专利名称：一种利用微量基因组dna进行全基因组甲基化位点精确检测的方法
技术领域：
本发明涉及甲基化高通量测序技术领域，特别是微量DNA全基因组甲基化高通量测序技术领域。另外，本发明还涉及标签测序技术以及实现多个样品在同一反应体系中进行构建标签文库的方法。本发明的方法特别适用于第二代测序技术，尤其是solexa测序技术。
背景技术：
DNA甲基化是研究最为深入的表观遗传学机制，DNA甲基化在维持正常细胞功能、 抑制寄生DNA成分对基因组完整性的损害、染色质结构修饰、X染色体失活、基因组印迹、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一 [1]。当今DNA甲基化研究主要方法有全基因组芯片杂交、全基因组甲基化敏感(非敏感)类限制性内切酶酶切等，特异位点或部分范围基因采用重亚硫酸处理结合甲基化特异 PCR等[2]。重亚硫酸盐处理(Bisulfite)结合测序是研究甲基化最常用也是最准确的方法。 Illumina GA是当今应用最为普遍的新一代高通量测序仪器，现已经成功应用于全基因组甲基化测序研究，主要流程是文库构建首先需要将基因组DNA随机打断，然后对目的片段进行末端修复，在目的片段的3’末端连接“Α”碱基，将3’末端带有“Α”碱基的目的片段与DNA接头(也称为adapter)连接(C位点甲基化修饰)，然后进行重亚硫酸盐处理，之后进行片段选择，最后通过PCR反应将目的片段进行扩增，最后回收含有DNA接头的目的片段文库[2]，见
图1。该方法的主要主要缺陷或问题是1、不能混合多个样品进行甲基化文库构建；2、PCR扩增效率不高，需要多个循环(16个循环以上)扩增后方可得到足够量的文库进行高通量测序；3、文库构建起始需要基因组DNA 5-10 μ g以上，不适宜微量DNA样品建库。
发明内容
本发明在Illumina常规标签(也称为index)文库测序[3](图2)及甲基化常规测序[2](图1)基础上进行了三点创新的改变1、将常规文库标签测序方法引入到甲基化测序研究中，并且修改了 Illumina公司提供的常规文库标签测序接头序列(表1)，增加了 6bp的碱基序列(可作为标签序列)，合成时采用甲基化修饰，增加后续PCR引物长度， 对于重亚硫酸盐处理完的DNA这样有效增加了后续PCR扩增效率；2、在使用微量基因组 DNA进行甲基化文库构建时创新性的通过添加外源DNA进行重亚硫酸盐高效共处理，对微量的DNA片段起到保护作用，最大限度的降低重亚硫酸盐对微量DNA的破坏，使得纳克级别 (30-100ng)基因组整体水平高精度的甲基化检测成为现实；3、改变Illumina甲基化常规测序在重亚硫酸盐处理之前要经过片段大小选择，然后再进行PCR扩增的流程，摸索出了一个不需要进行片段大小选择，在重亚硫酸盐处理后直接进行PCR扩增的条件。克服了常规甲基化测序中不能混合样品，PCR扩增效率低及不能对微量DNA样品进行研究的缺点。本发明的微量DNA全基因组甲基化高通量测序文库构建流程图参见图3。
表1基于Illumina GA的微量DNA全基因组甲基化高通量测序相关序列(5，- > 3，)
权利要求
1.构建全基因组甲基化高通量测序文库的方法，所述方法用于微量基因组DNA，优选的是纳克级别的基因组，更优选的是30-100ng的基因组，所述方法包括如下步骤步骤A目的基因组DNA及外源基因组DNA的片段化目的基因组DNA和作为外源基因组DNA的材料可以为任意物种，其中包括各种植物、动物、微生物，例如人，植物特别是拟南芥，昆虫，特别是哺乳动物包括人、小鼠的基因组DNA ； 进行片段化的方法包括雾化、超声片段化、HydroShear或酶切处理，从而将基因组DNA打断为大小优选地为100-200bp的片段；片段化方法中优选地采用超声片段化法，外源基因组 