由此将脂质酰基供体的原始酯键上的酰基部分转移到酰基受体上形成新酯；
(ii)该酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是下列氨基酸残基中的一种或多种L，A，V，I，F，Y，H，Q，T，N，M*S;
该酶包含His-309或包含在对应于嗜水气单胞菌脂肪分解酶的His-309位的组氨酸残基，所述嗜水气单胞菌脂肪分解酶如图11和13所示(SEQ ID No. I或SEQ ID No. 3)。
优选地，⑶SX基序的氨基酸残基是L。
在SEQ ID No. 3或SEQ ID No. I中，前18个氨基酸残基形成信号序列。全长序列 (其为包含信号序列的蛋白质)的His-309，等同于该蛋白质成熟部分(即不含有信号序列的序列)中的His-291。
在一个实施方案中，用于本发明方法和用途的脂质酰基转移酶包括下列催化三联体Ser-34，Asp-134和His-309或者包含位置分别对应于图13 (SEQ ID No. 3)或图11 (SEQ ID No. I)所示的嗜水气单胞菌脂肪分解酶中Ser-34，Asp-134和His-309的丝氨酸残基、 天冬氨酸残基和组氨酸残基。如上所述，在SEQ ID No. 3或SEQ ID No. I所示序列中，前 18个氨基酸残基形成信号序列。全长序列(包含信号序列的蛋白质)的Ser-34，Asp-134 和His-309,等同于蛋白质成熟部分(即不含有信号序列的序列)的Ser-16, Asp-116和 His-291。在图12(SEQ ID No. 2)所示的Pfam00657共有序列中，活性位点残基对应于 Ser-7, Asp-157 和 His-348。
在一个实施方案中，用于本发明方法和用途的脂质酰基转移酶可以用下列标准来表征
(i)该酶具有转移酰基的活性，其可定义为酯转移活性，由此将第一脂质酰基供体原始酯键上的酰基部分转移到酰基受体形成新酯；并且
(ii)该酶包含至少 Gly-32，Asp-33, Ser-34, Asp-134 和 His-309 或者包含位置分别对应于图13 (SEQ ID No. 3)或图11 (SEQ ID No. I)所示的嗜水气单胞菌脂肪分解酶中 Gly-32, Asp-33, Ser-34, Asp-134和His-309的甘氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、天冬氨酸和组氨酸。
合适地，用于本发明方法和用途的脂质酰基转移酶包含下列氨基酸序列中的一种或多种。
(i)SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列(见图13)
(ii)SEQ ID No. 4所示的氨基酸序列(见图14)
(iii) SEQ ID No. 5所示的氨基酸序列(见图15)
(iv)SEQ ID No. 6所示的氨基酸序列(见图16)
(V)SEQ ID No. 7所示的氨基酸序列(见图17)
(vi)SEQ ID No. 8所示的氨基酸序列(见图18)
(vii) SEQ ID No. 9所不的氣基酸序列(图9)
(viii)SEQ ID No. 10所示的氨基酸序列(图10)
(ix) SEQ ID No. 11所示的氨基酸序列(图21)
(X)SEQ ID No. 12所示的氨基酸序列(图22)
(Xi)SEQ ID No. 13所示的氨基酸序列(图23)
(xii)SEQ ID No. 14所示的氨基酸序列(图24)
(xiii)SEQ ID No. I所示的氨基酸序列(图11)
(xiv)SEQ ID No. 15所示的氨基酸序列(图25)或
与SEQ ID No. 1，SEQ ID No. 3，SEQ ID No. 4，SEQ ID No. 5，SEQ ID No. 6，SEQ ID No. 7，SEQ ID No. 8，SEQ ID No. 9，SEQ ID No. 10，SEQ ID No. 11，SEQ ID No. 12，SEQ ID No. 13，SEQ ID No. 14，SEQ ID No. 15所示序列中的任一个具有75%或者更高同一性的氨基酸序列。
合适地，用于本发明方法和用途的脂质酰基转移酶包含如SEQ ID No. 3或如SEQ ID No. 4或SEQ ID No. I或SEQ ID No. 15所示的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列或SEQ ID No. 4所示的氨基酸序列或SEQ ID No. I所示的氨基酸序列或 SEQ ID No. 15所示的氨基酸序列具有75%或以上，优选80%或以上，优选85%或以上，优选90%或以上，优选95%或以上同一性的氨基酸序列。
