一种单、双折射性植物组织共同显像的显微拍摄方法与流程

本发明涉及偏振光检测领域，尤其涉及到一种单、双折射性植物组织共同显像的显微拍摄方法。

背景技术：

目前在植物显微观察和成像特别是在生药(包括中药)鉴定领域的权威文献资料及显微鉴定质量标准对大多数生药(包括中药)均有较为详尽的显微特征文字描述，但与之配套的图鉴受相关设备和技术方法的限制，呈现形式均为单次拍摄的粉末特征图、常规显微镜正常光明场下拍摄植物切面不连续的局部特征拼接图或手绘墨线图，以及利用近些年来被广泛运用到中药显微鉴定中的偏振光显微镜在偏振光暗场下拍摄影像图。手绘墨线图虽能清楚地诠释完整的植物组织构造，但无法还原切面显微特征的原貌，缺乏全息彩色影像图的真实性和可信性；切面局部显微影像图仅能还原部分碎片化的显微特征，难以呈现完整的植物组织构造全貌，无法真实反应药材显微鉴定特征信息并对其长宽度等基本参数进行准确地测量分析；正常光明场下拍摄影像能真实还原植物组织构造，但无法准确定位显微特征标志物及其排列规律；偏振光暗场下拍摄影像能够直观清晰定位双折射性显微鉴别标志物，但导致部分无双折射性的组织特征及其细胞内含物信息缺失。此外，传统显微拍摄多为直接单次拍摄，对于显微组织切片不平及大型组织聚焦点不同等情况，无法很好地兼顾多个焦点，存在影像虚化、不清晰、不能聚焦平面的问题，导致不能良好的呈现最真实的状态，部分特征信息缺失。

针对相关技术中的问题，目前尚未提出有效的解决方案。因此，亟需构建能够同时观察到植物组织断面制片在正常光明场下的单折射性组织显微特征及正交偏振光下双折射性组织显微特征的观察方法以及兼顾影像清晰度、立体感、完整性的拍摄技术。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种单、双折射性植物组织共同显像的显微拍摄方法以解决现有技术的不足之处。

本发明为解决其技术问题所采用的技术方案是：

根据本发明实施例，一种单、双折射性植物组织共同显像的显微拍摄方法，包括如下步骤：

(1)取植物组织的观察部位，按照2020年版《中国药典》四部显微鉴别法(通则2001)项下显微制片方法分别制备植物组织制片；

(2)取步骤(1)中的制片置偏振光显微镜下，调节基础显像机构成为单、双折射性显微组织构造共同显像模式；所述调节包括基础显像机构本身结构位置的调整或者额外设置其他结构；

(3)采用数码成像系统的大图影像拼接技术和实时景深扩展成像技术对上述方法下的影像进行拍摄，获取正交偏振光干涉及非正交偏振光条件下单、双折射性组织构造全息高清影像图。

根据本发明实施例，所述步骤(2)中的单、双折射性组织显微构造共同显像模式为基础显像机构中起偏镜和检偏镜之间的夹角调节形成的机构。

进一步的，所述调节方式为从起偏镜和检偏镜为正交状态下向左或向右旋转0°～24°。

进一步，所述植物组织的观察部位选植物组织的横断面。

优选的，所述植物选自藤类植物。

具体步骤包括如下：将显微制片在偏振光显微镜下，以0.1°的幅度旋转检偏器，使起偏镜和检偏镜夹角从相互垂直的90°的正交检偏位达到0°的平行检偏位，起偏镜所形成的直线偏振光由正交垂直状态下完全不能通过变为可通过一部分，单折射性组织构造在视野中逐渐显现，双折射性组织构造随着背景照度变亮，与背景对比度降低，视觉辨别性下降。

观察不同检偏位下的在正常光明场下的单折射性组织显微特征及正交偏振光下双折射性组织显微特征。

根据本发明实施例，所述步骤(2)中单、双折射性组织构造共同显像机构为基础显像机构中起偏镜和检偏镜之间的45度位中间镜筒插槽内插入光程补偿器形成的机构。

进一步的，所述光程补偿器为λ板光程补偿器、1/4λ板光程补偿器、塞拿蒙补偿器或石英楔片补偿器。

优选的，45度位中间镜筒插槽内插入λ板光程补偿器。

本发明的优点在于：本发明通过偏振光显微技术与光程补偿器应用观察，并采用大图影像拼接技术和实时景深扩展成像技术拍摄，能够同时观察到植物组织断面制片在正常光明场下的单折射性组织显微特征及正交偏振光下双折射性组织显微特征，解决了传统偏振光显微影像部分单折射性组织构造特征信息缺失、正常光显微影像无法快速准确定位双折射性显微特征标志物以及显微拍摄成像难以同时兼顾影像的清晰度和完整性等弊端，人眼颜色及亮度视觉辨别能力强且观察舒适度高，兼顾双折射性和单折射性组织构造的观察全面性和对比度，能够准确定位双折射性显微鉴别标志物及其所在部位和分布规律，实现目标为双折射性显微鉴别标志物和单折射性组织构造的快速分辨，该方法检验快速、价格低廉，容易普及，提高了植物组织断面制片的显微鉴定的效率并降低了鉴定的难度。

