本发明属于高分子材料领域和组织工程领域，更具体地，涉及一种提高plga电纺纤维膜稳定性及生物活性的方法。
背景技术：
目前治疗组织缺损的传统方法包括自体移植和异体移植。自体移植过程中，其供体数量常常有限，而异体移植又会引发免疫排斥、二次创伤及感染，这些都限制了它们在临床上的应用。为了克服临床上的这些难题，通过设计组织工程支架，并在支架上种植于干细胞，提供了一种非常有前景组织修复的方法，在整个组织修复的过程中对材料的空间稳定性和生物活性有着非常重要的要求。一方面，组织工程支架必须满足其在体内植入期间的稳定性，以及在手术后能够为组织再生和支架降解提供足够的空间稳定性支持；另一方面，组织工程支架必须为干细胞的增殖与分化提供良好的生物活性支撑。
在组织修复中，电纺纳米纤维支架满足组织工程支架应用的众多要求，但是它们经常缺乏必要的空间稳定性。plga是fda认证的生物相容性良好的可降解性材料，但是其纤维支架在组织工程应用中稳定性较差，难以满足在长时间组织修复中对支架稳定性的需求。例如，plga电纺丝支架当在细胞培养基中37℃浸泡24h后，其皱缩体积比甚至低于20%。有研究者证明静电纺丝支架的尺寸收缩和变形是不利于细胞渗入支架结构内部，还会限制细胞在支架材料上初始的粘附和进一步增殖。另外，适当的延缓plga的降解速率，在长期的组织修复过程中对于维持支架的稳定性也是极其重要的。由于plga较快的生物降解速率，限制了它在组织工程中的应用。
因此，在不改变电纺纤维总体形貌、孔隙率的情况下，提供一种维持静电纺丝支架的结构稳定性的方法具有极大的应用前景。
技术实现要素：
本发明为了克服现有技术的上述不足，提供了一种提高plga电纺纤维膜稳定性及生物活性的方法。本发明通过复合caco3或者进行热处理方法，在基本不改变纤维形貌和直径的情况下，不仅降低了纤维膜的空间皱缩及降解率，维持了其空间稳定性，还提高了干细胞在纤维支架上的增殖与分化。
为了实现上述目的，本发明采用了以下方案：
一种提高plga电纺纤维膜稳定性及生物活性的方法，所述方法包括：向plga溶液中加入caco3，然后静电纺丝制备得到复合plga电纺纤维膜；或将常规的plga电纺纤维膜在40～50℃条件下加热处理，然后冷却至常温即得热处理plga电纺纤维膜。
发明人经过多次的实验发现在单一的plga纤维膜中引入适量的caco3，不仅能够增强机械性能，提高plga纤维膜在组织修复中的稳定性，还可以调控plga的降解行为，中和聚合物降解中产生的酸，对于长期的组织修复有重要的应用价值。
优选地，caco3与plga的质量比为1～50︰100。当caco3与plga的质量比超过50%时，制备的复合plga的整体形貌会发生较大的变化，不利于制成组织修复支架。
更优选地，caco3与plga的质量比为5～20︰100。当caco3与plga的质量比超过20%时，纤维直径变大。当caco3与plga的质量比为5～20︰100，纤维直径无明显变化。更优选地，caco3与plga的质量比为10︰100。
优选地，plga溶液的溶剂为氯仿、二氯甲烷、丙酮或六氟异丙醇；caco3在加入前先分散于n,n-二甲基甲酰胺或六氟异丙醇。
优选地，所述caco3为微球状的caco3。本发明所选用的caco3为直径不大于1μm的球状caco3，此种微球状的caco3可以良好的分散在纤维丝的内部，起到骨架支撑的作用，可提高整个纤维膜的空间稳定性，而不影响纤维丝原有的形貌。