合适地，用于本发明方法和用途的脂质酰基转移酶包含一段氨基酸序列，该序列与 SEQ ID No. 3，SEQ ID No. 4，SEQ ID No. 5，SEQ ID No. 6，SEQ ID No. 7，SEQ ID No. 8， SEQ ID No. 9，SEQ ID No. 10，SEQ ID No. 11，SEQ ID No. 12，SEQ ID No. 13，SEQ ID No. 14， SEQ ID No. 1,SEQ ID No. 15所示序列中的任一个具有80%或以上，优选85%或以上，更优选90%或以上，还更优选95%或以上的同一性。
合适地，用于本发明方法和用途的脂质酰基转移酶包含下列氨基酸序列中的一个或多个
(a)如SEQ ID No. 3或SEQ ID No. I的1_100氨基酸残基所示的氨基酸序列；
(b)如SEQ ID No. 3或SEQ ID No. I的101-200氨基酸残基所示的氨基酸序列；
(c)如SEQ ID No. 3或SEQ ID No. I的201-300氨基酸残基所示的氨基酸序列；或
(d)与上述(a)-(c)定义的氨基酸序列中的任一个具有75%或75%以上，优选 85 %或85 %以上，更优选90 %或90 %以上，还更优选95%或95 %以上同一性的氨基酸序列。
合适地，用于本发明方法和用途的脂质酰基转移酶包含下列氨基酸序列中的一个或多个
(a)如SEQ ID No. 3或SEQ ID No. I的氨基酸残基28_39所示的氨基酸序列；
(b)如SEQ ID No. 3或SEQ ID No. I的氨基酸残基77_88所示的氨基酸序列；
(c)如SEQ ID No. 3或SEQ ID No. I的氨基酸残基126-136所示的氨基酸序列；
(d)如SEQ ID No. 3或SEQ ID No. I的氨基酸残基163-175所示的氨基酸序列；
(e)如SEQ ID No. 3或SEQ ID No. I的氨基酸残基304-311所示的氨基酸序列；或
(f)与上述(a)-(e)定义的氨基酸序列中任一个具有75%或75%以上，优选85% 或85%以上，更优选90%或90%以上，还更优选95%或95%以上同一性的氨基酸序列。
在一个方面中，用于本发明方法和用途的脂质酰基转移酶可以是如EP 1275711 中教导的来自近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)的脂质酰基转移酶。因此在一个方面用于本发明方法和用途的脂质酰基转移酶可为含有SEQ ID No. 17 (图28)或SEQ ID No. 18 (图29)教导的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。
更优选地，用于本发明方法和用途的脂质酰基转移酶可为含有SEQ ID No. 16所示氨基酸序列的脂质酰基转移酶(图10)，或与SEQ ID No. 16具有75%或更多，优选85%或更多，更优选90 %或更多，还更优选95 %或更多，还更优选98 %或更多，还更优选99 %或更多同源性的氨基酸序列。该酶可以被认为是变体酶。
在一个方面中，用于本发明方法和用途的脂质酰基转移酶可以为卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)或其变体(例如通过分子进化产生的变体)。
合适的LCAT是本领域公知的，并可从下列一种或多种生物体中得到，例如哺乳动物、大鼠、小鼠、鸟(chickens)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、植物,包括拟南芥 (Arabidopsis)和稻(Oryza sativa)、线虫、真菌和酵母。
在一个实施方案中，用于本发明方法和用途的脂质酰基转移酶可为可从并优选从含有pPetl2aAhydro和pPetl2aASalmo的大肠杆菌(E. coli)菌株T0P10中获得，该菌株由 Langebrogade I, DK-1001 Copenhagen K, Denmark 的 Danisco A/S,根据布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏(the Buddapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the purpose of Patent Procedure)在2003年12月22日保藏于英国苏格兰阿伯丁圣马恰尔街23号国立工业、海洋和食品细菌保藏中心(NCIMB) (the National Collection of Industrial,Marine and Food Bacteria (NCIMB) 23St. Machar Street, Aberdeen Scotland, GB),登录号分别为 NCIMB41204 和 NCIMB 41205。
