专利名称：一种基于pcr的dna标签文库构建方法
技术领域：
本发明涉及DNA文库构建技术领域，特别是DNA标签文库构建技术领域，特别是基于PCR的DNA标签文库构建方法。另外，本发明还涉及标签技术，以及实现多个样品在同一反应体系中进行文库构建的方法。本发明的方法特别适用于第二代测序技术，尤其是 solexa测序技术。
背景技术：
Illumina公司提供的Solexa DNA测序平台，可在一个反应中同时加入四种带荧光标记的核苷酸，采用边合成边测序Gequencing BySynthesis，SBS)，具有所需样品量少， 高通量，高精确性，拥有简单易操作的自动化平台和功能强大等特点[1-4]。文库构建首先需要将目的片段进行末端修复，在目的片段的3’末端连接“A”碱基，将3’末端带有“A”碱基的目的片段与DNA接头(也称为adapter)连接，通过PCR反应将目的片段进行扩增，最后回收含有DNA接头的目的片段文库，见
图1。目的片段文库与测序芯片上面的DNA接头进行杂交，通过桥式PCR进行扩增后，最后边合成边测序。在每个循环过程里，荧光标记的核苷和聚合酶被加入到单分子阵列中。互补的核苷和核苷酸片断的第一个碱基配对，通过酶加入到引物上。多余的核苷被移走。这样每个单链DNA分子通过互补碱基的配对被延伸， 针对每种碱基的特定波长的激光激发结合上的核苷的标记，这个标记会释放出荧光，最后收集到的荧光信号来翻译成碱基序列。目前这种DNA建库方法可以根据需求运用于各种研究领域，如基因组的De Novo测序，基因组重测序、转录组测序和表观基因组测序等。基于上述建库方法illumina公司也推出了 DNA标签(也称为index)建库方法， 如图2所示。在DNA标签建库流程中，PCR过程使用了 3条PCR标签引物，通过PCR导入标签来构建DNA标签文库[5]。专利申请W02005068656A1和W02008093098A2中公开了一种使用标签序列标记核酸样品的来源从而可以将样品进行混合测序的方法，可以通过PCR的过程将特定的核苷酸序列(即标签序列)通过PCR导入到文库中，PCR标签引物序列见表 1。这些带有标签的文库可以根据需求进行任意混合，然后通过solexa测序仪器进行测序， 最后将数据按标签标签序列进行分类。但是illumina公司提供的标签文库制备的方法存在着一些缺陷第一、目前 illumina公司只提供12个长度为6bp的标签序列，标签的数量较少，随着solexa测序通量的增加，不能对大量样本进行混合测序将是一个巨大的缺陷；第二、目前illumina公司提供的标签建库方法是通过PCR反应将标签序列导入到目的片段文库中，需要3条PCR引物对目的片段进行扩增(两条公用引物和一条PCR标签引物，如表1)，而且PCR扩增效率不尚ο第三、illumina公司提供的标签建库方法中接头不包含标签序列，每一个标签文库需要通过一个PCR反应来导入标签序列，然后针对每一个标签文库都需要切胶回收，然后将切胶回收后的标签目的片段文库进行混合，这样不仅费时费力，而且费用也较高。因此，对标签的序列及标签引入方法进行优化和改进，使标签引入的效率提高，扩大标签序列的数量，才能满足高通量的建库的要求，以适应测序通量不断提高的现状，使测序仪器的产能充分利用，降低测序的成本。表lillumina公司提供的标签序列及相对应的PCR标签引物序列
权利要求
1.一组DNA标签，所述DNA标签包括如下或由如下组成表2所示的161个DNA标签或与之相差1个碱基的DNA标签中的至少10个，或至少20个，或至少30个，或至少40个，至少50个，或至少60个，或至少70个，或至少80个，或90个，或至少100个，或至少110个， 或至少120个，或至少130个，或至少140个，或至少150个，或全部161个，所述DNA标签优选地至少包括表2所示的161个DNA标签的DNAhdexl DNA IndexlO,或 DNA Indexll DNA Index20,或 DNAhdex21 DNA Index30,或 DNA hdex31 DNA Index40，或 DNAhdex41 DNA Index50，或 DNA Index51 DNA Index60, 或 DNAhdex61 DNA Index70,或 DNA Index71 DNA Index80,或 DNAhdex81 DNA Index90,或 DNA hdex91 DNA IndexlOO,或 DNAhdexlOl DNA IndexllO,或 DNA Indexlll DNA Indexl20,或 DNAhdexl21 DNA Indexl30,或 DNA Indexl31 DNA hdexl40，或 DNAIndexHl DNA hdexl50，或 DNA hdexl51 DNA hdexl61，或者他们任何两个或多个的组合。
2.权利要求1所述的DNA标签，其中所述的相差1个碱基包括标签中1个碱基的取代、 添加或删除。
3.权利要求1或2所述的DNA标签用于构建DNA标签文库的用途，其中DNA标签文库的DNA标签接头在3，末端包含所述DNA标签，从而构成各自相对应的DNA标签接头，所述 DNA标签接头优选地用作DNA标签文库的3，接头。
4.权利要求3所述的用途，其中所述DNA标签插入DNA标签接头中的3’末端中，或通过或不通过连接子连接在DNA接头的3’末端，优选地插入DNA标签接头中的3’末端中；更优选地距离DNA标签接头中的3，末端1个碱基插入DNA标签接头中。
5.使用权利要求1或2的DNA标签构建的DNA标签文库。
6.含有权利要求1或2所述的DNA标签的一组DNAPCR标签引物，其中DNA PCR标签引物在3’末端包含权利要求1所述的标签，所述一组所述DNA PCR标签引物包括如下或由如下组成表4所示161个DNAPCR标签引物或与其所包含的DNA标签序列相差1个碱基的 DNAPCR标签引物中的至少10个，或至少20个，或至少30个，或至少40个，至少50个，或至少60个，或至少70个，或至少80个，或90个，或至少100个，或至少110个，或至少120 个，或至少130个，或至少140个，或至少150个，或全部161个，所述DNA PCR标签引物优选地至少包括表4所示的161个DNAPCR标签引物中的 DNA PCR indexl primer ~ DNA PCR indexlOprimer, DNA PCR indexll primer ~ DNA PCR index20 primer, DNA PCR index21 primer ~ DNA PCR index30 primer, DNA PCRindex31 primer ~ DNA PCR index40 primer, DNA PCR index41primer ~ DNA PCR index50 primer,或 DNA PCR index51 primer DNA PCR index60 primer,或 DNA PCR index61 primer DNA PCRindex70 primer, DNA PCR index71 primer DNA PCR index80primer, DNA PCR index81 primer DNA PCR index90 primer, DNA PCR index91 primer ~ DNA PCR indexlOO primer, DNA PCRindexlOl primer ~ DNA PCR indexl 10 primer,或 DNA PCR indexl llprimer DNA PCR indexl20 primer,或 DNA PCR indexl21 primer DNA PCR indexl30 primer，或 DNA PCR indexl31 primer DNAPCR indexl40 primer，或 DNA PCR indexl41 primer DNA PCRindexl50 primer，或 DNA PCR indexl51 primer DNA PCR indexl61primer，或者他们任何两个或多个的组合。
7.权利要求6所述的DNAPCR标签引物，其中所述的相差1个碱基包括标签中1个碱基的取代、添加或删除。
8.权利要求6或7所述的DNAPCR标签引物用于构建DNA标签文库的用途，优选地所述DNA PCR标签引物用作DNA标签文库的下游引物。
9.通过权利要求6或7所述的DNAPCR标签引物构建的DNA标签文库。
10.一种标签文库的构建方法，所述方法的特征在于使用包含标签的DNA PCR标签引物来构建标签文库。
11.权利要求10所述的方法，其包括1)提供η个DNA样品，η为整数且1彡η彡161的整数，优选地η为整数且2彡η彡161， 所述DNA样品来自所有真核和原核DNA样品，包括但不限于人DNA样品；2)将基因组DNA打断，其中打断方法包括但不限于超声波打断方法，优选地使打断后的DNA条带集中在200bp左右；3)末端修复；4)DNA片段3’末端加“A”碱基；5)连接DNA接头；6)将步骤幻得到的连接产物进行凝胶回收纯化，优选地通过2%的琼脂糖胶进行电泳并回收，并将各个DNA样品的回收产物混合在一起；7)PCR反应，使用步骤6)的回收产物的混合物作为模板，在适于扩增目的核酸的条件下进行PCR扩增，将PCR产物进行胶回收纯化，优选地回收280 300bp的目的片段。
12.权利要求10或11所述的方法，其中步骤7)PCR反应中使用的引物如下上游引物是 PE PCR Primers 1.0:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT ；下游引物是包括如下或由如下组成的DNA PCR标签引物表4所示161个DNA PCR标签引物或与其所包含的DNA标签序列相差1个碱基的DNA PCR标签引物中的至少10个，或至少20个，或至少30个，或至少40个，至少50个，或至少60个，或至少70个，或至少80 个，或90个，或至少100个，或至少110个，或至少120个，或至少130个，或至少140个，或至少150个，或全部161个，所述DNA PCR标签引物优选地至少包括表4所示的161个DNAPCR标签引物中的 DNA PCR indexl primer DNA PCR indexlOprimer，或 DNA PCR indexll primer DNA PCR index20 primer, DNA PCR index21 primer ~ DNA PCR index30 primer, DNA PCRindex31 primer ~ DNA PCR index40 primer, DNA PCR index41primer ~ DNA PCR index50 primer,或 DNA PCR index51 primer DNA PCR index60 primer,或 DNA PCR index61 primer DNA PCRindex70 primer, DNA PCR index71 primer DNA PCR index80primer,或 DNA PCR index81 primer DNA PCR index90 primer,或 DNA PCR index91 primer ~ DNA PCR indexlOO primer, DNA PCRindexlOl primer ~ DNA PCR indexllO primer,或 DNA PCR index 11 lprimer DNA PCR indexl20 primer,或 DNA PCR indexl21 primer DNA PCR indexl30 primer，或 DNA PCR indexl31 primer DNAPCR indexl40 primer，或 DNA PCR indexl41 primer DNA PCRindexl50 primer，或 DNA PCR indexl51 primer DNA PCR indexl61primer，或者他们任何两个或多个的组合。
13.权利要求12所述的方法，其中所述的相差1个碱基包括标签中1个碱基的取代、添加或删除。
14.权利要求11所述的方法，其中步骤5)中使用的DNA接头是PEindex Adapters 5’ Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC5 ’ TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT。
15.通过权利要求10或11所述的方法构建的标签文库。
全文摘要
本发明设计了长度为8bp独特的161个标签序列，并将标签嵌入DNA PCR引物中从而形成DNA PCR标签引物，从而可以通过PCR反应导入标签序列。本发明成功地建立了DNA标签文库的建库方法，并应用于solexa DNA测序。
文档编号C40B50/06GK102409049SQ20101029930
公开日2012年4月11日 申请日期2010年9月21日 优先权日2010年9月21日
发明者于竞, 刘涛, 周妍, 张艳艳, 田方, 章文蔚, 陈海燕, 龚梅花 申请人:深圳华大基因研究院, 深圳华大基因科技有限公司