优选地，caco3复合plga的过程为：将plga溶于二氯甲烷，caco3超声分散在n,n-二甲基甲酰胺中，然后将caco3分散液与plga溶液混合，使得plga的终浓度为20%，并控制caco3与plga的质量比为5～20：100。优选地，静电纺丝制备复合plga电纺纤维膜的参数为：恒压14kv，针头到接收平台的距离为20cm，推进速度为0.6ml/h。
此外，通过热处理来调节plga的稳定性，当加热温度接近plga的玻璃化转变温度（tg~50℃）后，纤维膜中的单根纤维会发生轻微弯曲，在基本保持纤维膜的原有形貌及特性的条件下，提高纤维支架的稳定性。
优选地，常规的plga电纺纤维膜的制备过程为将plga溶于体积比为3︰1的丙酮和n,n二甲基甲酰胺混合溶液中，并保证plga的质量浓度为24%，将混合液搅拌过夜；再进行静电纺丝，静电纺丝的参数为恒压电源为14kv，针头为21#（0.22mm），针头到接收平台的距离为20cm，微量注射泵推进速度为1ml/h。
优选地，所述plga电纺纤维膜加热处理的温度为45～55℃；更优选地，plga电纺纤维膜加热处理的温度为50℃。
优选地，所述plga电纺纤维膜加热处理的时间为2～12h；更优选地，加热处理时间为2～4h。
优选地，所述plga电纺纤维膜加热处理为固定热处理或悬浮热处理。所述固定热处理为plga电纺纤维膜贴附在铝箔上进行加热；所述悬浮热处理为plga脱离铝箔进行加热。
更优选地，所述plga电纺纤维膜加热处理为固定热处理。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过复合caco3和plga制备得到复合plga电纺纤维膜，或者将常规的plga电纺纤维膜进行热处理得到热处理plga电纺纤维膜，在维持原有形貌的前提下，提高了plga电纺纤维膜的空间稳定性，降低了其降解率，还进一步提高了由其制备的纤维支架的生物活性，本发明所述方法制备的plga电纺纤维膜因具有较好的稳定性和生物活性，在组织工程长期修复过程中具有极大的应用价值。此外，本发明所述方法简单，无需大型设备即可完成。
附图说明
图1制备的常规plga电纺纤维膜的sem图及直径分布图。
图2固热处理plga纤维膜和悬热处理plga纤维膜的sem图和直径分布图。
图3复合plga纤维膜的sem图和直径分布图。
图4常规plga纤维膜经37度pbs浸泡后的sem图、皱缩体积比及纤维直径分布图。
图5固热处理plga纤维膜和悬热处理plga纤维膜经75%酒精浸泡后sem图、皱缩体积比及纤维直径分布图。
图6复合plga纤维膜经75%酒精浸泡后sem图、皱缩体积比及纤维直径分布图。
图7常规plga、固热处理plga和复合plga电纺纤维膜降解28d后的sem图。
图8细胞在常规plga和固热处理plga纤维膜上的增殖结果。
图9固热处理plga纤维膜茜素红染色的光镜照片和宏观拍摄图。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
1.制备常规的plga电纺纤维膜：
取0.6gplga（0.58dl/g，50/50）于纺丝瓶中，之后加入2.5ml的丙酮与n,n二甲基甲酰胺（dmf）的体积比为3：1的混合溶液，使plga的质量浓度为24%，磁力搅拌过夜，使其完全溶解。取纺丝溶液于量程为2.5ml的注射器中，装载到微量注射泵中，选用21#（直径0.22mm）针头，恒压直流电源调至14kv，针头到接收平台的距离为20cm，接收平台的大小为20cm*20cm，在平铺的铝箔纸上放置若干12孔（直径22mm）和24孔（直径14mm）大小的玻片，推进速度控制在1ml/h，制备得到常规的plga电纺纤维膜。
