食品不锈钢加工器械表面致病菌生物菌膜的清除方法
【专利摘要】一种食品不锈钢加工器械表面致病菌生物菌膜的清除方法，属于食品安全与卫生检验领域。该清除方法首先将纤维素酶溶于酸性水溶液中，得到纤维素清洗液；取CTAB溶于水溶液中，得到CTAB清洗液；之后使用的纤维素清洗液对形成生物膜的器械设备表面进行喷涂、浸泡处理，最后使用CTAB清洗液对器械设备再次喷涂、浸泡；在浸泡之后使用清水对器械设备表面冲洗，以彻底去除器械设备表面残留的纤维素酶和CTAB液体。该清除方法可以彻底清除食品不锈钢器械表面的生物菌膜。
【专利说明】食品不锈钢加工器械表面致病菌生物菌膜的清除方法
【技术领域】
[0001]本发明属于食品安全与卫生检验领域，涉及生物酶降解和细胞表面电荷理论，针对细菌粘附于不锈钢器械表面，形成生物菌膜后产生的胞外分泌物骨架结构组分，研发出一种绿色、安全、高效的不锈钢加工器械表面细菌生物菌膜的清除方法，可全面降低交叉污染，保障食品安全。
【背景技术】
[0002]食源性致病菌已成为全球范围内引发食品安全事故的主要危害因子，每年约60%以上的食品安全事件与其密切相关，这对公众健康造成了极大的危害，食源性致病菌因其污染范围广、危害性大，受到了世界范围内的广泛关注，据欧洲食品安全委员会(EFSA)、美国FDA和中国食源性疾病监测网跟踪统计，每年均会爆发上千起食源性致病菌食物中毒事件，导致近百万消费者感染；此外，每年在全球因食源性致病菌污染导致大批食品被召回，这对加工企业造成了不可估量的经济和名誉损失。
[0003]食品受致病菌污染的途径很多，据中国食源性疾病监测网统计，27%的污染来自于食品加工设备等造成的交叉污染，是最主要的污染途径；调查结果显示，在美国，18%的食源性致病菌食物中毒是由加工过程中的交叉污染弓I起的，在英国，32 %的细菌性食物中毒与交叉污染密切相关。食品器械设备引起的交叉污染主要归因于器械设备表面存在的粘附菌体和生物菌膜，已有研究表明食源性致病菌可以粘附、生长于食品加工器械表面，在菌体-菌体和菌体-接触面的相互作用下，并通过菌体增殖、分泌胞外基质而形成具有一定空间结构的细菌聚集体，该聚集体被称为生物菌膜(b1film)。食品加工器械表面(不锈钢、塑料等表面)存在的致病菌生物菌膜对食品安全具有极大的威胁，尤其是现代食品加工机械化和自动化的快速发展，增加了加工器械与食品接触的面积和机率，同时也增大了致病菌在器械表面形成生物菌膜的机会，使食品受污染的概率明显增大。目前已从多种食品生产线的加工接触面中检测到致病菌生物菌膜的存在。
[0004]食品加工接触表面形成的致病菌生物菌膜对食品安全具有灾难性的影响，常规的清洗方法难以使其彻底清除，残留的菌体可发展为新的生物菌膜，形成交叉污染的传播中心；相对于浮游菌体，生物菌膜菌体对外源杀菌、清洁剂有更强的耐受性，生物菌膜的胞外分泌物对清洗剂有一定的阻碍作用，使其难以渗透到生物菌膜内部；控制清除生物菌膜的形成，减少交叉污染，一直都是食品安全领域的研究热点，目前常用的清洗措施大多为化学杀菌剂结合水清洗，控制理念仍停留在传统模式，清除效果不理想，生物菌膜残留量较大，化学清洗剂容易使细菌产生耐受性，同时对器械设备带来较大的腐蚀性。已有研究结果表明，沙门氏菌与不锈钢表面之间的相互作用(疏水和静电等)是其粘附于不锈钢表面的主要原因，同时，伴随生物菌膜形成时产生的胞外分泌物是其天然屏障，胞外分泌物的主要骨架为糖苷键和肽键。
【专利附图】
【附图说明】
[0005]图1为表面活性剂对生物菌膜清除数量的影响。
[0006]图2为生物酶对生物菌膜清除数量的影响。
[0007]图3为CTAB与纤维素酶的组合对生物菌膜清除数量的影响；
