一种利用端粒文库获得玉米染色体端粒的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用端粒文库获得玉米染色体端粒的方法。该端粒文库利用单引物PCR扩增端粒序列，包含不同大小的染色体端粒片段的核苷酸序列。本发明提供了使用本文所公开的一种利用端粒文库获得玉米染色体端粒的方法在构建植物人工染色体中获得天然端粒方面有着广泛的应用前景。
【专利说明】一种利用端粒文库获得玉米染色体端粒的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物生物工程和植物改良基因工程【技术领域】，具体涉及一种利用玉米根尖细胞同步化及染色体的分选技术分离构建人工染色体载体的端粒技术。
【背景技术】
[0002]染色体是细胞中遗传物质，呈线状或棒状，由DNA、蛋白质和少量RNA组成。每条染色体具有3种必需元件或结构:着丝粒、端粒和自主复制序列。染色体具备自主完整复制和将遗传物质平均分配到子细胞的能力，在细胞传代中稳定存在。着丝粒是真核生物染色体的标志性结构，在有丝分裂和减数分裂中，着丝粒和特异性的蛋白结合在微管的牵引下染色单体向两极运动。端粒位于真核生物染色体的末端，保证染色体的精确复制，维持染色体长度及稳定性。自主复制序列(ARS)是能够和特定起始蛋白结合开始DNA复制的序列，真核生物基因组很大，通常具有多个复制起点。 [0003]人工染色体通常指人工构建的含有天然染色体基本功能单位的载体系统，包括酵母人工染色体、细菌人工染色体、植物人工染色体等。植物人工染色体的研究仅在玉米、水稻和拟南芥中有相关的报道。Preuss等以拟南芥着丝粒DNA为基础，构建各种组合的微小染色体来确定具有着丝粒功能的最小区域。日本研究人员采用包含着丝粒区域的YAC克隆与含有端粒序列和ARS的YAC克隆进行同源重组，从而筛选有功能的水稻人工染色体。美国的密苏里大学Birchler实验室通过端粒截短法成功获得了 PAC，具体构建利用一个带有6个拷贝(约2.5kb)拟南芥端粒序列的载体通过农杆菌介导和基因枪转化玉米幼胚然后利用除草剂筛选阳性转基因植株。由于玉米具有一个额外的B染色体，几个或少数B染色体的存在并不影响玉米植株的表型，这为玉米人工染色体的构建提供非常好的材料。在有丝分裂过程中截短的微小A染色体不会和其原始染色体进行配对，截短的B染色体能够忠实地随着细胞分裂传递，同时还可以在有正常B染色体存在的情况下发生剂量变化。这些独立于正常染色体传递的现象暗示截短染色体可以作为非常好的转基因载体，克服目前转基因研究中所遇到的随机插入和位置效应。
【发明内容】
[0004]本
【发明内容】
给出了本发明的一些实施方式，以及在多种情况中给出了这些实施方式的变动和变更。本
【发明内容】
只是很多的和不同的实施方式的示例。所提及的给定实施方式示例也是一个或多个代表性的特点。这样一个实施方式通常可以具有或不具有所提及的特点；同样，这些特点也可以被施用于本发明的其他实施方式中。为了避免过多的重复，本
【发明内容】
没有罗列或提及这些特点的所有可能的组合。
[0005]本发明提供了一种能在植物中获得构建人工染色体的端粒的技术方法。本发明还提供了用于在植物中运用端粒构建人工染色体的技术。在一些实施方式中，方法包括(a)将得到的端粒与要表达的基因表达盒或DNA片段结合，以组合到人工染色体中；和6)生成包括此端粒的转基因植物，由此在植物中，更具体地说，是在植物中利用人工染色体稳定表达所述核苷酸。在一些实施方式中，所述“生成”包括用包含此端粒的人工染色体转化植物细胞并从所转化的植物细胞中再生出植物。
[0006]本发明所提供的植物端粒获取方法，可以获得所有植物端粒用于构建人工染色体的稳定表达。
