本发明涉及一种用于检查试样、尤其是在光片显微镜中检查试样的方法和设备。
背景技术：
在spim技术(选择性光片照明显微镜)中进行层式照射试样，该spim技术允许比例如在点式扫描试样时更快速地并且更珍惜试样地检测图像数据。spim技术的已知的应用领域是荧光显微镜领域，其中，利用激光激励在试样中的荧光。在这里，在spim技术中仅仅在一个照射光片(也称为“光带”)中发生激励。由此避免了在其它平面中的照射光损坏试样。
根据spim技术工作的光学设备在de10257423a1中有所描述。在该显微镜中利用薄的光片照射试样，而从垂直于照射光片的平面的方向进行观察。在这里，照射和检测经由两个单独的光路利用相应单独的光学装置进行。光片由圆柱透镜产生。为了拍摄照片，使试样运动通过关于检测器固定的光片，以便层式地利用一个面状的检测器拍摄荧光和/或散射光。接着，如此获得的层图像数据可以组合成一个与试样的三维图像相应的数据组。
由de102007015063a1已知一种光学配置系统，其包括用于发射光束的光源并且包括用于将该光束转变成光片形状的光学元件。该光学配置系统尤其是适合于在选择性光片照明显微镜(spim)中照射三维试样的个别平面。设有用于改变光片横截面的、用于改变光片长度的和/或用于影响在光片之内延伸的光线部分的方向的器件，以便能在利用多个不同类型的物镜观察同一个试样平面时按照射要求实现光片的几何结构的匹配。
代替直接照射试样，也可以以渐逝波的方式照射试样。在这里，激励光在与试样的界面上全反射，其中，通过随着进入深度渐渐消失的渐逝波的电磁场激励试样。对于这种类型的试样检查，已经引入概念tirf显微镜(全内反射荧光显微镜、内部全反射荧光显微镜)。
技术实现要素：
本发明的目的在于，提供一种用于检查试样的方法，该方法在图像质量改善的情况下允许能良好地接近试样。
所述目的通过一种方法实现，该方法的特征在于如下步骤：
a.利用光源产生照射光束，
b.利用分裂器件将照射光束在空间上分裂成至少两个子照射光束，
c.通过一个对于两子照射光束共用的照射透镜引导子照射光束，
d.在子照射光束已经穿过照射透镜之后利用至少一个转向机构使所述子照射光束之中的至少一个子照射光束转向，使得子照射光束在一个照射平面中相互干涉，从而在照射平面产生一个照射图案，和
e.产生由照射图案照射的试样区域的图像，其中，从试样区域出来的检测光通过检测透镜到达位置分辨的检测器。
本发明的另一目的在于给出一种用于检查试样的设备，该设备在图像质量改善的情况下允许能良好地接近试样。
该目的通过一种设备实现，该设备包括：
a.产生照射光束的光源，
b.分裂器件，该分裂器件将照射光束在空间上分裂成至少两个子照射光束，
c.照射物镜，该照射物镜被子照射光束穿过，
d.至少一个转向机构，该转向机构在子照射光束已经穿过照射物镜之后使所述子照射光束之中的至少一个子照射光束转向，使得子照射光束在照射平面中相互干涉，从而在照射平面中产生照射图案，和
e.位置分辨的检测器，用于产生由照射图案照射的试样区域的图像，其中，从试样区域出来的检测光通过检测物镜到达位置分辨的检测器。
本发明具有相当特别的优点，即，通过利用照射图案照射，在光片显微镜中和/或在tirf显微镜中能实现改善图像质量。这一方面通过如下方式，即，通过利用通过至少两个子照射光束的干涉产生的照射图案照射，至少能实现抑制背景。尤其是，如在下文还将进一步详细描述的，还可以有利地甚至实现提高分辨率。在此，相当特别有利的是，用于产生照射图案用来干涉的各子照射光束穿过同一照射物镜，从而在试样的区域内仅需要设置一个唯一的照射物镜，这能实现试样的特别良好的可接近性。