高度优选用于本发明方法的脂质酰基转移酶包括分离自气单胞菌属(Aeromonas spp.)，优选嗜水气单胞菌或杀鲑气单胞菌，最优选杀鲑气单胞菌。最优选用于本发明的脂质酰基转移酶由SEQ ID Nos 1，3，4，15，16编码。本领域技术人员公知优选该酰基转移酶的信号肽在转移酶表达过程中被切割。SEQ ID 1，3，4，15和16的信号肽是氨基酸1-18。因此对于SEQ ID No I和SEQ ID No 3 (嗜水气单胞菌)最优选的区域是氨基酸19-335，对于SEQ ID No 4, SEQ ID No 15和SEQ ID No 16 (杀鲑气单胞菌)最优选的区域是19-336。 当用于测定氨基酸序列的同一性的同源性时，优选如本文所述使用成熟序列进行比对。
因此用于测定同源性(同一性)时，对于SEQ ID No I和3(嗜水气单胞菌)最优选的区域是氨基酸19-335，对于SEQ ID No 4，15和16 (杀鲑气单胞菌)最优选的区域是 19-336。SEQ ID 34和35是高度优选的、分别来自嗜水气单胞菌和杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶的成熟蛋白质序列。
用于本发明的脂质酰基转移酶也可以分离自Thermobifida,优选T. fusca,最优选由SEQ ID No 28编码。
用于本发明的脂质酰基转移酶也可以分离自链霉菌属(Streptomyces),优选S.avermitis，最优选由SEQ ID No. 32编码。其它可用于本发明的酶来自链霉菌属，包括由 SEQ ID Nos 5，6，9，10，11，12，13，14，31，33 编码的那些。实施例表明由 SEQ ID No. 33 编码的酶在酶脱胶过程中非常有效。
用于本发明的脂质酰基转移酶也可以分离自棒杆菌属(Cornebacterium),优选 C. efficiens，最优选由 SEQ ID No. 29 编码。
合适地，用于本发明方法和用途的脂质酰基转移酶可以是含有如下序列的脂质酰基转移酶如SEQ ID Nos 37，38，40，41，43，45，或47所示氨基酸序列中的任一个，或与其具有至少70%，75%，80%，85%，90%，95%，96%，97%或98%同源性的氨基酸序列，或由 SEQ ID Nos 36，39，42，44，46，或48所示核苷酸序列中的任一个或者与其具有至少70%， 75%，80%，85%，90%，95%，96%，97%或98%同源性的核苷酸序列编码。
优选地，用于本发明的方法和用途的脂质酰基转移酶是能水解至少半乳糖脂和/或能将酰基从至少半乳糖脂转移到一种或多种酰基受体底物的脂质酰基转移酶，其中所述酶可从，优选从链霉菌属菌种获得。
在一个实施方案中，用于本发明的方法和用途的脂质酰基转移酶优选为能够水解至少半乳糖脂和/或能够将酰基从至少半乳糖脂转移到一种或多种酰基受体底物的脂质酰基转移酶，其中所述酶是由选自下组的核酸编码
a)含有SEQ ID No. 36所不核苷酸序列的核酸；
b)依据遗传密码简并性与SEQ ID No. 36的核苷酸序列相关的核酸；和
c)含有与SEQ ID No. 36所不核苷酸序列具有至少70%同一丨丨生的核苷酸序列的核酸。
在一个实施方案中，用于本发明方法和用途的脂质酰基转移酶优选为含有SEQ ID No. 37所示氨基酸序列或与其具有至少60%同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。
在另一个实施方案中，用于本发明的方法和用途的脂质酰基转移酶优选为能够水解至少半乳糖脂和/或能够将酰基从至少另一半乳糖脂转移到另一或多种酰基受体底物的脂质酰基转移酶，其中所述酶含有SEQ ID No. 37所示氨基酸序列或与其具有至少60%同一性的氨基酸序列。
优选地，用于本发明的方法和用途的脂质酰基转移酶是能够水解至少半乳糖脂和 /或能够将酰基从至少半乳糖脂转移到一种或多种酰基受体底物的脂肪分解酶，其中所述酶可从，优选从thermobifida菌种，优选Thermobifida fusca获得。
优选地，用于本发明的方法和用途的脂质酰基转移酶是能够水解至少半乳糖脂和 /或能够将酰基从至少半乳糖脂转移到一种或多种酰基受体底物的脂肪分解酶，其中所述酶可从，优选获自棒杆菌菌种，优选Corynebacterium efficiens。