[0007]实施方案中的端粒核苷酸序列可用于从其它生物中分离相应序列，如其它植物(单子叶或双子叶植物等)。根据这些相应序列与本文所列序列间的序列同源性，使用如PCR、杂交等技术来鉴别分离这些相应序列。因此，根据它们与本文所列的完整端粒序列(或其片段)间的序列相似性而分离的相应片段，也包括在实施方案中。实施方案的端粒区域可从任何植物中分离，包括(但不限于)玉米、水稻、芸苔属、小麦、高粱、两节荠属、白芥、蓖麻子、芝麻、棉籽、亚麻子、大豆、拟南芥属、菜豆属、花生等。
[0008]本文中“端粒”一词指位于真核生物染色体的末端，保证染色体的精确复制，维持染色体长度及稳定性。应认识到当鉴别了本文所公开的端粒获取方法后，分离并鉴定位于本文所鉴别的特定端粒就属于现有技术范围了。高等植物中端粒重复序列是高度保守的，大多数植物的端粒中都含有的端粒序列5’ -TTTAGGG-3’。
[0009]本文中的“端粒获取技术路线”是指包括引物设计合成、DNA制备、PCR扩增、端粒文库建立、端粒筛选、功能鉴定、人工染色体构建、植物转化的一系列过程。技术路线见附图1o
[0010]通常人工染色体端粒是利用人工合成的方法合成6个重复序列用于人工染色体的构建。本发明利用PCR-文库筛选技术获取了植物天然的端粒序列，更加接近于植物天然染色体性质，有利于人工染色体的稳定遗传。该发明结合了端粒随机扩增和文库筛选技术，技术简便易行，效率较高，效果比人工合成端粒更适于构建人工染色体。
[0011]本发明以玉米为材料，通过对玉米染色体端粒文库的构建技术的研究，达到优化玉米染色体端粒及人工染色体构建技术体系的目的。根据端体的特点，通过5’ -TTTAGGG-3’单引物扩增玉米染色体端粒的重复序列；利用分选纯化2.5-3.5Kb的PCR产物，制备端粒DNA和后续的连接转化验证，优化建库`各实验环节，形成一套系统的玉米染色体端粒文库构建技术，为玉米大片段转化的基因工程研究奠定基础。
[0012]本发明为转化大片段DNA载体系统的发展和应用提供了技术支持，并在玉米育种中有潜在的应用前景。植物体细胞杂交技术能够克服有性杂交不亲和障碍，转移有性杂交不能转移的性状，不仅能转移异源植物的核基因，而且可转移胞质基因。体细胞杂交可将控制数量性状的多个基因同时转入受体细胞，这是基因工程难以实现的。但由于玉米原生质体培养和融合很困难，该技术应用于玉米品种改良、增加玉米遗传多样性，在技术体系上还不成熟。另外，体细胞杂交也无法解决连锁累赘和后代大量分离的问题。所以，通过细胞工程方法利用玉米野生型基因资源有其不可解决的局限性。可转化大片段DNA载体中DNA插入片段长度可达IOOkb以上，有可能将控制某一性状的基因簇包括在内，这一突破弥补了常规基因工程中单基因转移所无法解决的数量性状改良的难题。同时，实现了在对插入大片段中基因功能进行快速鉴定，获得转基因植株，创新种质资源。利用可转化人工染色体载体系统，建立优良种种质基因组文库，将大片段DNA导入栽培玉米基因组，可以在得到插入片段相关信息的同时得到转基因植株，发挥基因簇的协同作用，克服传统育种和单基因转移的瓶颈，从而更好的挖掘优质基因资源，创新玉米种质。[0013]本发明的实施案例中也包括DNA构建体，该构建体含有操作性连接于异源核苷酸序列上的端粒，该启动子含有本发明技术获取的端粒，并可在植物细胞中稳定遗传。本发明的实施方案还提供了人工染色体构建方案，以及在基因组中稳定包含上述DNA构建体的植物或植物细胞。本文所公开的染色体端粒获取技术可用于植物基因工程，例如制备人工染色体用于转化或转基因植物，以产生目的表型。“转化植物”或“转基因植物”指在基因组内含有异源核苷酸序列的植物。通常转化植物或转基因植物基因组稳定含有这些异源核苷酸序列，可将该异源核苷酸序列稳定地遗传给下一代。这些异源核苷酸序列可单独或与重组DNA构建体一起存在于基因组中。这里所述的“转基因事件”包括任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物体部分或完整植物体，只要它们的基因型被外源核酸的存在而改变，包括通过转基因操作而改变的起始宿主，以及通过这些起始宿主进行有性或无性繁殖所得的后代。这里所用的“转基因事件”并不包括通过传统植物种植方法或天然事件(例如随机杂交、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变)改变了基因组(染色体或染色体外)的植物。
