一种秸秆纳米纤维素及高含量抗性淀粉的制备方法与流程

本发明涉及淀粉加工技术领域，具体涉及一种秸秆纳米纤维素及高含量抗性淀粉的制备方法。

背景技术：

抗性淀粉(resistantstarch)又称抗酶解淀粉及难消化淀粉，在小肠中不能被酶解，但在人的肠胃道结肠中可以与挥发性脂肪酸起发酵反应。抗性淀粉存在于某些天然食品中，如马铃薯、香蕉、大米等都含有抗性淀粉，特别是高直链淀粉的玉米淀粉含抗性淀粉高达60％。这种淀粉较其他淀粉难降解，在体内消化缓慢，吸收和进入血液都较缓慢。其性质类似溶解性纤维，具有一定的瘦身效果，近年来开始受到爱美人士的青睐。抗性淀粉可抵抗酶的分解，在体内释放葡萄糖缓慢，具有较低的胰岛素反应，可控制血糖平衡，减少饥饿感，特别适宜糖尿病患者食用，而食用抗性淀粉含量低的淀粉会导致人体血糖不平衡。现有技术并没有提供一种提高抗性淀粉含量淀粉的制备方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种秸秆纳米纤维素及高含量抗性淀粉的制备方法。本发明提供的秸秆纳米纤维素制备方法操作简单，能够提高淀粉中抗性淀粉的含量。本发明制备得到的抗性淀粉含量高的淀粉能够通过抑制淀粉酶或糖化酶活性，降低淀粉的消化，实现人体血糖平衡的调控。

本发明提供了一种秸秆纳米纤维素的制备方法，包括以下步骤：

将过20～100目筛的秸秆纤维素与质量百分浓度为60～70％的硫酸溶液按照质量比为1:10～1:50混合，于40～50℃恒温水浴搅拌条件下进行第一超声处理，处理60～120min后采用8～12倍硫酸溶液体积的水终止反应，离心得到沉淀；将得到的沉淀用水清洗至ph为7，将沉淀与水混合后进行第二超声处理使沉淀分散，冷冻干燥，得到秸秆纳米纤维素。

优选的是，所述第一超声处理的工作频率为35～45hz。

优选的是，所述第二超声处理的工作频率为35～45khz，时间为25～50s。

优选的是，所述离心的条件为12000r/min，15min。

本发明还提供了了基于上述技术方案所述秸秆纳米纤维素提高淀粉中抗性淀粉含量的方法，包括以下步骤：

将淀粉和秸秆纳米纤维素混合，在搅拌的条件下，80～100℃加热糊化1h，冷却至4℃，静置12～24h，干燥粉碎。

优选的是，所述淀粉包括玉米淀粉、马铃薯淀粉、小麦淀粉和木薯淀粉中的任意一种或几种。

优选的是，所述秸秆纳米纤维素与淀粉的质量比为1：(2.5～10)。

本发明还提供了基于上述技术方案所述制备方法得到的秸秆纳米纤维素测定消化酶活性的方法，所述消化酶包括淀粉酶或糖化酶，所述方法包括以下步骤：

1)将淀粉与ph为5.2的磷酸盐缓冲液混合，得到淀粉溶液，将上述技术方案所述方法制备的秸秆纳米纤维素与淀粉溶液混合，超声处理15min，所述超声处理的工作频率为40khz，沸水浴糊化30min，冷却至50℃水浴反应10min，得到淀粉-纳米纤维素混合悬浮液；

2)在淀粉-纳米纤维素混合悬浮液中加入消化酶，在150r/min转速下，50℃水浴反应20min，得到酶解液；

3)将酶解液与体积浓度66％的乙醇融合混合灭酶后，离心得到上清液，采用3，5-二硝基水杨酸法对所述上清液进行酶活的测定。

优选的是，所述步骤3)中的酶解液和乙醇溶液的体积比为1:10；所述上清液和3，5-二硝基水杨酸混合的体积比为4:3。

优选的是，所述步骤2)的反应中ph值为3.8～9.8。

本发明提供了一种秸秆纳米纤维素及高含量抗性淀粉的制备方法。本发明提供的秸秆纳米纤维素的制备方法方法操作简单，绿色环保，成产成本低，能够提高淀粉中抗性淀粉的含量。本发明通过利用安全无毒的秸秆纳米纤维素，能够实现酶活性的抑制，避免人体内的毒性和免疫排斥反应，在保证能够被机体吸收、代谢、排泄的情况下，不对机体产生不利影响。且本发明制备得到的抗性淀粉含量高的淀粉能够通过抑制淀粉酶或糖化酶活性，降低淀粉的消化，实现人体血糖平衡的调控。

