基于偏心光束法的自动对焦显微镜及其对焦方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及显微镜对焦技术领域，具体是一种采用偏心光束法作为离焦量检测光 路、配合光斑图像处理算法计算样本离焦量的自动对焦装置及方法。
【背景技术】
[0002] 偏心光束法是一种典型的显微镜主动对焦方法，通常结合灰度重心法处理激光光 斑图像以计算样本离焦量。但是灰度重心法要求光斑有良好的对称性且光强分布均匀，而 样本表面的凹凸情况非常复杂，并且受光源光强分布不均勾、第二和第三分光棱镜分光效 果不理想、刀口处的衍射、样本不同细胞组织间反射率的差异等原因，对焦相机获取的光斑 图像中残留大量的噪声及畸变，光斑的光强分布也严重背离高斯分布，以上原因导致使用 线性模型拟合灰度重心的坐标偏移量与离焦量的数据，在实际应用中会带来超出了显微镜 物镜景深的误差，导致自动对焦效果很差，获取的样本显微成像质量不能满足应用需求。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于针对现有技术中存在的上述不足，提供一种对焦速度快、对焦 精度高、线性范围大的基于偏心光束法的自动对焦显微镜及其对焦方法，可满足显微镜在 高倍物镜下快速、精确对焦的要求。
[0004] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0005] 根据本发明的一个方面，提供了一种基于偏心光束法的自动对焦显微镜，包括自 动对焦装置和XY载物台，所述自动对焦装置包括偏心光束离焦量探测模块、显微成像模块 和压电物镜驱动器；其中：
[0006] 所述偏心光束离焦量探测模块用于发射偏心激光束照射样本表面，并获取反射回 的半圆形光斑图像，所述半圆形光斑图像的半径与样本离焦量在一定范围内成线性关系；
[0007] 所述XY载物台用于移动样本，实现样本的扫描运动；
[0008] 所述显微成像模块，用于获取对焦完成后清晰的样本图像；
[0009] 所述压电物镜驱动器用于补偿当前视场的离焦量，完成对焦。
[0010] 优选地，所述显微成像模块包括成像相机、第二聚焦透镜组、第三分光棱镜、物镜； 其中：样本的照明光线依次经物镜、第三分光棱镜、第二聚焦透镜组，最后在成像相机上获 取样本的显微图像。
[0011] 进一步地，所述的压电物镜驱动器，与物镜通过螺纹套筒刚性连接，且压电物镜驱 动器的最大负载（额定负载）不小于物镜和螺纹套筒的总重量。
[0012] 优选地，所述偏心光束离焦量探测模块内部包括集成的近红外激光器、激光扩束 器、刀口、第一分光棱镜、第二分光棱镜、第一聚焦透镜组以及对焦相机；其中：
[0013] 所述近红外激光器、激光扩束器、刀口、第一分光棱镜、第三分光棱镜以及物镜形 成偏心光束法的激光发射光路；
[0014] 所述物镜、第三分光棱镜、第二分光棱镜、第一聚焦透镜组、对焦相机形成偏心光 束法的光斑反射光路；
[0015] 所述激光发射光路与光斑反射光路光轴重合，对焦相机与成像相机视场一致。
[0016] 优选地，所述偏心光束离焦量探测模块的近红外激光器嵌入圆柱凸轮结构的激光 器衬套中，通过拨动与激光器衬套连接的拨杆可改变近红外激光器调整沿光轴方向的位 置，进而调整控制对焦相机获取的光斑图像的大小；
[0017] 优选地，所述偏心光束离焦量探测模块的反射成像光路中第二分光棱镜固定于蜗 轮蜗杆旋转安装座上，通过蜗轮蜗杆旋转安装座可改变第二分光棱镜与光轴之间的夹角， 进而调整光斑图像在对焦相机上的成像位置。
[0018] 优选地，所述自动对焦装置还包括计算机处理系统，所述偏心光束离焦量探测模 块、显微成像模块、压电物镜驱动器以及XY载物台分别与计算机处理系统连接，用于：
[0019] 控制XY载物台运动；
[0020] 调整对焦相机和成像相机；
[0021] 运行图像处理算法；
[0022] 计算样本离焦量；
[0023] 控制压电物镜驱动器完成对焦。
[0024] 根据本发明的另一个方面，提供了一种上述基于偏心光束法的自动对焦显微镜的 自动对焦方法，包括如下步骤：
[0025] a、偏心光束离焦量探测模块发射半圆形偏心激光束照射样本表面，并获取样本反 射形成的半圆形光斑图像；
[0026] b、计算机处理系统对半圆形光斑图像运行图像处理算法，计算当前视场下样本离 隹量.