[0014]“转基因事件”通过以下步骤获得，使用人工染色体构建体(含有核酸表达盒，其中又含有所述端粒)转化植物细胞，获得大量植物体，根据插入的外源基因进行筛选获得所需的阳性转基因系。转基因事件的典型表型特征是目的基因的表达和人工染色体的稳定遗传。本文的“植物”包括整株植物、植物组织器官(如叶、根、茎等)、种子、植物细胞，以及它们的后代。实施方案中转基因植物的部分植株应理解为包括转基因植物或其后代的植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚，及从转基因植物或其后代长出的花、茎、果实、胚珠、叶或根等。
[0015]本文所公开的端粒获取技术可在宿主植物中与任何异源核苷酸序列结合。因此，所述的异源核苷酸序列可以是操作性连接于本文所公开的端粒之上的结构基因(编码目的蛋白)。实施方案中的目的基因包括参与信号传导调控的基因如转录因子、激酶等，持家基因如热休克蛋白基因。更具体地说，转基因的种类包括如，所编码蛋白赋予植物耐受非生物逆境的抗性基因，所述非生物逆境包括干旱、温度、盐和毒素(杀虫剂和除草剂)等。或是所编码蛋白赋予植物耐受生物逆境的抗性基因，如真菌、病毒、细菌、昆虫和线虫的侵害，以及由这些胁迫引起的疾病。表型的编码包括改变植物中某个基因的表达，从而改变植物对病原体或昆虫等的防御机制，或是提高植物对除草剂的抗性，根据环境改变植物的生长发育过程等。这些改变可通过在植物体内表达外源基因或提高内源特定基因的表达来获得。或者是通过降低植物体内一个或多个内源基因的表达产物，如酶、转运蛋白、辅因子等，通过影响植物的代谢机制来获得相应的表型。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为端粒获取技术路线。
[0017]图2为同步化处理的染色体流式核型图。玉米高质量的染色体悬浮液是实现提取染色体前提，玉米细胞周期同步化采用1.25mmol.L-1HU进行18h阻断处理，可将50%以上的细胞阻断在晚Gl期和早S期。左为未处理细胞，右为同步化处理细胞。
[0018]图3是单引物端粒PCR扩增电泳图。扩增片段集中在350bp到5Kb之间，回收
2.5-3.5Kb的DNA片段用于端粒鉴定。M =Marker ;1、2、3中模板DNA分别来自玉米根、叶、穗。
[0019]图4是利用载体pBlueScript SK+进行端粒文库构建。利用蓝白筛选去除空载体，并对白斑进行插入片段大小和序列进行分析。文库大小为3X103cfu。
[0020]图5是本发明鉴定获取的端粒功能的载体示意图。
[0021]图6是本发明获取的端粒转化水稻验证功能中水稻转化图。
【具体实施方式】
[0022]下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物均由上海英骏生物技术公司合成,测序由北京华大基因完成，PCR试剂盒、载体构建过程中的核酸内切酶购自宝生物工程有限公司，PEASY-Tl连接试剂盒购自北京全式金生物技术公司，T4DNA连接酶购自PiOmega公司，方法均参照试剂盒提供的方法进行。实验中所用的载体pDLC由本实验改造所得，基本骨架来自于CAMBIA公司的pCAMBIA1303。
[0023]1.端粒单引物PCR扩增端粒序列:
[0024]设计克隆端粒所需引物:
[0025]引物:5’-TTTAGGG-3’引物
[0026]利用端粒的引物，以玉米基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取的玉米同步化基因组DNA作为模板，进行扩增，反应条件是:95°C预变性5分钟；94°C变性20秒；35°C退火30秒；70°C延伸5分钟；30个循环；72°C延伸10分钟。反应结束后，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测回收2.5-3.5Kb的DNA，产物连入pBlueScriptSK+载体，筛选插入片段大于2.5Kb的阳性克隆并进行测序验证，结果表明:所扩增序列为预期的玉米端粒序列。