偏振光显微技术与光程补偿器应用于植物组织断面制片观察，旨在建立能够同时观察到正常光明场下的单折射性组织显微特征及正交偏振光下双折射性组织显微特征的新方法以及兼顾影像清晰度、立体感、完整性的拍摄技术，该方法所获取的植物组织构造彩色影像。上述影像优选藤类、根和根茎类影像相关元素可用于建筑、建筑材料、纺织、服装、皮具及工艺品花纹等美学设计应用。

附图说明

图1是正常光明场下拍摄植物组织制片显微影像图。

图2是偏振光暗场视野下拍摄植物组织制片显微影像图。

图3是使起偏镜和检偏镜从正交状态下向左或向右旋转17°的非正交偏振光下拍摄植物组织制片显微影像图。

图4是在起偏器与检偏器之间45度位中间镜筒插槽内插入λ板光程补偿器拍摄植物组织制片显微影像图。

图5是在起偏镜和检偏镜之间的45度位中间镜筒插槽内插入光程补偿器的实验装置图。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合图示与具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1

(1)取白木通的藤茎，经软化处理后，用徒手、滑走切片法或永久石蜡包埋制片法，制成10～20μm的薄片。除永久石蜡切片直接观察外，其他切片选取平整的薄片置载玻片上，滴加水合氯醛试液1～2滴，在酒精灯上进行加热透化，再滴加稀甘油1～2滴，盖上盖玻片。

(2)将所述白木通的藤茎制片在偏振光显微镜下，将起偏镜和检偏镜从正交状态下向左或向右旋转17°进行观察，观察在正常光明场下的单折射性组织显微特征及正交偏振光下双折射性组织显微特征。

(3)采用数码成像系统的大图影像拼接技术和实时景深扩展成像技术对上述方法下的影像进行拍摄，获取非正交偏振光单、双折射性组织构造全息高清影像图。

具体结果如下：

在普通光源下，如图1所示，在正常光明场下拍摄影像能真实还原植物组织构造，但无法快速准确定位双折射性显微特征标志物；如图2所示，在偏振光暗场视野下拍摄影像能够直观清晰定位双折射性显微鉴别标志物，但导致部分单折射性的组织特征信息缺失。

如图3所示，将起偏镜和检偏镜从正交状态下向左或向右旋转17°的非正交偏振光下拍摄影像能够同时观察到正常光明场下的单折射性植物组织构造的显微特征及正交偏光下双折射性植物细胞壁及细胞内含物的显微特征，与图1、2相比，其兼顾了中药植物双折射性和单折射性组织构造的观察全面性和对比度，准确定位双折射性显微鉴别标志物及其所在部位和分布规律，并实现目标双折射性显微鉴别标志物和单折射性植物组织构造的快速分辨。

实施例2

(1)取白木通的藤茎，经软化处理后，用徒手、滑走切片法或永久石蜡包埋制片法，制成10～20μm的薄片。除永久石蜡切片直接观察外，其他切片选取平整的薄片置载玻片上，滴加水合氯醛试液1～2滴，在酒精灯上进行加热透化，再滴加稀甘油1～2滴，盖上盖玻片。

(2)如图5所示，将显微制片在偏振光显微镜下，在位于起偏器与检偏器之间45度位中间镜筒插槽内插入λ板光程补偿器，在起偏器与检偏器为90°正交的条件下观察在正常光明场下的单折射性组织显微特征及正交偏振光下双折射性组织显微特征；

(3)采用数码成像系统的大图影像拼接技术和实时景深扩展成像技术对上述方法下的影像进行拍摄，获取正交干涉偏振光单、双折射性组织构造全息高清影像图。

具体结果如下：

如图5所示，将显微制片在偏振光显微镜下，在位于起偏器与检偏器之间中间镜筒中的插槽中45度位插入光程补偿器，观察植物横切面整体组织构造及双折射性细胞壁及细胞内含物的偏光干涉显微特征；

正交偏光下背景转为一级紫红干涉色，无偏光现象的单折射性细胞壁及细胞内含物轮廓均清晰可见，寻常光(o光)和非常光(e光)以不同的速度通具有偏光特性的双折射性细胞壁及细胞内含物，依据其厚度和切面方位中的双折射率的不同出现白光干涉现象，把原先仅以不同灰度显示出来的层次转为色彩鲜艳且富有立体感的彩色，由灰度阶转变表现为一级黄、一级橙红、一级紫红、二级蓝、二级蓝绿、二级绿等颜色。

如图4所示，在位于起偏器与检偏器之间中间镜筒中的插槽中45度位插入光程补偿器能够同时观察到正常光明场下的单折射性植物组织构造的显微特征及正交偏光下双折射性植物细胞壁及细胞内含物的显微特征，与图1、2相比，兼顾了中药植物双折射性和单折射性组织构造的观察全面性和对比度，准确定位双折射性显微鉴别标志物及其所在部位和分布规律，实现目标双折射性显微鉴别标志物和单折射性植物组织构造的快速分辨。与图3相比，其使色彩单一的双折射中药植物组织细节产生明显而又丰富的颜色变化，把原先仅以不同灰度显示出来的层次转为色彩鲜艳且富有立体感的彩色，人眼颜色及亮度视觉辨别能力强且观察舒适度高。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。