[0027] c、压电物镜驱动器5补偿离焦量，完成对焦；
[0028] d、显微成像模块获取清晰的样本图像；
[0029] e、XY载物台移动样本至下一视场。
[0030] 优选地，所述图像处理算法包括如下步骤：
[0031] (1)将成像相机获取的半圆形光斑图像image (x，y)MXN转化为二维灰度图gray (X， y)MXN，（x，y)表示图像像素坐标，MXN表示图像分辨率；
[0032] (2)使用自适应窗口中值滤波算法平滑二维灰度图gray(x，y)MXN，输出图像 f mxn>
[0033] (3)使用基于OSTU的Canny边缘检测算法：该算法首先使用OSTU算法计算图像 /〇,y)Mxiv的二值化阈值T，并以此阈值T对图像/(x,y) Mxw进行二值化，可输出光斑二值 化图像binary (x，y)MXN，然后使用Canny边缘检测处理得到的光斑二值化图像binary (X， y)MXN的完整边缘轮廓edge(x，y) MXN;
[0034] (4)将获取的完整边缘轮廓edge (x，y) MXN作为掩膜处理光斑二值化图像 binary (x，y) MXN，可得边缘轮廓AedgeA (x，y) MXN;使用完整边缘轮廓edge (x，y) MXN减去边缘 轮廓 AedgeA(x，y)MXN可得边缘轮廓 BedgeB(x，y) MXN;
[0035] (5)使用最小二乘法分别拟合边缘轮廓A edgeA(x，y)MXN、边缘轮廓BedgeB(x，y) MXN，得到对应的边缘轮廓A的拟合圆半径r A、边缘轮廓B的rB;
[0036] (6)比较拟合圆半径rA与拟合圆半径r B的大小，其中较大者对应的边缘轮廓部分 为非半圆轮廓，较小者对应的边缘轮廓部分为半圆轮廓；
[0037] (7)分别计算边缘轮廓AedgeA(x，y)MXN、边缘轮廓BedgeB(x，y) MXN的灰度重心点 pointA(xA，yA)及pointB(x B，yB)，（xA，yA)表示边缘轮廓A的灰度重心点的像素坐标，（x B， yB)表示表示边缘轮廓B的灰度重心点的像素坐标；
[0038] (8)比较14与x B的大小，其中较大者对应的边缘轮廓部分在图像上位于较小者对 应的边缘轮廓部分的右侧；据此得到非半圆轮廓与半圆轮廓的相对位置，相对位置只有两 种情况：非半圆轮廓位于半圆轮廓的左侧或右侧，与样本的两种离焦状态--正离焦和负 离焦一一相对应，该对应关系可事先进行实验确定；正离焦是指样本超出物镜焦距的离焦 情况，负离焦是指样本在物镜焦距内的离焦情况；
[0039] (9)样本判定为正离焦状态时，将rA、rB中的较小者直接代入光斑半径-离焦量线 性关系模型；样本判定为负离焦状态时，将r A、^中的较小者乘以-1代入光斑半径-离焦 量关系模型；计算当前样本离焦量；
[0040] 所述光斑半径-离焦量关系模型具体为：
[0041] 光斑半径绝对值超出数值rmax时，光斑半径-离焦量之间为非线性关系；光斑半径 绝对值小于数值1~_时，样本处于准焦状态下，，r _表示线性关系区间内的光斑半径最大 值，rmin表示线性关系区间内的光斑半径最小值；样本处于正离焦状态或负离焦状态时，根 据S = k?r+b计算离焦量，S表示离焦量，k表示线性模型的斜率，:r表示当前光斑半径，b 表示样本在物镜景深范围内时上述图像处理算法计算所得的光斑半径；其中正离焦时k > 〇,负离焦时k < 0, r = min{rA，rB}，k、b的具体数值由实验数据进行线性回归分析得到。
[0042] 优选地，在对基于偏心光束法的自动对焦显微镜自动对焦前，还需要对自动对焦 装置进行检查和调试，包括如下步骤：
[0043] 首先，调整激光发射光路、光斑反射光路、显微成像光路，使三者光轴重合，保证对 焦相机和成像相机的视场一致；对焦相机能够获取激光光斑图像，成像相机能够获取激光 聚焦点处的样本图像；
[0044] 其次，观察对焦相机上的激光光斑，调整偏心光束离焦量探测模块中的刀口韧边 恰好经过光斑圆心点，遮挡住激光束的一半，形成半圆形光斑图像。
[0045] 本发明提供的基于偏心光束法的自动对焦显微镜及其对焦方法，偏心光束离焦量 探测模块发射半圆形激光束照射样本表面，并获取样本反射形成的半圆形光斑图像；计算 机处理系统经过自适应中值滤波、基于OSTU的Canny边缘检测、最小二乘法拟合等算法处 理灰度化的光斑图像可得到光斑半径，根据半径-离焦量的线性关系模型，可计算该视场 下样本离焦量；压电物镜驱动器带动物镜补偿离焦量；对焦完成后，显微成像模块获取清 晰的样本图像。
[0046] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0047