DNA优选地选择拟南芥基因组DNA ；步骤B基因组DNA的末端修饰对于经片段化的DNA，首先利用聚合酶包括但不限于Klenow、T4聚合酶和T4多聚核苷酸激酶以及dNTP补平末端，以产生平端化的DNA;然后优选地利用Klenow Frgment (3‘ -5，exo-)聚合酶及dATP在补平的序列的3，末端加上“A”碱基；步骤C微量津库接头连接及重亚硫酸盐处理将步骤B所得到的3’末端加上“A”碱基的DNA序列在连接酶包括但不限于T4连接酶的作用下与经甲基化修饰，优选地C位点甲基化修饰的微量建库接头进行连接，优选地在序列两端都连接上微量建库接头；然后在两端加了接头的片段中加入100-500ng,优诜的200ng步骤A中片段化了的拟南芥基因组DNA, 然后一起用重亚硫酸盐处理，优选地处理2小时，从而使非甲基化胞嘧啶转换为尿嘧啶；步骤D PCR扩增及文库切胶纯化以步骤C所得到的重亚硫酸盐转换后的DNA为模板，加入针对微量建库接头序列的PCR 引物序列，进行PCR扩增；PCR扩增优选地使用热启动taq酶，所述热启动taq酶包括但不限于常规的r-taq或其它聚合酶，扩增产物使用优选地2 %的琼脂糖进行电泳并将目的条带切下纯化后，即为待测序的文库。
2.权利要求1所沭的方法,其中步骤C中使用的微量建库接头是表1中所示的Minim_ adapter 1 禾口 Minim—adapter 2。
3.权利要求1所述的方法，其中步骡D中使用的PCR引物是表1中所示的Minim—PCR primer 1.1 禾口 Minim—PCR primer 2. 1。
4.通过权利要求1-3中任一项所述的方法构建的测序文库，优选地是微量DNA全基因组甲基化高通量测序文库。
5.通过权利要求1-3中任一项所述的方法构建的测序文库，优选地是微量DNA全基因组甲基化高通量测序文库用于进行测序的用途，其中所述测序可通过第二代测序平台进行。
6.用于微量测序文库，特别是微量DNA全基因组甲基化高通量测序文库的接头，其是表 1 中所示的 Minim_adapter 1 禾口 Minim_adapter2。
7.权利要求6所述的接头用于构建微量测序文库，特别是微量DNA全基因组甲基化高通量测序文库的用途。
8.使用权利要求6所述的接头构建的微量测序文库，特别是微量DNA全基因组甲基化高通量测序文库。
9.用于微量测序文库，特别是微量DNA全基因组甲基化高通量测序文库的PCR引物，其是表 1 中所示的 Minim_PCR primer 1. 1 和 Minim_PCR primer 2. 1。
10.权利要求9所述的PCR引物用于构建微量测序文库，特别是微量DNA全基因组甲基化高通量测序文库的用途。
11.使用权利要求9所述的PCR引物构建的微量测序文库，特别是微量DNA全基因组甲基化高通量测序文库。
全文摘要
本发明在Illumina常规标签文库测序及甲基化常规测序基础上，结合常规文库标签测序方法，建立了新的利用微量基因组DNA进行全基因组甲基化位点精确检测的方法。而且本发明在使用微量基因组DNA进行甲基化文库构建时创新性的通过添加外源NA进行重亚硫酸盐高效共处理；同时不需要进行片段大小选择，在重亚硫酸盐处理后直接进行PCR扩增。本发明的方法克服了常规甲基化测序中不能混合样品，PCR扩增效率低及不能对微量DNA样品进行研究的缺点。
文档编号C40B50/06GK102409408SQ20101029931
公开日2012年4月11日 申请日期2010年9月21日 优先权日2010年9月21日
发明者孙继华, 王君文, 罗慧娟, 闫淑静 申请人:深圳华大基因研究院, 深圳华大基因科技有限公司