虽然原理上已知在远场显微镜或tirf显微镜中通过结构化的照射提高在显微镜中的侧向分辨率和图像对比度。但通过检测物镜的照射具有如下缺点，即，干涉图案的可能的入射角因而以及可能的周期由于检测物镜的数值孔径很受限制。迄今为止，在spim显微镜中通过结构化的照射在图像平面中各向同性的或者说沿着所有三个空间方向各向同性的分辨率提高是未知的。
通常适用的是，分辨率提高取决于格栅的周期。当利用格栅通过检测物镜实现照射时，这大多以这种方式实现，即，照射光相对于光轴以陡峭的角度沿着两个相向的方向入射到试样体积中，从而产生驻波作为干涉图案，该驻波的周期取决于两条光线之间的角度2α。在此，角度α＝arcsin(na/n)尤其是取决于检测物镜的数值孔径(na)和介质的折射率。典型地，在水(n＝1.33)中na<1.2并且因而α<65度。在各种情况下，角度α明显小于90度，其中，90度的角度本是最佳的，以便实现干涉图案的最小周期。不利地，干涉用的光束在其到达检测物镜的焦点平面之前和之后透射试样的大部分并且在那里、亦即在检测物镜(在tirf中外部)的焦点平面上方和下方激励荧光，这在图像中引起明显的背景信号，在那里不必要地使试样的荧光变淡并且由于光毒性效应损坏试样。
按照本发明，这些缺点在试样的spim检查中有利地得到避免或者减少。在这里，尤其是为了提高分辨率，甚至可以通过叠加2、3或者还要更多数量的子照射光束产生照射图案，而不需要同样多数量的照射物镜。适用多个照射物镜将会是昂贵的、复杂的并且易受干扰的。忽略这一点，几乎不可能将一个对于实现高分辨率必需的检测物镜与多个、例如四个照射物镜在空间上这样组合，使得照射物镜能将必需的子照射光束聚焦到检测物镜的焦点平面中，因为高孔径的物镜具有大的直径并且要求短的工作距离，从而当不使用特定的并且由此昂贵的具有特别大工作距离和典型小的数值孔径的照射物镜时，发生物镜在空间上的碰撞。在使用多个照射物镜时另一困难将会在于，高孔径的物镜也操纵光的极化，从而这导致子照射光束的不完全的干涉，由此例如不强烈地影响照射图案的零位和/或照射图案的对比度总体上减小，这对于图像质量是不利的。本发明避免这些缺点。
尤其是为了产生在图像平面中各向同性叠加的图像，可以在照射平面中在时间上相继产生不同的和/或不同定位的和/或不同定向的照射图案，利用所述照射图案相应地照射同一试样区域。据此可以将按这种方式产生的图像的数据相互结算，用以总体上实现分辨率提高。为此可以使照射图案例如在格栅常数方面和/或在其位置方面和/或在其定向方向按不同的方式改变，以便相应地产生改变的照射图案。
例如可以改变子照射光束的相对相位。这例如可以通过改变干涉的子照射光束的部分数量的光程来实现。替代地或附加地，也可以改变干涉的子照射光束的入射方向。这例如可以通过如下方式实现，即，使子照射光束在它们干涉之前分别利用多个不同设置的转向机构或一个转向机构的不同设置的转向元件转向，从而干涉的子照射光束分别从不同的方向入射，这更在下文还要更详细地阐述。
替代地或附加地，也可以改变干涉的子照射光束到照射平面上的入射角，尤其是以便改变例如格栅常数。
在按照本发明的方法的一种相当特别有利的实施方案中，除了所述照射图案之外还产生一个另外的照射图案，该另外的照射图案相干地或非相干地叠加于所述照射图案。
例如，一个另外的照射图案可以通过如下方式产生，即，由照射光束分裂出至少两个另外的子照射光束，所述另外的子照射光束在照射平面中相互干涉，从而在照射平面中产生另一照射图案。替代地也可能的是，借助另一光源产生至少两个另外的子照射光束，所述另外的子照射光束在照射平面中相互干涉，从而在照射平面中产生另一照射图案。