[0008]图3中，I，CTAB(先)+水(后)；11，纤维素酶清洗液(先)+水(后)；111，CTAB (先)+纤维素酶清洗液(后)；IV，纤维素酶清洗液(先)+CTAB (后)；V，溶于CTAB中的纤维素酶液。
[0009]图4不同组合处理后的荧光图像；
[0010]图4中，I?V的处理方式同图3中I?V的处理方式相同；图中白色为生物菌膜菌体，黑色为不锈钢表面背景。放大倍数为1000倍，标尺为20 μ m。
【发明内容】
[0011]本发明的目的是针对上述问题提供一种用于食品不锈钢加工器械表面致病菌生物菌膜的清除方法，该方法可以彻底清除食品不锈钢器械表面的生物菌膜。
[0012]本发明的目的可以通过以下技术方案实现:
[0013]一种食品不锈钢加工器械表面致病菌生物菌膜的清除方法，其特征在于:该清除方法包括如下步骤:
[0014]I)、将纤维素酶溶于酸性水溶液中，得到纤维素酶清洗液；
[0015]2)、取CTAB溶于水溶液中，得到CTAB清洗液；
[0016]3)、首先使用步骤I)制备得到的纤维素酶清洗液对形成生物膜的器械设备表面进行喷涂、浸泡处理，之后使用步骤(2)的CTAB清洗液对器械设备再次喷涂、浸泡处理；最后使用清水对器械设备表面冲洗。
[0017]本发明技术方案步骤I)中的酸性水溶液是pH值为5.0?6.0的水溶液。
[0018]本发明技术方案步骤I)中纤维素酶的质量体积浓度为30?100mg/mL ;优选纤维素酶的质量体积浓度为30?50mg/mL,最优选纤维素酶的质量体积浓度为40mg/mL。
[0019]本发明技术方案步骤I)中酸性水溶液的温度为35?45°C。
[0020]本发明技术方案步骤2)中CTAB的质量浓度为0.01?I % ;优选CTAB的质量浓度为0.08?0.15%，进一步优选CTAB的质量浓度为0.1?0.15%。
[0021]本发明技术方案步骤3)中纤维素酶清洗液对形成生物膜的器械设备表面进行浸泡处理的时间为0.5?3h ;优选浸泡处理的时间为0.5?Ih。
[0022]本发明技术方案步骤3)中CTAB清洗液对器械设备浸泡的处理时间为0.5?3h ;优选浸泡的处理时间为0.5?Ih。
[0023]本发明技术方案步骤I)中所述的纤维素酶为纤维素酶R-10。
[0024]本发明技术方案所述的CTAB的中文名称为十六烷基三甲基溴化铵。
【具体实施方式】
[0025]下面结合实施例对本发明作进一步地说明，但本发明的保护范围不限于此:
[0026]实施例1
[0027]以工业化禽肉屠宰、加工过程中净膛、分割和修整工序中使用的不锈钢器具和操作面为目标清洗物，在连续的工业化生产中，细菌(包括致病菌)易在此类器具表面形成生物菌膜。用HCl配置pH在5.0?6.0的水溶液50L，以pH试纸对溶液进行快速测定，对确定PH后的水溶液利用加热釜或其它加热设备，使其温度上升为35°C之间，添加2kg的纤维素酶R-10，充分搅拌后配制成40mg/mL的纤维素酶清洗液，备用；称量75g的CTAB添加至50L的水中，充分溶解混匀后，配制成质量浓度为0.15%的CTAB清洗液，备用；利用加压喷水设备将制备好的纤维素酶清洗液尽量均匀的喷洒在操作表面，或将操作器具浸泡于纤维素酶清洗液中，作用0.5h后，再将CTAB清洗液喷洒于操作面，或将操作器具浸泡于CTAB清洗液中，作用Ih后，利用清水冲洗操作器具或不锈钢操作面3min，此时，加工器械表面的致病菌生物菌膜已被彻底脱落清除，清除效果基本达到了 100%。
[0028]实施例2