附图说明

图1为本发明实施例4提供的秸秆纳米纤维素的透射图；

图2为本发明实施例4提供的秸秆纳米纤维素的x-射线衍射图；

图3为本发明实施例4提供的不同浓度秸秆纳米纤维素(0,0.04％,0.08％,0.12％,0.16％)与0.1％α-淀粉酶共混20分钟的紫外光谱；

图4为本发明实施例4提供的不同浓度秸秆纳米纤维素(0,0.04％,0.08％,0.12％,0.16％)与0.1％糖化酶共混20分钟的紫外光谱；

图5为本发明实施例4提供的不同浓度秸秆纳米纤维素与0.1％α-淀粉酶共混20分钟的荧光光谱；

图6为本发明实施例4提供的不同浓度秸秆纳米纤维素与0.1％糖化酶共混20分钟的荧光光谱；

图7为本发明实施例4提供的秸秆纳米纤维素与0.1％α-淀粉酶共混20分钟对酶活的抑制率(dns法测定α-淀粉酶酶活)；

图8为本发明实施例4提供的秸秆纳米纤维素与0.1％糖化酶共混20分钟对酶活的抑制率(dns法测定α-淀粉酶酶活)；

图9为本发明实施例4提供的秸秆纳米纤维素与0.1％α-淀粉酶在不同温度对酶活的抑制率；

图10为本发明实施例4提供的秸秆纳米纤维素与0.1％糖化酶在不同温度对酶活的抑制率；

图11为本发明实施例4提供的秸秆纳米纤维素与0.1％α-淀粉酶在不同ph对酶活的抑制率；

图12为本发明实施例4提供的秸秆纳米纤维素与0.1％糖化酶在不同ph对酶活的抑制率。

具体实施方式

本发明提供了一种秸秆纳米纤维素的制备方法，包括以下步骤：

将过20～100目筛的秸秆纤维素与质量百分浓度为60～70％的硫酸溶液按照质量比为1:10～1:50混合，于40～50℃恒温水浴搅拌条件下进行第一超声处理，处理60～120min后采用8～12倍硫酸溶液体积的水终止反应，离心得到沉淀；将得到的沉淀用水清洗至ph为7，将沉淀与水混合后进行第二超声处理使沉淀分散，冷冻干燥，得到秸秆纳米纤维素。本发明优选将秸秆纤维素过60～80目筛。在本发明中，优选使用质量百分浓度为64％的硫酸溶液与秸秆纤维素混合。在本发明中，恒温水浴的温度优选为45℃。在本发明中，所述终止反应优选添加10倍体积的硫酸溶液，所述终止反应用硫酸溶液的浓度优选为60～80％。在本发明中，所述搅拌的转速为100r/min。在本发明中，所述第一超声处理的工作频率为35～45khz，更优选为40khz，时间为60～120min更优选为90min，所述第一超声处理的作用是使纤维素能够分散在体系中，纤维形态发生膨胀，结构变疏松，表面出现裂纹、分丝纵裂和破碎现象，利于增加反应试剂和溶剂对纤维素的可及度；所述第二超声处理的工作频率为35～45khz，更优选为40khz，时间为25～50s，更优选为30s，所述第二超声处理能够实现沉淀的分散。在本发明中，所述离心的条件为12000r/min，15min。本发明所述制备方法得到的秸秆纳米纤维素的用途为作为淀粉类食物添加剂的活性成分，起到的作用为抑制消化酶的活性，降低淀粉的消化。

本发明还提供了基于上述技术方案所述秸秆纳米纤维素提高淀粉中抗性淀粉含量的方法，包括以下步骤：

将淀粉和秸秆纳米纤维素混合，在搅拌的条件下，80～100℃加热糊化1h，冷却至4℃，静置12～24h，干燥粉碎。本发明对所述淀粉的种类没有特殊的限制，在本发明中，所述淀粉包括玉米淀粉、马铃薯淀粉、小麦淀粉和木薯淀粉中的任意一种或几种。本发明对所述淀粉的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的淀粉的市售产品即可。本发明对所述干燥粉碎的方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的干燥机或粉碎机进行粉碎即可，所述粉碎后的粒度优选为20～100目，更优选为60～80目。本发明提供的利用在淀粉中添加秸秆纳米纤维素，添加的秸秆纳米纤维素能够抑制体内消化酶的酶活，从而抑制淀粉在体内消化过程，此制备方法操作简单，能够提高淀粉中抗性淀粉的含量，实现人体血糖平衡的调控。