按这种方式例如还可以产生高分辨的图像。通过多个照射图案的叠加，在照射平面中总体上产生高频的照射图案。如果改变相应属于一个照射图案的子照射光束的相对相位，则由此也改变高频的格栅的相位，从而相应得到的图像数据可以作为原始数据用于产生或计算在照射平面中被照射的试样区域的高分辨的和/或对比度提高的图像。在这里，尤其是可以有利地规定，在照射平面中利用多个交叉的、彼此相干叠加的照射格栅照射试样。
除了照射图案的相干叠加、尤其是交叉的照射格栅的叠加之外，如已经提到的，也存在所述照射图案与至少一个另外的照射图案非相干叠加的可能性。(两个叠加类型的主要区别在于：在一种情况下产生孤立的极大值，例如为了激励，在另一种情况下产生孤立的极小值/零位。非相干叠加可以理解成两个格栅的简单和：格栅彼此叠加，而不会由于干涉发生任何偏差。)得到的照射图案一方面便具有环形的特征。尤其是，八个零位便仅仅还位于两个交叉的格栅的(线形)零位的中心或者说交叉点。在一个照射图案与唯一一个另外的在照射平面中转动了90度的另外的照射图案非相干叠加时，八个零位仅还位于由四个相邻的点(强度极大值)形成的正方形之内的照射平面的中心。此外，通过非相干叠加产生的总照射图案另一方面具有更小的周期。尤其是，通过非相干叠加产生的照射图案也可以用于并行的sted或resolft试验，当在时间上并行地或交替地入射适当的其他波长的激励光时(在可切换的荧光情况下交替，在sted/resolft类型的技术情况下同时)。
尤其吸引人地，具有不同波长的两个格栅叠加也是可能的。利用第一波长的光通过相干叠加产生点格栅，其极大值位于格栅的零位，该格栅是已利用第二波长的光产生并且通过非相干叠加产生。在此，第一波长适合于激励荧光，第二波长适合于借助sted工艺刺激激发或用于借助resolft切换荧光，如下文将阐述的那样。
相对于用于resolft试验(可逆饱和荧光跃迁)的远场实现，本发明在得到的照射图案的较高空间频率和可由此实现的较高分辨率方面提供相当特别的优点。此外，在resolft试验中和在sted试验(受激发射损耗)中，由于较高的格栅频率而能在照射光功率较小的情况下实现较高的分辨率。此外，本发明也通过更有效地利用光而是适宜的，因为在照射平面之外仅仅在一个窄的范围内进行照射。
在一种相当特别有利的实施方案中，所述干涉的子照射光束和/或所述另外的干涉的子照射光束构成为贝塞尔光束。按相当特别有利的方式可以规定，所述干涉的子照射光束和/或所述另外的干涉的子照射光束构成为截面-贝塞尔光束。尤其是，首先可以规定，干涉的贝塞尔光束例如在使用一个或多个在偏转角度方面可调的光线偏转装置的情况下在照射平面中彼此同步地来回运动。
在使用贝塞尔光束或截面贝塞尔光束的情况下照射的背景如下：
如果使穿过环形光阑的光聚焦，则沿着光轴在焦点的区域内由于设计干涉而产生强度极大值。在环形的照射光束的小的部分区域内的干扰在焦点的区域内几乎甚至不作用于光轴，因为在那里整个照射光干涉。在光轴之外在小的部分区域内的渐隐因此对设计干涉几乎没有影响。在焦点的区域内离光轴带有轴向距离地通过如下方式使入射光区域内的干扰“愈合”，即，其余光在干扰的情况下避免由于干扰造成的影子投射。
利用环形照射产生的贝塞尔光束相对于光轴旋转对称。此外，这样的贝塞尔光束在垂直于光轴的横截面内具有同心环形式的强度极大值，其中，最大的强度极大值位于光轴上。
如果现在从横截面为环形的照射光尤其是对称地渐隐区段，则称之为“截面贝塞尔光束”。例如可以使用环形光阑，在该环形光阑中附加地覆盖两个彼此径向对称地相对的周向区域。光然后仅还穿过环形光阑的这两个位于其间的周向区域。这样的“截面贝塞尔光束”的焦点在垂直于光轴的横截面内不是旋转对称的。而是在这样的“截面贝塞尔光束”中原始环形的强度极大值的部分被渐隐，从而彼此并排的相对于光轴凹形定向的弯曲的强度极大值以环形区段或者说“部分”的形式保持。