在另一个实施方案中，用于本发明方法和用途的脂质酰基转移酶可为含有如下序列的脂质酰基转移酶如SEQ ID Nos 37，38，40，41，43，45或47所示氨基酸序列中的任一个，或与其具有至少70%，75%，80%，85%，90%，95%，96%，97%或98%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID Nos 39,42,44,46或48所示核苷酸序列中的任一个或与其具有至少 70%，75%，80%，85%，90%，95%，96%，97%或 98% 同一性的核苷酸序列编码。
在另一个实施方案中，用于本发明方法和用途的脂质酰基转移酶可为用于本文所述用途的含有SEQ ID No 38，40，41，45或47所示氨基酸序列中的任一个或与其具有至少 70%，75%，80%，85%，90%，95%，96%，97%或98%同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。
在另一个实施方案中，用于本发明方法和用途的脂质酰基转移酶可为用于本文所述用途的含有SEQ ID No 38，40，或47所示氨基酸序列中的任一个或与其具有至少70%， 75 %，80 %，85 %，90 %，95 %，96 %，97 %或98 %同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。
更优选在一个实施方案中，用于本发明方法和用途的脂质酰基转移酶可为含有 SEQ ID No. 47所示氨基酸序列或与其具有至少70%，75%，80%，85%，90%，95%，96%， 97%或98%同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。
在另一个实施方案中，用于本发明方法和用途的脂质酰基转移酶可为含有SEQ ID No. 43或44所示氨基酸序列或与其具有至少80 %，85 %，90 %，95 %，96 %，97 %或98 %同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。
在另一个实施方案中，用于本发明方法和用途的脂质酰基转移酶可为含有SEQ ID No. 41所示氨基酸序列或与其具有至少70 %，75 %，80 %，85 %，90 %，95 %，96 %，97 %或 98%同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。
在一个实施方案中，用于本发明的方法和用途的脂质酰基转移酶可为能够水解至少半乳糖脂和/或能够将酰基从至少半乳糖脂转移到一种或多种酰基受体底物的脂质酰基转移酶，其中所述酶可由选自下组的核酸编码
a)含有SEQ ID No. 36所示核苷酸序列的核酸；
b)依据遗传密码简并性与SEQ ID No. 36的核苷酸序列相关的核酸；和
c)含有与SEQ ID No. 36所不核苷酸序列具有至少70%同一丨丨生的核苷酸序列的核酸。
在一个实施方案中，本发明的脂质酰基转移酶是可从，优选从链霉菌属菌株 L130或L131获得的脂质酰基转移酶,该菌株由Langebrogade I, DK-IOOlCopenhagen K, Denmark的Danisco A/S,根据布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏(the Buddapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the purpose of Patent Procedure)在 2004 年 6 月 23 日保藏于国立工业、海洋和食品微生物保藏中心(NCIMB) (23St. Machar Street, Aberdeen Scotland, GB)，登录号分别为 NCIMB 41226 和 NCMB 41227。
适用于本发明和/或本发明所述方法的脂质酰基转移酶可以包含下列氨基酸序列中的任一个和/或由下列核苷酸序列编码
编码本发明脂质酰基转移酶的多核苷酸(SEQ ID No 16)；
本发明的脂质酰基转移酶的氨基酸序列(SEQ ID No 17)；
适用于本发明方法的脂质酰基转移酶还可通过使用采用默认设定的Align X， VectorNTI的Clustal W配对比对算法与L131 (SEQ ID No. 37)序列进行比对而鉴定。
L131和来自除虫链霉菌(S. avermitilis)和T. fusca的同源物的比对说明了 ⑶Sx基序(在L131和除虫链霉菌和T. fusca中的⑶SY)，GANDY盒，其为GGNDA或GGNDL， 以及HPT区(认为是保守的催化组氨酸(histadine))的保守性。这些三个保守区在图61 中关出显不。