在本发明中，所述秸秆纳米纤维素与淀粉的混合质量比为1：(2.5～10)。

本发明还提供了基于上述技术方案所述制备方法得到的秸秆纳米纤维素测定消化酶活性的方法，所述消化酶包括淀粉酶或糖化酶，所述方法包括以下步骤：

1)将淀粉与ph为5.2的磷酸盐缓冲液混合，得到淀粉溶液，将秸秆纳米纤维素与淀粉溶液混合，超声处理15min，所述超声处理的工作频率为40khz，沸水浴糊化30min，冷却至50℃水浴反应10min，得到淀粉-纳米纤维素混合悬浮液；

2)在淀粉-纳米纤维素混合悬浮液中加入消化酶，在150r/min转速下，50℃水浴反应20min，得到酶解液；

3)将酶解液与体积浓度为66％的乙醇融合混合灭酶后，离心得到上清液，采用3，5-二硝基水杨酸法对所述上清液进行酶活的测定。

本发明将淀粉与ph为5.2的磷酸盐缓冲液混合，得到淀粉溶液，将秸秆纳米纤维素与淀粉溶液混合，超声处理15min，所述超声处理的工作频率为40khz，沸水浴糊化30min，冷却至50℃水浴反应10min，得到淀粉-纳米纤维素混合悬浮液。在本发明中，所述超声处理的作用为促进秸秆纳米纤维素的分散。在本发明中，所述秸秆纳米纤维素与淀粉的混合质量比为1：(2.5～10)，更优选为1：8。

水浴锅中平衡后，本发明在淀粉-纳米纤维素混合悬浮液中加入消化酶，在150r/min转速下，50℃水浴反应20min，得到酶解液。在本发明中，所述消化酶的体积百分终浓度优选为0.1％。在本发明中，所述酶解反应中ph值为3.8～9.8，更优选为5～8。在本发明中，加入消化酶后，优选在混合液中加入玻璃珠，所述玻璃珠的数量优选为1～5颗/ml。本发明对所述消化酶的种类没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的消化酶即可，如淀粉酶、糖化酶、蛋白酶等。

得到酶解液后，本发明将酶解液与体积浓度为66％的乙醇融合混合灭酶后，离心得到上清液，采用3，5-二硝基水杨酸法对所述上清液进行酶活的测定。在本发明中，所述酶解液和乙醇溶液的体积比为1:10。在本发明中，所述离心的条件优选为12000r/min，离心25min。本发明对所述3，5-二硝基水杨酸法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规3，5-二硝基水杨酸法对酶活性进行测定即可。在本发明中，所述3，5-二硝基水杨酸法的具体步骤优选为：将离心后的上清液与3，5-二硝基水杨酸溶液混合，沸水浴7min，流动水冷却至室温，以空白管(不加秸秆纳米纤维素)为对照，在540nm波长下测定各管吸光度(抑制率(％)＝[(对照的吸光值-样品的吸光值)/对照的吸光值]/100)。在本发明中，所述离心后上清液和3，5-二硝基水杨酸混合的体积比为4：3。所述3，5-二硝基水杨酸的质量浓度为0.315％。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种秸秆纳米纤维素及高含量抗性淀粉的制备方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

秸秆纳米纤维素的制备：

将过60目筛的秸秆纤维素与质量百分浓度为64％的硫酸溶液按照质量比为1:30混合，于45℃恒温水浴搅拌条件下进行40khz第一超声处理，处理90min后采用10倍硫酸溶液体积的水终止反应，离心得到沉淀；将得到的沉淀用水清洗至ph为7，将沉淀与水混合后进行40khz第二超声处理30s使沉淀分散，冷冻干燥，得到秸秆纳米纤维素。

实施例2

秸秆纳米纤维素的制备：

将过100目筛的秸秆纤维素与质量百分浓度为70％的硫酸溶液按照质量比为1:45混合，于50℃恒温水浴搅拌条件下进行40khz第一超声处理，处理60min后采用12倍硫酸溶液体积的水终止反应，离心得到沉淀；将得到的沉淀用水清洗至ph为7，将沉淀与水混合后进行40khz第二超声处理45s使沉淀分散，冷冻干燥，得到秸秆纳米纤维素。

实施例3

秸秆纳米纤维素的制备：

将过30目筛的秸秆纤维素与质量百分浓度为60％的硫酸溶液按照质量比为1:20混合，于40℃恒温水浴搅拌条件下进行40khz第一超声处理，处理65min后采用12倍硫酸溶液体积的水终止反应，离心得到沉淀；将得到的沉淀用水清洗至ph为7，将沉淀与水混合后进行40khz第二超声处理25s使沉淀分散，冷冻干燥，得到秸秆纳米纤维素。