通过例如在使用在偏转角度方面可调的光线偏转装置的情况下侧向错位了截面贝塞尔光束的格栅周期的一小部分(例如格栅周期的三分之一)，可以相继地产生多个图像(两个或三个图像)并且相应地获得图像数据，从所述图像数据可以计算出一个具有较高对比度的总图像。代替两个或更多个彼此垂直定向的照射图案的叠加，可通过使两个相向行进的截面贝塞尔光束干涉来产生类似的结构。就此而言，按照本发明的方法的这样的实施方式对于实现提高分辨率和/或对于实现提高对比度来说是特别有利的。截面贝塞尔光束的主要优点在于，通过仅仅两个来自相反方向的光束的叠加可以产生格栅。因此仅需要两个镜帽或者说物镜。仅仅当图像场的宽度大于截面贝塞尔光束的宽度时，也还沿侧向借助一个扫描镜使格栅错位的可能性才是必需的。
如果所述照射图案和所述至少一个另外的照射图案应相干干涉，则必须强制性地注意，用于干涉的子照射光束具有相同的极化。在使用转向镜作为转向元件时，在这里要注意，当入射到镜上的子照射光束具有平行于入射平面定向的线性极化时，通过反射改变子照射光束的线性极化方向。与此相反，当相应入射的子照射光束具有垂直于入射平面定向的线性极化方向时，不改变线性极化方向。
如果所述照射图案和所述至少一个另外的照射图案不相干地叠加，则这例如可以通过如下方式实现，即，这些照射图案在叠加的位置处在照射平面内具有不同的极化。例如，由四个子照射光束(各两个)产生的两个彼此垂直定向的照射图案非相干地叠加，其中，子照射光束在照射物镜的入射光瞳中相同地极化，并且所述子照射光束在穿过照射物镜之后分别由四个以正方形相对彼此定向的转向镜之一尤其是以90度转向到照射平面中，因为它们由于所述效应在线性极化方面在反射时、在照射平面中转向之后具有彼此垂直的线性极化方向。
如果希望照射图案的非相干叠加，则可在时间上脉冲式地进行照射，其中，所述照射图案的光脉冲相对于所述另外的照射图案的光脉冲的脉冲长度和重复率以及在时间上的位错这样选择，使得所述照射图案和所述另外的照射图案交替地在不同的时间在照射平面中产生。
替代地，为了产生非相干的叠加，也可以分别利用不同的光源为所述照射图案和为所述另外的照射图案产生光，因为无关的光源的光本身不具有相干性。
用于产生非相干叠加的另一可能性在于，这样构造子照射光束的光程和所述另外的子照射光束的光程，使得各光程长度彼此相差大于相干长度。例如，用于所述照射图案的照射光束可以直接耦合输入到试样体积中，而用于所述另外的照射图案的光通过长于相干长度的长玻璃纤维引导，或者反之亦然。
替代地也可能的是，用于产生所述照射图案的光和用于产生所述另外的照射图案的光分别耦合输入到保持极化的玻璃纤维中，其中，这些光相对彼此扭转或者不相对彼此扭转。在此，光源的光耦合输入到四个纤维中，这四个纤维又将光耦合输入到照射物镜的光瞳中。在此，纤维分别成对地相对设置，并且在此这样转动，使得发射出的光沿相同的方向极化。借助该配置系统，可以按简单的方式在交叉的格栅的相干叠加和非相干叠加之间变换，其方式是其中一对相对的纤维的各个纤维分别以90度绕其自己的轴线转动(更确切地说仅在纤维的一个端部上相对于另一个端部)。
作为另外的替代方案，为了产生非相干叠加，也可以使用调制器、例如aom(声光调制器)或aod(声光偏转器)，以便由此这样操纵所述子照射光束的照射光的频率，使得它们不再与所述另外的子照射光束的不受操纵的光干涉。在此，调制器应该能够例如通过光子-光子相互作用来使光的频率移动。