当与pfam Pfam00657共有序列(如W004/064987所述)和/或本文公开的L131 序列(SEQ ID No 37)比对时，可以鉴定三个保守区域，⑶Sx区，GANDY区和HTP区(进一步详述参见 W004/064987)。
当与pfam Pfam00657共有序列(如W004/064987所述)和/或本文公开的L131 序列(SEQ ID No 37)比对时，
i)本发明的脂质酰基转移酶或用于本发明方法的脂质酰基转移酶，优选具有 ⑶Sx基序，更优选⑶Sx基序选自⑶SL或⑶SY基序。
和/或
ii)本发明的脂质酰基转移酶或用于本发明方法的脂质酰基转移酶，优选具有 GANDY区，更优选GANDY区含有氨基GGNDx，更优选GGNDA或GGNDL。
和/或
iii)本发明的酶或用于本发明方法的酶具有优选的HTP区。
并优选地
本发明的或用于本发明方法的半乳糖脂酶/脂质酰基转移酶优选具有GDSx或 ⑶SY基序，及含有氨基GGNDx的GANDY区，优选GGNDA或GGNDL，及HTP区(保守组氨酸)。
合适地，当用于本发明方法或用途的脂质酰基转移酶可为变体脂质酰基转移酶， 在这样情况下该酶的特征在于所述的酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是以下氨基酸残基中的一个或多个L，A，V，I，F，Y，H，Q，T，N，M或S，其中该变体酶与亲本序列相比较，在组2或组4或组6或组7 (在下文定义)中定义的任何一个或多个氨基酸残基上包含一种或多种氨基酸修饰。
例如，用于本发明方法或用途的脂质酰基转移酶变体的特征可在于该酶包含氨基酸序列基序⑶SX，其中X是以下氨基酸残基中的一个或多个L，A, V，I，F，Y，H，Q，T，N， M或S，并且其中所述变体酶与亲本序列相比，在组2或组4或组6或组7 (在下文定义)中详述的任何一个或多个氨基酸残基上包含一种或多种氨基酸修饰，所述修饰通过将所述亲本序列与本文定义的P10480的结构模型进行比对来鉴定，其优选通过将P10480的晶体结构坐标与本文教导的IIVN. PDB和/或1DE0. PDB进行结构比对来获得。
在进一步的实施方案中，用于本发明方法或用途的变体脂质酰基转移酶的特征可在于该酶包含氨基酸序列基序⑶SX，其中X是以下氨基酸残基中的一个或多个L，A, V，I， F，Y，H，Q，T，N，M或S，并且其中所述变体酶与亲本序列相比，在组2教导中的任何一个或多个氨基酸残基上包含一种或多种氨基酸修饰，所述修饰在将所述亲本序列与Pfam共有序列(SEQ ID No. 2-图12)进行对比时被鉴定并且根据P10480的结构模型来修饰以保证最优拟合重叠(best fit overlap)(参见图30),如本文所述。
合适地，变体脂质酰基转移酶可包含氨基酸序列，该氨基酸序列如SEQ ID No. 34， SEQ ID No. 3，SEQ ID No. 4，SEQ ID No. 5，SEQ ID No. 6，SEQ ID No. 7，SEQ ID No. 8，SEQ ID No. 19，SEQ ID No. 10，SEQ ID No. 11，SEQ ID No. 12，SEQ ID No. 13，SEQ ID No. 14，SEQ ID No. 1，SEQ ID No. 15，SEQ ID No. 25，SEQ ID No. 26，SEQ ID No. 27，SEQ ID No. 28，SEQ ID No. 29，SEQ ID No. 30，，SEQ ID No. 32，或 SEQ ID No. 33 所示，除了在组 2 或组 4 或组 6 或组7 (在下文定义)中定义的任何一个或多个氨基酸残基上包含一种或多种氨基酸修饰， 所述修饰通过与SEQ ID No. 34进行序列比对来鉴定。
可选地，变体脂质酰基转移酶可包含氨基酸序列，该氨基酸序列如SEQ ID No. 34， SEQ ID No. 3，SEQ ID No. 4，SEQ ID No. 5，SEQ ID No. 6，SEQ ID No. 7，SEQ ID No. 8，SEQ ID No. 19，SEQ ID No. 10，SEQ ID No. 11，SEQ ID No. 12，SEQ ID No. 13，SEQ ID No. 14，SEQ ID No. I, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 29，SEQ ID No. 30，，SEQ ID No. 32，或 SEQ ID No. 33 所示，除了在组 2 或组 4 或组 6 或组7定义的任何一个或多个氨基酸残基上包含一种或多种氨基酸修饰，所述修饰通过将所述亲本序列与本文定义的P10480结构模型进行结构比对来鉴定，其优选地通过将P10480 晶体结构坐标与如本文教导的I IVN. PDB和/或1DE0. PDB进行结构比对而获得。