2.热处理plga电纺纤维膜的制备：
将上述制备的常规plga电纺纤维膜放置于培养皿中，并于50℃烘箱中热处理2h，热处理的方式为固定热处理，得到固热处理plga电纺纤维膜；热处理的方式为悬浮热处理，得到悬热处理plga电纺纤维膜。
实施例2
1.制备plga/caco3复合电纺纤维膜：
取plga（0.58dl/g，50/50）溶于二氯甲烷（dcm）中，caco3微球超声分散在n,n二甲基甲酰胺（dmf）中，并磁力搅拌，使其完全分散。将dcm与dmf按体积比为3:1混合，caco3与plga的质量比为10：100，plga的终浓度为20%，磁力搅拌过夜，使其完全混合。电纺参数设置为：电压14kv，针头到接收平台的距离为20cm，接收平台的大小为20cm*20cm，在平铺的铝箔纸上放置若干24孔玻片（直径14mm）大小的玻片，推进速度控制在0.6ml/h，制备得到复合plga电纺纤维膜。
测试实施例1和实施例2制备的纤维膜的皱缩体积、直径分布及生物学特性
1）通过电子显微镜扫描得到sem图及直径分布图
实施例1中常规plga电纺纤维膜的sem图及直径分布图如图1所示。从图1中可知，所述常规plga电纺纤维膜的纤维丝粗细均匀，纤维直径分布在581.9±167.5nm。
实施例1中热处理plga电纺纤维膜的sem图及直径分布图如图2所示。从图2中可知，所述固热处理plga电纺纤维膜和悬热处理plga电纺纤维膜的纤维丝粗细均匀，纤维直径分布在523.2±134.4nm和758.9±242.9nm。
实施例2中复合plga电纺纤维膜的sem图及直径分布图如图3所示。从图3中可知，所述复合plga电纺纤维膜的纤维丝粗细均匀，纤维直径分布在596.8±157.6nm。
从图1～3中可知，固热处理plga电纺纤维膜和复合plga电纺纤维膜在整体形貌与纤维直径与常规plga电纺纤维膜并没有明显的区别，但悬热处理plga电纺纤维膜直径存在一定程度的增大。
）检测plga电纺纤维膜的皱缩体积比
plga电纺纤维膜皱缩体积比具体的检测方法如下：
用游标卡尺和测厚规分别测量纤维膜在处理前和处理后的尺寸及厚度。通过sem观察纤维膜维形貌的变化，并用imagej统计纤维直径。其皱缩体积比的定义如下：
r=v/v0×100%
其中，r表示皱缩体积比，其中当r值越大，表示纤维膜的空间稳定性越好；v0表示纤维膜处理前的初始体积；v表示纤维膜处理后皱缩后的体积。
其中实施例1制备的常规plga电纺纤维膜在37℃的pbs中浸泡1d的sem图如图4所示，从图4（a）中可看出常规plga电纺纤维膜在经过浸泡后出现了非常严重的皱缩现象，其皱缩体积比为35.3%，由图4（b）得到纤维直径分布增加至809.7±277.8nm。
发明人经过多次的实验发现制备得到的电纺纤维膜在75%酒精浸泡4h后，皱缩即可达到终点。实施例1制备的固热处理plga电纺纤维膜在75%酒精中浸泡4h后的sem图如图5（a）所示，其皱缩体积比为58.9%，比常规的plga电纺纤维膜高出23.6%，由图5（b）可知其纤维直径分布在879±257.2nm；悬热处理plga电纺纤维膜在75%酒精中浸泡4h后的sem图如图5（c）所示，其皱缩体积比为45.5%，比常规的plga电纺纤维膜高出10.2%，但低于固热处理plga电纺纤维膜，由图5（d）可知其纤维直径分布在816.3±243.6nm。
