专利名称：一种在医疗器械表面固定抗体的方法
技术领域：
本发明属于医疗器械领域，涉及一种在医疗器械表面固定抗体的方法。
技术背景将生物制品，如蛋白质、抗体、生长因子以及基因质粒等固定在固体表 面，如金属表面、陶瓷表面以及高分子材料表面已经在生物芯片中广泛应用。 随着医疗器械的发展，尤其是含药医疗器械的出现，将生物制品固定在医疗 器械表面已经成为一种广泛深入研究的课题。生物制品中的抗体相对于一般 的蛋白质而言具有稳定性高，不易失活以及抗原抗体反应的特异性等优点， 已经广泛应用于体外诊断试剂，并且已经应用于药物治疗。因此将抗体牢固 固定在医疗器械表面，包括金属表面以及各种高分子涂层表面，并且不损坏 抗体活性就成为一项很关键的科技攻关技术。目前将抗体固定在固体表面的一般包括化学键合和物理吸附两种方法。 化学键合方法一般采用首先对固体表面进行醛基化、羧基化处理，再利用化学接枝的方法固定抗体；在将抗体固定在固体表面时需要解决的两个关键问 题是1抗体在固体表面固定的牢固程度，2抗体在固体表面活性的保持。 目前在生物芯片上，最常采用的方法是采用首先对固体表面，如玻璃，金属 以及塑料表面进行醛基化或者羧基化处理，然后采用化学接枝的方法将抗体 固定在固体表面，这种方法牢固程度高，虽然能够很好固定抗体，但是抗体 的活性会有所降低；物理吸附方法虽然能很好保持抗体在固体表面活性，但 是很难保持抗体固定的牢固度。因此如何将这些生物制品很好的固定在医疗 器械表面是一个呈待解决的重要关键技术问题。发明内容本发明的目的在于提供一种在医疗器械表面固定抗体的方法，可提高抗 体在器械表面固定的牢固程度，并保持抗体在医疗器械表面具有很高的活性。本发明采用的技术方案 一种在医疗器械表面固定抗体的方法，主要包 括①器械本体表面的预处理、②制备孔洞、③器械本体表面的后处理、 固 定抗体工艺步骤，所述的②制备孔洞是采用化学或物理方法在器械本体表面 制备大小均一的孔洞；所述的④固定抗体是将表面带有孔洞的器械本体浸没 在含有生物制品抗体的溶液中，调节抗体缓冲液的pH值使抗体溶液带正电荷， 通过正负电荷相吸将生物制品抗体固定在器械本体表面。所述的①器械本体表面的预处理利用超声波对器械本体表面清洗清除杂质，使用浓度为99. 5%的丙酮分析纯溶液，或浓度为75%的医用乙醇溶剂， 利用频率为28 100khz超声波清洗支架本体材料，清洗5-15min，去除本体 材料表面的杂质，将清洗后的本体材料放置在干燥机中，温度设定在30 40 °C，干燥30 60min后取出备用。所述的②制备孔洞采用化学腐蚀、电化学腐蚀、阳极氧化、微弧氧化、 微弧氮化方法在器械本体上直接制备大小均一的多晶相结构孔洞；将器械本 体材料浸泡在0 10(TC温度的腐蚀液中，所述的腐蚀液优选浓度为1 38% 的盐酸，或含有1 38%的盐酸混合1 98%的硫酸成分的盐酸混酸溶液，腐 蚀时间根据浓度、温度不同控制在lmin 480h后形成单尺寸纳米级孔洞。所述的③器械本体表面的后处理将上述处理好的器械本体材料先使用 浓度为99. 5%的丙酮分析纯溶液，再经蒸馏水利用频率为28 100khz超声波 清洗本体材料5-15min;最后将清洗后的本体材料放置在干燥机中，温度设定 在30 40。C，干燥30 60min后取出备用；或用蒸馏水配制浓度为1 38% 的盐酸溶液，将本体材料浸泡在配好的溶液中，放置在恒温箱中，温度设定 在20。C左右，放置30min 48h取出。所述的器械本体包括支架、导管、导丝、心脏起搏器、心脏瓣膜、外科 植入材料、植入硬组织，以及基材为陶瓷、有机聚合物、无机物、金属氧化 物的非金属医疗器械；所述的支架为球囊扩张型支架、自膨胀型支架、血管 支架、非血管支架，基材为不锈钢、镍钛记忆合金、钴基合金、纯钛、钛合 金的支架，以及丝材编织、管材激光切割、模铸、焊接的支架。所述的生物制品抗体包括下述一种或多种物质肝素、抗血小板膜糖蛋 白(GPIIb/IIIa)受体剂拮抗、抗体治癌药物、阿昔单抗、生物多肽、CD34 抗体、CD31抗体、CD133抗体。所述的④固定抗体(1) .将表面带有孔洞的支架浸没在含有0. l 10ug/mL CD34抗体磷酸 盐缓冲液溶液中，25 37'C温育20 30min后取出；(2) .将支架用磷酸盐缓冲液溶液清洗3次，每次5min，保持室温向支架 吹风15min，待支架干燥后4"C保存；(3) .