实施例4

秸秆纳米纤维素提高玉米淀粉的抗性淀粉含量

以20g玉米淀粉为基准，准确称取占玉米淀粉干基重10％、20％、30％、40％的实施例1得到的秸秆纳米纤维素，分别置于称有50ml水的烧杯中，超声分散。将秸秆纳米纤维素的分散液放在磁力搅拌器上，加入相应质量的玉米淀粉(18g、16g、14g、12g)，在搅拌条件下，80℃加热糊化1h，冷却至4℃，静置20h，烘干。将烘干的含有秸秆纳米纤维素的玉米淀粉研磨，100目过筛。对照组将秸秆纳米纤维素全部替换为玉米淀粉。

实验结果及分析：

如图1所示，采用透射方法：

将秸秆纳米纤维素颗粒分散在十二烷基硫酸钠(sds)中，超声处理15min，用碳膜蘸一滴秸秆纳米纤维素的悬浮液，真空冷冻干燥。

如图2所示，x-射线衍射方法：

样品用x-射线衍射仪测得。测试条件为：特征射线cu-kα，石墨单色器，管压为40.0kv，电流100ma，扫描速率为1°/min，测量角度2θ＝4–40°，步宽为0.02°，发射狭峰为1°，防发射狭峰为1°，接收狭峰为0.3mm。

如图1所示，为酸水解条件下制得的秸秆纳米纤维素透射图，由图1中可以看出，硫酸水解处理得到的秸秆纳米纤维素呈均一的棒状结构，长度大约为100～400nm，宽度为10～50nm左右。从图2中的x射线衍射图可以看出，秸秆纳米纤维素相对于原纤维其结晶度出现了明显的增长，从42.6％增长到78.8％。硫酸水解处理得到的秸秆纳米纤维素产物为长杆状结构，酸水解去除了纤维素的无定形去而保留了结晶区，从而明显的提高了秸秆纳米纤维素的结晶度。

如图3和图4所示，紫外光谱测定的方法：

α-淀粉酶和糖化酶的浓度固定为0.1％，秸秆纳米纤维素的浓度分别为(0，0.04％，0.08％，0.12％，0.16％)，酶与纳米纤维等体积混合5分钟之后测定紫外吸收光谱，测量范围是240～340nm。

由图3和图4可以看出，添加秸秆纳米纤维素后，两种酶的吸光度变化规律大致相同。随着秸秆纳米纤维素浓度的增加，吸光度值增加，体系呈现明显的增色效应。当在酶中添加秸秆纳米纤维素的时候，秸秆纳米纤维素会诱导酶分子中蛋白肽链伸展，使酶分子内部的氨基酸残基的芳杂环疏水基团裸露出来，从而使酶的吸光度值增加。

如图5和图6所示，荧光光谱测定的方法：

使用光程路径1cm，体积3.0ml石英池，α-淀粉酶和糖化酶浓度固定在0.1％，向其中滴加浓度为0，0.04％，0.08％，0.12％，0.16％的秸秆纳米纤维素，等体积混合5分钟后在25条件下测量α-淀粉酶和糖化酶荧光光谱。激发波长为278nm，扫描范围是300～480nm，激发和发射带宽均为5.0nm，并记录扫描数据。

由图5和图6可以看出，随着秸秆纳米纤维素浓度的增加，两种酶的荧光强度出现了明显的下降趋势。表明体系中加入秸秆纳米纤维素引起了淀粉酶和糖化酶的内源荧光的猝灭，说明秸秆纳米纤维素的加入引起了酶结构的变化，使酶中的荧光基团周围环境的极性发生了改变。秸秆纳米纤维素可以跟酶发生相互作用，从而抑制酶活。