从上述sem图中可知，经过浸泡处理的固热处理plga电纺纤维膜和悬热处理plga电纺纤维膜保持了纤维膜原有的整体形貌；通过皱缩体积比的比较可知，热处理plga电纺纤维膜的空间稳定性得到了较好的提升，对比固定热处理和悬浮热处理的方式，两种热处理plga电纺纤维膜在75%酒精中浸泡4h后纤维直径分布并无明显的差异，但固定热处理较悬浮热处理的皱缩体积比明显增大，表明固定热处理的方式能够更好的维持纤维膜的空间体积稳定性。
实施例2制备的复合plga电纺纤维膜在75%酒精中浸泡4h后的sem图如图6（a）所示，其皱缩体积比为68.1%，比常规的plga电纺纤维膜高出32.8%，同样高于固定热处理plga电纺纤维膜的皱缩体积比，由图6（b）可知其纤维直径分布在836.5±234nm，表明复合plga电纺纤维膜的空间稳定性优于固热处理plga电纺纤维膜，更优于常规的plga电纺纤维膜。
）检测plga电纺纤维膜的降解性能
降解性能的具体检测方法如下：
将plga电纺纤维膜在75%酒精中浸泡4h，然后用去离子水清洗，然后加入1mlpbs浸泡，选择28d为样品降解终点，将样品用去离子水清洗，冻干，sem观察纤维膜降解后的表面形貌。依据样品的表面形貌及其纤维丝之间的粘合情况判断其降解程度。
选择常规plga、固热处理plga膜和复合plga电纺纤维膜为测试对象，按照上述方法进行检测，检测结果见图7所示。
常规plga电纺纤维膜的降解sem图如图7（a）所示，从图中可知常规plga电纺纤维膜经过28d的降解后，其纤维丝之间出现了非常严重的粘合现象，表明其发生了很大程度的降解；固热处理plga电纺纤维膜的降解sem图如图7（b）所示，从图中可知固热处理plga电纺纤维膜经过28d的降解后，其纤维丝之间仍然存在明显的界限，其粘合现象极少，表明其降解程度非常轻微。复合plga电纺纤维膜的降解sem图如7（c）所示，从图中可知复合plga电纺纤维膜经过28d的降解后，其纤维丝之间出现轻微的粘合，但纤维丝之间的粘合程度明显少于常规plga电纺纤维膜。
由上述结果可知，固热处理plga电纺纤维膜和复合plga电纺纤维膜的降解速率均慢于常规plga电纺纤维膜，特别是固热处理plga电纺纤维膜，其降解速率得到极为显著的降低，其与复合plga电纺纤维膜非常适合用于制备组织工程长期修复的支架。
）检测plga纤维膜的生物学特性
检测p3代大鼠的脂肪干细胞在固热处理plga电纺纤维膜上培养2d、4d、6d后的细胞的增殖情况，以常规plga电纺纤维膜为对照例。具体的检测步骤如下：
（1）cck-8储存液与培养基按1:10的比例混合，吸出旧培养基，每孔加入400μl的cck-8染色液后在37℃，避光条件下培养3小时，将变色的染色液移入96孔板中，使用酶标仪检测在450nm处的吸光值。
（2）脂肪干细胞在成骨诱导21天后，用ph约为4.2的茜素红进行染色，具体方法为：2.5%的戊二醛固定细胞，固定后先用超纯水洗3次，再用pbs洗3次，每孔500ul的染液，置于摇床上染色1h，吸去染液，超纯水洗3次，5min/次，摇床，pbs洗1次，5min，去pbs加超纯水，光镜下拍照。
细胞的增殖情况如图8所示，从图中可知，与常规plga电纺纤维膜相比，细胞在固热处理plga电纺纤维膜上的数量明显较多，表明固热处理plga电纺纤维膜更有利于细胞的增殖。
细胞的分化情况如图9所示。从图9（a）光镜照片可以看出样品被染成了褐红色，表明膜上有钙类物质的沉积，通过9（b）宏观照片可以发现，热处理纤维膜上有大量的沉积颗粒出现，以上都表明大鼠脂肪干细胞成功分化成成骨细胞，并形成钙结节。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。