而如果希望相干叠加，则照射图案之一的两个子照射光束的线性极化方向可以例如借助λ/2板转动。在一种相当特别有利的实施方式中，为此使用具有四个象限的相位板，其中，两个沿对角线相对的象限不影响线性极化方向，而另外两个沿对角线相对的象限分别构造成λ/2相位板。例如，产生所述照射图案的子照射光束可以分别延伸通过两个沿对角线相对的象限之一，而产生所述另外的照射图案的所述另外的子照射光束分别延伸通过另外两个沿对角线相对的象限之一。
相位板可以有利地设置在一个相对于照射物镜的焦点平面共轭的平面中。代替相位板，也可以借助有源光学构件、例如slm(空间光调制器)、尤其是铁电性slm，或者例如借助lcos构件(“硅基液晶”构件)影响极化。使用这样的构件具有相当特别的优点，即，极化可以根据位置并且单独受控制地改变。按这种方式可以有利地简单地、快速地并且可靠地改变所述照射图案和/或所述至少一个另外的照射图案和/或快速地从照射图案的相干叠加切换至照射图案的非相干叠加。
如上面已经阐述的，多个图像的照片拍摄可以分别在利用所述照射图案和/或所述另外的照射图案结构化地照射时通过在照射平面中相继移动相应的照射图案来实现。为此，产生所述照射图案的子照射光束的或产生所述另外的照射图案的所述另外的子照射光束的相对相位可以改变。这例如可以通过改变部分数量的相应干涉的子照射光束或另外的子照射光束的光程长度实现。光程长度的改变例如可以借助主动镜实现，该主动镜例如通过压电元件而移动。替代地或附加地，也可以使用声光元件。作为另外的替代方案，为了改变光程也可以选择性地将具有不同厚度和/或不同光密度的不同的光学元件引入光路中。也可以使用空间光调制器(slm)或数字微镜器件或可变形微镜用于改变光程。
分裂器件例如可以具有简单的分束器或极化分束器。在一种特别的实施方式中，分裂器件具有相位格栅。这样的实施方式是特别有利的，因为可以为不同的子照射光束实现基本上对称的光路。
转向机构例如可以具有一个或多个镜(转向镜)作为转向元件。尤其是，镜可以构造成平的。但也可能的是，一个或多个镜构成为弯曲的。替代地或附加地，也可能的是，转向机构具有至少一个棱镜。
按照本发明的设备可以有利地具有转向机构，该转向机构在照射光束已经穿过照射物镜之后使所述照射光束转向，使得照射光束在照射平面延伸。尤其是，转向机构可以这样设置，使得转向的照射光束相对于照射物镜和/或检测物镜的光轴具有不等于零度的角度。尤其是，照射平面可以垂直于照射物镜的光轴定向。
尤其是可以有利地规定，尤其是成形为光片的照射光束首先沿竖直方向延伸通过照射物镜并且接着沿水平方向利用转向装置转向，以便在试样平面中沿着照射条照射试样。优选地，从照射条出来的检测光、尤其是荧光沿竖直方向延伸通过检测物镜。这样的构造能实现使用竖立的或倒置的标准显微镜支架用于制造按照本发明的光学设备。
在一种相当特别有利的实施方案中规定，照射物镜和例如可以具有一个或多个转向镜的转向装置相对彼此可动地设置，以便能使照射光束相对于试样运动。替代地或附加地也可以规定，转向装置尤其是可动地固定和/或设置在检测物镜或照射物镜上。
优选地，所述照射图案和/或所述另外的照射图案用于在试样平面中激励试样荧光。替代地或附加地同时给试样平面均匀地加载激发光。
相当特别优选地使用所述照射图案用于切换荧光染料。
原理上，可以按特别有利的方式也为resolft类似的效应使用格栅照射(例如sted“受激发射损耗”或gsd“基态损耗”)。与用于荧光激励的结构化的照射的区别在于，用于荧光激励的结构化的或者非结构化的照射或多或少同时地(例如在gatedsted中错位地)与另一结构化的照射(在另一波长)在试样中叠加。例如，“通常的”例如白色的光片入射到试样中并且与例如红色的格栅叠加，其中，红色格栅导致在那里或者激励地激发荧光或者荧光保持在暗态中或者荧光通过形态改变而转变到不能被蓝色光片激励的状态，其中，通过红色的照射总是有效地抑制朝向检测器发生荧光。