可选择地，变体脂质酰基转移酶可包含氨基酸序列，该氨基酸序列如SEQ ID No. 34，SEQ ID No. 3，SEQ ID No. 4，SEQ ID No. 5，SEQ ID No. 6，SEQ IDNo. 7，SEQ ID No. 8， SEQ ID No. 19，SEQ ID No. 10，SEQ ID No. 11，SEQ ID No. 12，SEQ ID No. 13，SEQ ID No. 14， SEQ ID No. 1，SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 25，SEQ ID No. 26，SEQ ID No. 27，SEQ ID No. 28,SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 30，，SEQ ID No. 32，或 SEQ ID No. 33 所示，除了在组 2 教导的任何一个或多个氨基酸残基上包含一种或多种氨基酸修饰，所述修饰在将所述亲本序列与 pfam共有序列(SEQ ID No. 2)进行对比时被鉴定，并且根据P10480的结构模型来修饰以保证最优拟合重叠(参见图30)，如在下文所教导的。
本文所用术语“修饰”指添加，取代和/或缺失。优选术语“修饰”指“取代”。
为了免除怀疑，当亲本酶中的氨基酸被取代时，优选用与亲本酶中该位置初始存在的氨基酸不同的氨基酸进行取代，由此产生变体酶。换句话说，术语“取代”的意思不包括用同样的氨基酸进行氨基酸替换。
优选地，该亲本酶是包含SEQ ID No. 34和/或SEQ ID No. 15和/或SEQ ID No. 35 所示的氨基酸序列的酶。
优选地，该变体酶是包含氨基酸序列的酶，所述氨基酸序列如SEQ ID No. 34或SEQ ID No. 35所示，除了在组2或组4或组6或组7中定义的任何一个或多个氨基酸残基处的一种或多种氨基酸修饰。
在一个实施方案中，优选该变体酶与亲本序列相比在组4中定义的至少一个氨基酸残基处包含一种或多种氨基酸修饰。
合适地，与亲本酶相比较，该酶变体包含一种或多种下述氨基酸修饰
S3E，A, G，K，M，Y，R，P，N，T 或 G
E309Q，R 或 A，优选 Q 或 R
-318Y，H，S 或 Y，优选 Y。
优选地，⑶SX基序的X是L。所以，优选亲本酶包含氨基酸基序⑶SL。
优选地，制备脂质酰基转移酶变体的方法进一步包含下述的一个或多个步骤
I)结构同源性作图或
2)序列同源性比对。
合适地，结构同源性作图可包括下述的一个或多个步骤
i)将亲本序列与图46所示的结构模型(1IVN. PDB)进行比对；
ii)在活性位点上以甘油分子的中心碳原子为圆心在IOA范围内选择一个或多个氨基酸残基(参见图47)(例如在组I或组2中定义的一个或多个氨基酸残基)；和
iii)在亲本序列中修饰根据步骤(ii)选择的一个或多个氨基酸。
在一个实施方案中，所选择的氨基酸残基可位于活性位点中以甘油分子的中心碳原子为圆心的9人以内，优选在8，7，6，5，4，或3人范围以内(参见图47)。
合适地，结构同源性作图可包括下述的一个或多个步骤
i)将亲本序列与图46所示的结构模型(1IVN. PDB)进行比对；
ii)在活性位点上以甘油分子的中心碳原子为圆心在IOA范围内选择一个或多个氨基酸残基(参见图47)(例如在组I或组2中定义的一个或多个氨基酸残基)；和
iii)确定根据步骤(ii)所选择的一个或多个氨基酸残基是否是高度保守的(具体为是否是活性位点残基和/或部分GSDx基序和/或部分GANDY基序)；以及
iv)在所述亲本序列中修饰根据步骤(ii)选择的一个或多个氨基酸，其不包括根据步骤(iii)鉴定的保守区域。
在一个实施方案中，选择的氨基酸残基可以位于以活性位点中甘油分子的中央碳原子为中心的9人以内，优选8，7，6，5，4或3A范围以内(参见图47)。
二中择一地，或与上述的结构同源性作图相结合，结构同源性作图可如下进行选择来源于Pfam比对(比对2，图48)用P10480模型及IIVN覆盖的特异性环状区(LRs)或插入区(IVRs)。下面表中定义了环状区(LRs)或插入区(IVRs)
权利要求