[0029]以超市自制食品加工中或酒店餐厨中使用的不锈钢刀具为目标清洗物，长期的连续使用过程中，因清洗不当，细菌极易在此类器具表面形成生物菌膜。准备温度为40°C的热水20L，用HCl将其pH调整至5.0?6.0之间，用pH试纸快速确定溶液pH，添加0.8kg的纤维素酶R-10，充分溶解混匀后配制成40mg/mL的纤维素酶清洗液，备用；称量20g的CTAB添加至20L的水中，搅拌混匀后，配制成质量浓度为0.1%的CTAB清洗液，备用；将操作器具浸泡于纤维素酶清洗液中，作用Ih后，去除器具再将其浸泡于CTAB清洗液作用0.5h，随后，利用清水冲洗不锈钢器具2min，此时，不锈钢刀具表面的细菌生物菌膜已全部清除，清除效果基本达到了 100%。
[0030]实施例3
[0031]以工业化禽肉屠宰、加工过程中净膛、分割和修整工序中使用的不锈钢器具和操作面为目标清洗物，在连续的工业化生产中，细菌(包括致病菌)易在此类器具表面形成生物菌膜。用HCl配置pH在5.0?6.0的水溶液50L，以pH试纸对溶液进行快速测定，对确定PH后的水溶液利用加热釜或其它加热设备，使其温度上升为45°C之间，添加1.5kg的纤维素酶R-10，充分搅拌后配制成30mg/mL的纤维素酶清洗液，备用；称量40g的CTAB添加至50L的水中，充分溶解混匀后，配制成质量浓度为0.08%的CTAB清洗液，备用；利用加压喷水设备将制备好的纤维素酶清洗液尽量均匀的喷洒在操作表面，或将操作器具浸泡于纤维素酶清洗液中，作用Ih后，再将CTAB清洗液喷洒于操作面，或将操作器具浸泡于CTAB清洗液中，作用Ih后，利用清水冲洗操作器具或不锈钢操作面3min，此时，加工器械表面的致病菌生物菌膜已被彻底脱落清除，清除效果基本达到了 100%。
[0032]实施例4
[0033]以工业化禽肉屠宰、加工过程中净膛、分割和修整工序中使用的不锈钢器具和操作面为目标清洗物，在连续的工业化生产中，细菌(包括致病菌)易在此类器具表面形成生物菌膜。用HCl配置pH在5.0?6.0的水溶液50L，以pH试纸对溶液进行快速测定，对确定PH后的水溶液利用加热釜或其它加热设备，使其温度上升为40°C之间，添加2.5kg的纤维素酶R-10，充分搅拌后配制成50mg/mL的纤维素酶清洗液，备用；称量40g的CTAB添加至50L的水中，充分溶解混匀后，配制成质量浓度为0.08%的CTAB清洗液，备用；利用加压喷水设备将制备好的纤维素酶清洗液尽量均匀的喷洒在操作表面，或将操作器具浸泡于纤维素酶清洗液中，作用Ih后，再将CTAB清洗液喷洒于操作面，或将操作器具浸泡于CTAB清洗液中，作用Ih后，利用清水冲洗操作器具或不锈钢操作面3min，此时，加工器械表面的致病菌生物菌膜已被彻底脱落清除，清除效果基本达到了 100%。
[0034]性能检测:
[0035]图1是表面活性剂对生物菌膜清除数量的影响，选取不同类型的表面活性剂对生物菌膜进行处理，结果如图1所示，可以看出三种质量浓度(0.01%、0.1%和1% )的tween-80和Rhamnolipid均未产生明显的清除效果,而高(C, 1% )、中(B, 0.1% )浓度的CTAB的清除效果明显，清除的生物膜的数量达到了 5.4Log cfu/cm2以上，基本达到了 100%清除的效果(未处理前生物菌膜的总数约为5.4Log cfu/cm2)，因此选择中浓度(0.1% )的CTAB做为生物菌膜清除剂的备选物质。此外，发明人通过进一步研究发现，浓度为0.01%至浓度为0.1 %的十二烷基硫酸钠(SDS)对生物菌膜清除数量的很少，几乎可以忽略。
[0036]图2是生物酶对生物菌膜清除数量的影响，选取不同类型的生物酶对生物菌膜进行处理，结果如图2所示，随着浓度的升高，各酶的清除效果逐渐增大。相比于其它酶，纤维素酶在高浓度下的消除效果较强，清除的生物膜的数量达到了 0.8Log cfu/cm2左右，因此选择高浓度(40g/L)的纤维素酶作为生物菌膜清除剂的备选物质。