按照一种方案，激励光为此也可以具有格栅形状。激励的极大值便必须位于激发的极小值中。在这里有问题的是，光线具有不同的波长，并且因而当格栅按相同的方式产生时也不形成相同的格栅周期。因此，作为解决方案适宜的是，格栅周期以更短的周期延伸，以便使其匹配于更长格栅的周期。这通过如下方式是可实现的，即两个相反的应产生格栅的光束在被照射的平面之内相对彼此倾斜(因而不是以180度的角度相反，而是例如以160的角度相反)。
在此处要指出，这里描述的关于荧光染料可切换性的方案和/或关于resolft、sted、gatedsted和/或gsd的方案可以一方面结合本发明并且另一方面也与本发明具体的特征组合分开地按照原始表述的独立权利要求实现。尤其是，在提到的后一种情况下不必要的是，子照射光束被引导通过一个对于两个子照射光束共同的照射物镜和/或这些子照射光束中的至少一个子照射光束在这些子照射光束已经穿过照射物镜之后利用至少一个转向机构这样转向，使得子照射光束在照射平面中相互干涉，从而在照射平面中产生照射图案。
适合于实施按照本发明的方法的设备可以有利地基于扫描显微镜、尤其是共焦扫描显微镜构造。在这里，尤其是使用倒置的显微镜支架也是适宜的。就此而言，使用(可能在实验室中本就存在的)扫描显微镜用于实施按照本发明的方法是特别有利的。
附图说明
在附图中示例性并且示意性示出本发明主题，并且在下文依据附图对其进行描述，其中，相同的或者作用相同的元件大多设有同样的附图标记。在此：
图1示出按照本发明的设备的细节的一种实施例，
图2示意性示出在构造成spim显微镜的按照本发明的设备中照射图案的产生，
图3示意性示出在构造成spim显微镜的按照本发明的设备中一个照射图案和一个另外的照射图案叠加的产生，
图4示意性示出在构造成spim显微镜的按照本发明的设备中一个照射图案和三个另外的照射图案叠加的产生，
图5示出在构造成spim显微镜的按照本发明的设备中一个照射图案和一个另外的照射图案叠加时的光分布，
图6示出在一个照射图案和一个另外的照射图案相干叠加时的光分布，
图7示出在一个照射图案和一个另外的照射图案非相干叠加时的光分布，
图8示出两个彼此相向的截面-贝塞尔光束的干涉图案，
图9示意性示出在构造成tirf显微镜的按照本发明的设备中照射图案的产生，和
图10示出在图9中示出的设备的细节视图。
具体实施方式
图1示出按照本发明的设备的细节的一个实施例。该设备包括一个分裂器件1，该分裂器件将一个照射光束2在空间上分裂成两个子照射光束3、4。子照射光束3、4穿过一个使子照射光束3、4聚焦的透镜5和一个管透镜6，该管透镜使子照射光束3、4对准并且相对光轴沿相反方向倾斜地耦合到照射物镜7的入射光瞳中。
子照射光束3、4在穿过照射物镜7之后分别入射到一个转向机构的两个彼此相对地设置在一个检测物镜8上的转向镜9、10之一上，该转向机构使子照射光束3、4这样转向，使得子照射光束3、4在一个同时是检测物镜8的焦点平面的照射平面11中相互干涉，从而在照射平面11中产生照射图案。
图2示意性示出在构造成spim显微镜的按照本发明的设备中一个照射图案12在试样体积34中的产生。照射图案12在照射平面11中通过两个子照射光束的干涉产生，这两个子照射光束在穿过照射物镜7之后被彼此相对的转向元件、即转向镜9、10转向，使得它们在照射平面中以相反的传播方向传播。在转向镜之间的竖直线示例性地对于两个反向的具有平坦相位波前的光束示出形成为驻波的极大值/极小值的位置，如其对于在spim显微镜中常见的照射光(也称为光片)具有良好的近似那样。