如图7和图8所示，dns法测定α-淀粉酶酶活：

取样品管进行编号，准确称取淀粉200mg(干基重)于各管中，采用10mlph为5.2的磷酸盐缓冲液充分溶解，分别添加不同添加量的秸秆纳米纤维素(0mg、20mg、40mg、60mg、80mg)于各淀粉溶液中，进行超声分散(40khz，15min)后沸水浴糊化30min冷却，之后于50℃水浴锅中平衡10min。各管中分别加入50颗玻璃珠，添加浓度为0.1％(w/v)的α-淀粉酶液(糖化酶液)10ml到淀粉与秸秆纳米纤维素的混合悬浮液中，50℃条件下于150r/min的水浴中进行计时震荡。反应进行至20min时准确取出1ml酶解液加入到10ml浓度为66％的乙醇溶液进行灭酶操作，后采用12000r/min的离心机离心25min，通过3，5-二硝基水杨酸法(dns)法测定，取2ml离心后的样品上清液，加入1.5mldns溶液充分混匀，沸水浴中7min，流动水冷却至室温并补水至20ml，以空白管为对照，于540nm波长下测定各管的吸光度。秸秆纳米纤维素的添加量分别为0、0.04％、0.08％、0.12％、0.16％、0.20％、0.24％以及0.28％(淀粉溶液)；不同酸碱范围内秸秆纳米纤维素对淀粉酶活性的影响的ph选择以下几个条件：3.8、5.8、7.8；不同温度范围内秸秆纳米纤维素对淀粉酶活性的影响的选择以下几个条件：30℃、50℃、70℃、90℃。实验中样品均设定三组平行。如图9和图10所示，可以看出，秸秆纳米纤维素与淀粉酶和糖化酶作用后，抑制了酶的活性，主要是由于纳米纤维可以与酶交互作用，进而引起了酶结构特性的改变，从而降低了酶活。

如图11、图12所示，cd谱的测量：

α-淀粉酶和糖化酶的cd光谱用mos-450/af-cd圆二色光谱仪进行测定，同时用jasco软件进行控制，用光径为1.0cm的石英池盛放样品，扫描范围为190～250nm，扫描速度为50nm/min，在充满氮气环境下进行，对添加等体积不同浓度秸秆纳米纤维素的酶进行cd测量。配置α-淀粉酶和糖化酶为0.5％。保持酶的浓度恒定，秸秆纳米纤维素的浓度分别为0，0.04％，0.08％，0.12％，0.16％。将蒸馏水作为空白对照，并在扫描过程中，手动去除。每个样品至少扫描五次，二级结构的数据根据http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk(lobley,whitmoreandwallace,2002；whitmoreandwallace,2004)换算得到。秸秆纳米纤维素对α-淀粉酶和糖化酶二级结构的影响结果如表1所示。

表1秸秆纳米纤维素对α-淀粉酶和糖化酶二级结构的影响

随着秸秆纳米纤维素浓度的增加，两种酶的二级结构发生了明显的变化，说明秸秆纳米纤维素与酶发生了相互作用，使酶的肽链伸展，导致α-螺旋结构减少，酶的二级结构发生变化。

准确称取不同种类的淀粉200mg(干基重)及不同添加量的秸秆纳米纤维素(0mg、20mg、40mg、60mg、80mg)加入到10mlph5.2的磷酸盐缓冲液充分溶解，分散后沸水浴糊化30min冷却。冷却至37℃后，取3ml糊化液加入到已预热至37℃的3mlα-淀粉酶与淀粉葡萄糖苷酶的混合液中，震荡酶解120min，分别在反应20min、40min、60min和120min时取样100μl加入到900μl无水乙醇中灭酶。经3000r/min离心5min，通过3,5-二硝基水杨酸法(dns)法测定秸秆纳米纤维素对淀粉消化性的影响，取2ml离心后的样品上清液，加入1.5mldns溶液充分混匀，沸水浴中7min，流动水冷却至室温并补水至20ml，以空白管为对照，于540nm波长下测定各管的吸光度，计算出淀粉中rds、sds、rs的含量，实验中样品均设定三组平行。

公式为：rds％＝(g20-fg)×0.9×100％/ts

sds％＝(g120-g20)×0.9×100％/ts

rs％＝(ts-fg)×0.9×100％/ts-(rds+sds)

式中：g20：淀粉酶水解20min后葡萄糖的产生量(mg)

fg：淀粉酶水解处理前淀粉中游离葡萄糖的含量(mg)

g120：淀粉酶水解120min后葡萄糖的产生量(mg)

ts：样品中总淀粉的含量(mg)。

表2不同秸秆纳米纤维素添加量对玉米淀粉消化性的影响

表3不同秸秆纳米纤维素添加量对豌豆淀粉消化性的影响

表4不同秸秆纳米纤维素添加量对马铃薯淀粉消化性的影响

通过秸秆纳米纤维素对三种淀粉消化性影响(结果如表2、3和4)的比较，可知其对三种淀粉rds的影响为玉米淀粉>豌豆淀粉>马铃薯淀粉，对sds的影响为马铃薯淀粉>玉米淀粉>豌豆淀粉，而对于rs的影响为玉米淀粉>马铃薯淀粉>豌豆淀粉，这可能是由于三种淀粉具有不同的晶型，同时具有不同的直链和支链淀粉含量有关，秸秆纳米纤维素高的长径比与结晶强度会与复合酶发生相互作用，从而作用了复合酶液的催化活性中心，抑制了酶的活性，对于作用直链和支链淀粉的酶活性产生影响从而影响了消化性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。