[0027]2.构建表达载体
[0028]将测序验证已经插入端粒序列的质粒用HindIII和BamHI双酶切，连入同样用HindIII和BamHI双酶切的载体pDLC，挑取菌落PCR结果为阳性的菌落进行测序，测序验证正确后，提取相应阳性克隆质粒，命名为pDLC-ml。
[0029]菌落PCR检测所需引物:
[0030]引物3: 5，-TCTCCGCTCATGACGATAAT-3，
[0031] 引物 4:5’ -GACGTAACATGGTGAAGGGG-3’
[0032]引物3和引物4为pDLC载体上引物，位于所克隆的启动子片段两侧，扩增片段约为启动子的长度，以菌液为模板，扩增检测，PCR反应条件为:95°C预变性5分钟；94°C变性30秒；55°C退火30秒；72°C延伸3分钟；30个循环；72°C延伸10分钟。
[0033]所构建的表达载体的T-DNA区的图谱如图所示，其中:LB和RB分别为T-DNA的左边界和右边界；Bar表示PPT除草剂抗性基因；Pnos表示nos基因的启动子；Tnos表示nos基因的终止子；DsRed表示红色荧光蛋白基因；HindIII和BamHI分别表示内切HindIII和BamHI的酶切位点；端粒即为本发明通过PCR-文库筛选克隆出的端粒序列。
[0034]3.农杆菌共转化
[0035]利用热激法将质粒pDLC-ml转入农杆菌AGLO菌株，利用农杆菌介导法对水稻进行共转化，同时利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥植株。
[0036]4.功能鉴定[0037]从转基因植株中分离各组织器官，进行DsRed活性检测，将各组织器官置于荧光显微镜下观察。
[0038]5.遗传稳定性分析
[0039]取Tl代水稻种子进行插入片段拷贝数分析，对单拷贝插入的株系的T2和T3代苗进行遗传分析。
【权利要求】
1.一种利用端粒文库获得玉米染色体端粒的方法，其特征是利用端粒保守序列进行单引物PCR扩增端粒序列、建立端粒文库，从中筛选得到天然的用于人工染色体构建的端粒序列。
2.权利要求1所述的端粒，其中所含的端粒序列为天然植物端粒，大小为2.5-3.5Kb。
3.权利要求2所述天然植物端粒，其中所含的序列经PCR单引物扩增得到。
4.权利要求2所述天然植物端粒，其中所含的序列经筛选端粒PCR文库得到。
5.权利要求1所述植物端粒，其用途为构建植物人工染色体。
6.权利要求5所述植物人工染色体，其包含用此技术得到的端粒。
7.权利要求5所述植物人工染色体，其中所述端粒来自禾本科植物，优选为玉米。
8.权利要求5所述植物人工染色体，其目标是转化大片段DNA(>30Kb)。
9.权利要求8所述大片段DNA，其可以来源于同源植物，也可来源于异源植物或其它生物。
10.一种利用端粒文库获得玉米染色体端粒的方法，所述方法包括向植物体导入DNA构建体，所述DNA构建体含有端粒及操作性连接于所述启动子的目的异源核苷酸序列，其中所述端粒选自: a)利用单引物PCR扩增； b)利用端粒文库筛选。``
11.一种载体，它含有权利要求10所述的核酸分子。
12.一种细胞，它含有权利要求11所述的载体。
13.权利要求12所述细胞，其中所述细胞包括细菌细胞，哺乳动物细胞，昆虫细胞，植物细胞，或真菌细胞。
14.权利要求13所述细胞，其中所述细菌细胞来自根癌土壤杆菌或大肠杆菌。
【文档编号】C40B50/00GK103571828SQ201310206556
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年5月29日 优先权日:2013年5月29日
【发明者】汤赛君, 任海翠, 马冉冉 申请人:中国农业大学