图3示意性示出在构造成spim显微镜的按照本发明的设备中一个照射图案12和一个另外的照射图案13叠加的产生。照射图案12在照射平面11中通过两个子照射光束的干涉产生，这两个子照射光束在穿过照射物镜之后被彼此相对的转向元件、即转向镜9、10转向。所述一个另外的照射图案13在照射平面11中通过两个另外的子照射光束的干涉产生，这两个另外的子照射光束在穿过照射物镜之后被彼此相对的另外的转向元件、即另外的转向镜14、15转向。通过照射图案12与所述另外的照射图案13的叠加和干涉，在中心产生点格栅16。
图4示意性示出在构造成spim显微镜的按照本发明的设备中一个照射图案12和三个另外的照射图案13、17、18叠加的产生。在此处要强调的是，在图4中不是强制性涉及显示真实的转向机构，而是同样示出时间积分的可能性，该时间积分例如可通过使用可转动的转向机构实现：在图中示出的转向镜可以固定地安装，但它们不必都在构造中存在。尤其是也可以这样可转动地设有一对可动的转向镜9、10，使得这对转向镜能相继地处于转向镜9、10的位置、然后21、22的位置以及然后14、15的位置和然后19、20的位置，或者任意数量的任意其他位置。理想地，条形的照射图案12在此分别以60度的角度转动两次，以便实现在平面11中各向同性的分辨率提高。这在曝光照相机的唯一一张照片期间发生。
如果多个镜固定安装并且其格栅叠加，则这导致复杂的照射图案。这些照射图案便将会实现更高阶的结构化的照射。如果照射图案不是规则的正弦，则必须使格栅移动多于两次并且拍摄多于三张照片，但也获得了分辨率的进一步提高。
照射图案12在照射平面11中通过两个子照射光束的干涉产生，这两个子照射光束在穿过照射物镜之后被彼此相对的转向元件、即转向镜9、10转向。所述一个另外的照射图案13在照射平面11中通过两个另外的子照射光束的干涉产生，这两个另外的子照射光束在穿过照射物镜之后被彼此相对的(另外的)转向元件、即另外的转向镜14、15转向。
所述另外的照射图案17在照射平面11中通过两个子照射光束的干涉产生，这两个子照射光束在穿过照射物镜之后被彼此相对的转向元件、即转向镜19、20(或转动到19、20的位置处的转向镜9、10)转向。所述另外的照射图案18在照射平面11中通过两个另外的子照射光束的干涉产生，这两个另外的子照射光束在穿过照射物镜之后被彼此相对的另外的转向元件、即转向镜21、22转向。
通过照射图案12与另外的照射图案13、17、18叠加，在中心产生点格栅23。也可以使例如12和13的或17和18的子组用于叠加。
图5示出在构造成spim显微镜的按照本发明的设备中一个照射图案和一个另外的照射图案叠加时的光分布。
具体地，图5在上面一行中以三个不同视图示出在照射中产生的一个照射图案。在左侧的图示中可看到照射平面11的观察方向沿着检测物镜光轴(z方向)的视图。另两个图示示出观察方向沿着x方向(第一照射图案的光线的传播方向)的和观察方向沿着垂直于x和z延伸的y方向(第二照射图案的光线的传播方向)的照射图案。
图5在中间一行中以如在上面一行中那样的三个不同视图示出在照射中产生的一个另外的照射图案。在左侧的图中可看到观察方向沿着检测物镜光轴(z方向)的视图。另两个图示出观察方向沿着x方向的和观察方向沿着y方向的照射图案。所述一个另外的照射图案在照射中仅相对于在上面一行中示出的照射图案转动了90度。
图5在下面一行中以如在上面一行中那样的三个不同视图示出所述一个照射图案与所述一个另外的照射图案相干叠加的结果。在左侧的图中可看到观察方向沿着检测物镜光轴(z方向)的视图。另两个图示出观察方向沿着x方向的和观察方向沿着y方向的照射图案。