1.一种食用油的酶脱胶方法，包括用脂质酰基转移酶处理该食用油从而将大部分磷脂的酰基转移到一种或多种酰基受体上，其中所述酰基受体是一种或多种固醇和/或甾烷醇，所述脂质酰基转移酶分类为E. C. 2. 3. I. X，且所述脂质酰基转移酶具有定义为酯转移活性的酰基转移酶活性，由此将脂质酰基供体的原始酯键上的酰基部分转移到酰基受体上形成新酯。
2.权利要求I的方法，其中形成了固醇酯和/或留烷醇酯。
3.权利要求I或2的方法，其中所述酰基受体是固醇。
4.前述权利要求中任一项的方法，其中所述磷脂是卵磷脂。
5.前述权利要求中任一项的方法，其中所述脂质酰基转移酶是天然脂质酰基转移酶。
6.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述脂质酰基转移酶是变体脂质酰基转移酶。
7.前述权利要求中任一项的方法，其中所述脂质酰基转移酶可从来自下列一个或多个属的生物体中获得气单胞菌属、链霉菌属、酵母属、乳球菌属、分枝杆菌属、链球菌属、乳杆囷属、脱亚硫Ife囷属、牙抱杆囷属、弯曲杆囷属、弧囷科、木杆囷属、硫化叶囷属、曲霉属、裂殖酵母属、李斯戎氏菌属、奈瑟氏球菌属、Mesorhizobium、Ralstonia、黄单胞菌属、假丝酵母属、Thermobifida和棒杆菌属。
8.前述权利要求中任一项的方法，其中所述脂质酰基转移酶可从下列一种或多种获得嗜水气单胞菌、杀鲑气单胞菌、天蓝色链霉菌、龟裂链霉菌、Streptomyces thermosacchari、除虫链霉菌、分枝杆菌属、酿脓链球菌、乳酸乳球菌、酿脓链球菌、嗜热链球菌、瑞士乳杆菌、脱卤脱亚硫酸菌、芽孢杆菌、空肠弯曲杆菌、弧菌科、苛养木杆菌、硫磺矿硫化叶菌、酿酒酵母、土曲霉、粟酒裂殖酵母、无害李斯忒氏菌、单核细胞增生李斯忒氏菌、 脑膜炎奈瑟氏球菌、Mesorhizobium loti、Ralstonia solanacearum、野油菜黄单胞菌、地經草黄单胞菌、近平滑假丝酵母、Thermobifida fusca 和 Corynebacterium efficiens。
9.前述权利要求中任一项的方法，其中所述脂质酰基转移酶的氨基酸序列为如下所示中的一种或多种SEQ ID No. I, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7，SEQ ID No. 8，SEQ ID No. 9，SEQ ID No. 10，SEQ ID No. 11，SEQ ID No. 12，SEQ ID No. 13，SEQ ID No. 14 或 SEQ ID No. 15，SEQ ID No. 16，SEQ ID No. 17，SEQ ID No. 18，SEQ ID No. 36，SEQ ID No. 38，SEQ ID No. 40，SEQ ID No. 41，SEQ ID No. 45，SEQ ID No. 47 和 SEQ ID No. 50。
10.权利要求9的方法，其中所述脂质酰基转移酶的氨基酸序列为如下所示中的一种或多种SEQ ID No. 3，SEQ ID No. 4，SEQ ID No. I 和 SEQ ID No. 15。
11.权利要求9的方法，其中所述脂质酰基转移酶的氨基酸序列为如下所示中的一种或多种SEQ ID No. 36，SEQ ID No. 38，SEQ ID No. 40，SEQ ID No. 41，SEQ ID No. 45，SEQ ID No. 47 和 SEQ ID No. 50。
12.权利要求9的方法，其中所述脂质酰基转移酶的氨基酸序列为如下所示中的一种或多种SEQ ID No. 17 和 SEQ ID No. 18。
13.权利要求9的方法，其中所述脂质酰基转移酶的氨基酸序列为SEQID No. 16。
14.前述权利要求中任一项的方法，其中在处理过程中所述食用油中有少于1%的水。
15.权利要求14的方法，其中有少于0.6%的水。
16.权利要求15的方法，其中不含水。
17.前述权利要求中任一项的方法，其中该方法包括通过过滤去除由脂质酰基转移酶的作用而生成的溶血磷脂。
18.脂质酰基转移酶的用途，所述用途用于在食用油中脱胶以去除磷脂，并增加该油中固醇酯和/或留烷醇酯的形成，所述脂质酰基转移酶分类为E. C. 2. 3. I. X，且所述脂质酰基转移酶具有定义为酯转移活性的酰基转移酶活性，由此将脂质酰基供体的原始酯键上的酰基部分转移到酰基受体上形成新酯。
19.权利要求18的用途，其中处理后油中的游离脂肪酸没有显著增加。
20.权利要求18或19的用途，其中所述磷脂是卵磷脂。
21.权利要求18-20中任一项的用途，其中所述脂质酰基转移酶是天然脂质酰基转移酶。
22.权利要求18-20中任一项的用途，其中所述脂质酰基转移酶是变体脂质酰基转移酶。