[0037]图3 CTAB与纤维素酶的组合对生物菌膜的清除数量影响，以0.08?0.15%的CTAB清洗液和30?50g/L的纤维素酶作为清除物质，以不同方式组合，各组合对生物菌膜的清除效果见图3，可以看出II方式对生物菌膜的清除效果最差，约为ILog cfU/cm2，IV方式处理的效果最强，对生物菌膜的清除效果基本达到了 100%。此外，从图3中可以进一步看出，本发明技术方案采用IV方式处理产生了较好的协同增效作用，因为单独使用CTAB清洗液，清除生物膜的数量为3.8Log cfu/cm2 ;单独使用纤维素酶清洗液，清除生物膜的数量为ILog cfu/cm2 ;而采用IV方式处理(纤维素酶清洗液(先)+CTAB(后))后，清除生物膜的数量为6.3Log cfu/cm2，由此不能看出本发明技术方案具有较好的协同杀菌作用。同时，发明人通过还进行了对比试验，如果采用III方式处理(CTAB(先)+纤维素酶清洗液(后))，清除生物膜的数量为4.4Log cfu/cm2，该技术方案没有产生意料不到的技术效果。
[0038]图4不同组合处理后的荧光图像，各方式处理后不锈钢表面的荧光图像(DAPI染色)结果如图4所示，相比于对照组，各处理组的生物菌膜明显减少，其中IV方式处理后残存的菌体最少，只有零星的菌体，而其它处理组中仍有不少生物菌膜的残基(大量的细菌聚集体)，这一现象也与图3中的计数结果吻合。
【权利要求】
1.一种食品不锈钢加工器械表面致病菌生物菌膜的清除方法，其特征在于:该清除方法包括如下步骤: 1)、将纤维素酶溶于酸性水溶液中，得到纤维素酶清洗液； 2)、取CTAB溶于水溶液中，得到CTAB清洗液； 3)、首先使用步骤I)制备得到的纤维素酶清洗液对形成生物膜的器械设备表面进行喷涂、浸泡处理，之后使用步骤(2)的CTAB清洗液再次进行喷涂、浸泡处理；最后使用清水对器械设备表面冲洗。
2.根据权利要求1所述的食品不锈钢加工器械表面致病菌生物菌膜的清除方法，其特征在于:步骤I)中的酸性水溶液是PH值为5.0?6.0的水溶液。
3.根据权利要求1所述的食品不锈钢加工器械表面致病菌生物菌膜的清除方法，其特征在于:步骤I)中纤维素酶的质量体积浓度为30?100mg/mL，优选纤维素酶的质量体积浓度为30?50mg/mL。
4.根据权利要求1所述的食品不锈钢加工器械表面致病菌生物菌膜的清除方法，其特征在于:步骤I)中酸性水溶液的温度为35?45°C。
5.根据权利要求1所述的食品不锈钢加工器械表面致病菌生物菌膜的清除方法，其特征在于:步骤2)中CTAB的质量浓度为0.01?1%;优选CTAB的质量浓度为0.08?0.15%。
6.根据权利要求1或3所述的食品不锈钢加工器械表面致病菌生物菌膜的清除方法，其特征在于:步骤3)中纤维素酶清洗液对形成生物膜的器械设备表面进行浸泡处理的时间为0.5?3h。
7.根据权利要求6所述的食品不锈钢加工器械表面致病菌生物菌膜的清除方法，其特征在于:步骤3)中纤维素酶清洗液对形成生物膜的器械设备表面进行浸泡处理的时间为0.5 ?Ih0
8.根据权利要求1或5所述的食品不锈钢加工器械表面致病菌生物菌膜的清除方法，其特征在于:步骤3)中CTAB清洗液进行浸泡处理时间为0.5?3h。
9.根据权利要求8所述的食品不锈钢加工器械表面致病菌生物菌膜的清除方法，其特征在于:步骤3)中CTAB清洗液进行浸泡处理时间为0.5?Ih。
10.根据权利要求1所述的食品不锈钢加工器械表面致病菌生物菌膜的清除方法，其特征在于:步骤I)中所述的纤维素酶为纤维素酶R-10。
【文档编号】C23G1/08GK104233331SQ201410462853
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月11日 优先权日:2014年9月11日
【发明者】王虎虎, 张新笑, 徐幸莲, 周光宏 申请人:南京农业大学