图6放大地示出在所述一个照射图案和所述一个另外的照射图案相干叠加时的光分布，如其已经在图5的下面一行中所示。
图7示出在所述一个照射图案和所述一个另外的照射图案非相干叠加时产生的光分布。
图8示出两个彼此相向的截面-贝塞尔光束的干涉图案。例如，通过改变彼此叠加的截面-贝塞尔光束的相位和侧向位置可以连续改变干涉图案，以便产生多个图像，结果从这些图像的图像数据能计算出具有更高对比度和更高分辨率的图像。
图9示意性示出在构造成tirf显微镜的按照本发明的设备中照射图案的产生。
所述设备具有一个照射物镜7和一个检测物镜8，在该照射物镜和检测物镜之间在检查位置中设置有一个要检查的试样24。试样24与光学透明的介质25接触，该介质具有比试样24更高的折射率。试样在此也可以在覆盖玻璃上准备，该覆盖玻璃与光学透明的介质25接触，其中，在中间空间中可以装入用于使折射率的跃变最小化的浸入介质。
两个子照射光束3、4经过在偏转角度方面可调的光线偏转装置26、扫描透镜27和管透镜28到达照射物镜7，穿过该照射透镜并且接着被一个具有两个转向元件30、31并且固定在检测物镜8上的转向机构29转向。
转向机构29具有第一转向元件30和第二转向元件31，其中，光学透明的介质25(除了其用于提供与试样24的平的界面的功能之外)也形成另一转向元件。转向元件30、31和光学透明的介质25的进入窗口使子照射光束3、4分别相继地以具有不同符号和不同数值的偏转角度转向。
在光学透明的介质25和试样24之间的界面32上，干涉的子照射光束3、4被全反射用于以渐逝波的方式照射试样24。渐逝波场33伸进试样24中并且在那里导致光学激励荧光染料。
从试样24出来的荧光穿过检测物镜8并且聚焦到(未示出的位置分辨的检测器的作用面上，该检测器例如构成为面检测器。
光线偏转装置26具有万向悬挂的镜子，该镜子能实现子照射光束3、4可以偏转到两个彼此垂直的具有相应任意偏转角度的平面中。按这种方式，从照射物镜7出来的子照射光束3、4的空间位置和传播方向可以基本上自由调节。按这种方式例如可以使子照射光束3、4转向到另一对转向机构上、而不是到转向元件30、31上，例如以便改变照射图案的定向。
代替万向悬挂的镜子26，光线偏转装置例如也可以具有至少两个在光学上串联的偏转元件、例如偏转镜，所述偏转元件可使子照射光束3、4偏转到彼此垂直的偏转平面中。
子照射光束3、4从一个照射光束2借助一个例如构成为格栅的分裂器件1产生。
替代地或附加地例如也可设想，分裂器件1围绕一根轴可转动地或万向地支承并且光线偏转装置26的可转动性必要时不限于仅仅一根轴，只要子照射光束的可自由定向性得到确保即可。
图10示出在图9中示出的设备的试样区域的细节图和尤其是干涉的子照射光束3、4在试样24区域内的光程。
最后要相当特别地指出，前文阐述的实施例仅用于描述要求保护的教导，但不将该教导限于实施例。尤其是，在本说明书中包含的所有特征和/或其功能、作用和特性可本身单独地和/或相互组合地看作是在这里公开的，本领域技术人员必要时在引入其专业知识的情况下会单独地或组合地设置它们用于解决本发明目的或与此相关的提出的问题。
附图标记列表
1分裂器件
2照射光束
3子照射光束
4子照射光束
5透镜
6管透镜
7照射物镜
8检测物镜
9转向镜
10转向镜
11照射平面
12照射图案
13另外的照射图案
14另外的转向镜
15另外的转向镜
16点格栅
17另外的照射图案
18另外的照射图案
19另外的转向镜
20另外的转向镜
21另外的转向镜
22另外的转向镜
23点格栅
24试样
25光学透明的介质
26光线偏转装置
27扫描透镜
28管透镜
29转向机构
30转向元件
31转向元件
32界面
33渐逝波场
34试样体积