23.权利要求18-22中任一项的用途，其中所述脂质酰基转移酶可从来自下列一个或多个属的生物体中获得气单胞菌属、链霉菌属、酵母属、乳球菌属、分枝杆菌属、链球菌属、 乳杆囷属、脱亚硫Ife囷属、牙抱杆囷属、弯曲杆囷属、弧囷科、木杆囷属、硫化叶囷属、曲霉属、裂殖酵母属、李斯戎氏菌属、奈瑟氏球菌属、Mesorhizobium、Ralstonia、黄杆菌属、假丝酵母属、Thermobifida和棒杆菌属。
24.权利要求18-23中任一项的用途，其中所述脂质酰基转移酶可从下列一种或多种获得嗜水气单胞菌、杀鲑气单胞菌、天蓝色链霉菌、龟裂链霉菌 Streptomyces thermosacchari、除虫链霉菌、分枝杆菌属、酿脓链球菌、乳酸乳球菌、酿脓链球菌、嗜热链球菌、瑞士乳杆菌、脱卤脱亚硫酸菌、芽孢杆菌、空肠弯曲杆菌、弧菌科、苛养木杆菌、硫磺矿硫化叶菌、酿酒酵母、土曲霉、粟酒裂殖酵母、无害李斯忒氏菌、单核细胞增生李斯忒氏菌、 脑膜炎奈瑟氏球菌、Mesorhizobium loti、Ralstonia solanacearum、野油菜黄单胞菌、地經草黄单胞菌、近平滑假丝酵母、Thermobifida fusca 和 Corynebacterium efficiens。
25.权利要求18-24中任一项的用途，其中所述脂质酰基转移酶的氨基酸序列为如下所示中的一种或多种SEQ ID No. I, SEQ ID No. 3,SEQ ID No. 4,SEQ ID No. 5,SEQ ID No. 6， SEQ ID No. 7，SEQ ID No. 8，SEQ ID No. 9，SEQ ID No. 10，SEQ ID No. 11，SEQ ID No. 12，SEQ ID No. 13，SEQ ID No. 14 或 SEQ ID No. 15，SEQ ID No. 16，SEQ ID No. 17，SEQ ID No. 18， SEQ ID No. 36, SEQ ID No. 38,SEQ ID No. 40,SEQ ID No. 41,SEQ ID No. 45,SEQ ID No. 47 和 SEQ ID No. 50。
26.权利要求25的用途，其中所述脂质酰基转移酶的氨基酸序列为如下所示中的一种或多种SEQ ID No. 3，SEQ ID No. 4，SEQ ID No. I 和 SEQ ID No. 15。
27.权利要求25的用途，其中所述脂质酰基转移酶的氨基酸序列为如下所示中的一种或多种SEQ ID No. 36，SEQ ID No. 38，SEQ ID No. 40，SEQ ID No. 41，SEQ ID No. 45，SEQ ID No. 47 和 SEQ ID No. 50。
28.权利要求25的用途，其中所述脂质酰基转移酶的氨基酸序列为如下所示中的一种或多种SEQ ID No. 17 和 SEQ ID No. 18。
29.权利要求25的用途，其中所述脂质酰基转移酶的氨基酸序列为SEQIDNo. 16。
30.权利要求18-29中任一项的用途，其中在处理过程中所述食用油中有少于1%的
31.权利要求30的用途，其中有少于0.6%的水。
32.权利要求31的用途，其中不含水。
33.脂质酰基转移酶，其氨基酸序列如SEQID No. 16所示。
34.经酶脱胶的食用油，其由权利要求1-17中任一项所述的方法获得。
全文摘要
本发明提供了食用油的酶脱胶方法，包括用脂质酰基转移酶处理该食用油，从而将酰基基团从大部分磷脂转移到一种或多种酰基受体，其中所述酰基受体是一种或多种固醇和/或甾烷醇。当该酰基受体是固醇和/或甾烷醇时，会形成酯。用于本发明方法的脂类酰基转移酶的氨基酸序列为如下所示的一种或多种SEQ ID No 1，SEQ ID No 3，SEQ ID No 4，SEQ ID No 5，SEQ ID No 6，SEQ ID No 7，SEQ ID No 8，SEQ ID No 9，SEQ ID No 10，SEQ ID No 11，SEQ ID No 12，SEQ ID No 13，SEQ ID No 14或SEQ ID No 15，SEQ ID No 16，SEQ ID No 17，SEQ ID No 18，SEQ ID No 36，SEQ ID No 38，SEQ ID No 40，SEQ ID No 41，SEQ ID No 45，SEQ ID No 47，SEQ ID No 50。还教导了一种新型脂类酰基转移酶，其具有SEQ ID No 16所示氨基酸序列。本发明还涉及由本发明的酶脱胶方法获得的食用油。
文档编号C11C3/00GK102533440SQ201110462189
公开日2012年7月4日 申请日期2005年7月18日 优先权日2004年7月16日
发明者乔恩·B·索, 马克·特纳 申请人:丹尼斯科公司