将表面带有抗体的支架浸没在500 UL5X牛血清白蛋白(BSA)的 磷酸盐缓冲液溶液中，25 37'C温育20 30 min后取出支架，空气中晾干；(4) .将支架放入500 UL 0.01ng/"L人重组CD34抗原的磷酸盐缓冲液 溶液中，25 37'C放置20 30 min，取出支架，空气中晾干；(5) .将支架放入500uL lug/mL异硫氰酸荧光素(FITC)标记的CD34 抗体的磷酸盐缓冲液溶液，或辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠的IgG， 的磷酸盐缓冲液溶液，25 37'C温育20 30min后取出支架；(6) .将支架用磷酸盐缓冲液溶液清洗3次，每次5min后晾干支架。 所述的④固定抗体之后进行⑤抗体活性检测采用人工模拟血液动力学和支架表面抗体活性检测方法验证固定生物制品抗体的有效性，通过荧光显 微镜对支架进行荧光照相，或采用3-氨基-9-乙基-咔唑(AEC)染色试剂盒，免疫组化染色后拍照。所述的④固定抗体之后进行⑤抗体活性检测将表面固定有小鼠抗人 CD34抗体支架，此时支架处于预装前或者球囊扩张后状态，放置在流动人工模拟体液，如压力lOOmmHg、流速91cm/s，磷酸盐缓冲液溶液中进行冲刷试 验。所述的④固定抗体与⑤抗体活性检测(1) .将表面带有孔洞的支架浸没在含有0. l 10yg/mL CD34抗体磷酸 盐缓冲液溶液中，25 37X:温育20 30 min后取出；(2) .将支架用磷酸盐缓冲液溶液清洗3次，每次5 min，保持室温向支 架吹风15 inin，待支架干燥后4'C保存；(3) .将表面带有抗体的支架浸没在500 uL5X牛血清白蛋白(BSA)的 磷酸盐缓冲液溶液中，25 37'C温育20 30 min后取出支架，空气中晾干；(4) .将支架放入辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠的IgG的磷 酸盐缓冲液溶液中，25 37t:温育20 30 min，取出支架；(5) .将支架用磷酸盐缓冲液溶液清洗3次，每次5min，将支架放入500 uLTMB底物缓冲液，如10mg/5mL无水乙醇0.5mL，底物缓冲液，如Na2HP04 1.42g;柠檬酸钠0. 96g，加蒸馏水至50mL， 5 mL; 0. 75%过氧化氢32 y L， 25 37。C温育15 min后，加入250 yL 2 M硫酸溶液以终止反应；(6) .使用酶标仪测定492nm下溶液的吸光度，将己知浓度的CD34抗体 按照不同浓度梯度，1:10， 1:20， 1:50， 1:100， 1:500， 1:1000， 1:10000包 被在酶标板上，将A492nm对CD34抗体浓度进行模拟得出标准曲线。(7).根据所测的吸光度和标准曲线确定支架表面抗体的量，结果表明 带有孔洞316L不锈钢支架每lmm长度可固定1 20 ng CD34抗体。 本发明所具有的积极有益效果1. 采用化学腐蚀、电化学腐蚀方法在医疗器械表面形成多孔表面，表面 孔洞大小均一，呈多晶相结构，生物制品抗体通过孔洞的物理吸附作用固定 在医疗器械的表面，牢固程度高，可保持抗体在医疗器械表面具有很高的活 性；2. 孔洞的形成，可将生物制品抗体很好的固定在医疗器械表面，充分发 挥生物制品在预防支架内再狭窄和抗血栓方面的作用，克服了医疗器械使用 过程中带来的一些负面影响，如支架内再狭窄和血栓形成的问题，为冠状动 脉粥样硬化的患者带来福音；3. 本发明工艺简单，检测准确可靠，可广泛应用于生物芯片和在医疗器 械表面，如血管支架，骨科植入设备等固定生物抗体。
图1为本发明经处理后316L不锈钢支架表面的扫描电镜照片； 图2为本发明抗体支架荧光照片；图3为本发明带有孔洞的316L不锈钢支架3-氨基-9-乙基-咔唑(AEC)染色照片；
图4为本发明抗体支架3-氨基-9-乙基-咔唑(AEC)染色照片； 图5为本发明抗体支架预装前24h冲刷后染色结果； 图6为本发明抗体支架经球囊扩张后24h冲刷后染色结果； 图7为本发明比较不同工艺条件下孔洞固定抗体的相对含量。
具体实施方法
一种在医疗器械表面固定抗体的方法，主要包括①器械本体表面的预处 理、②制备孔洞、③器械本体表面的后处理、④固定抗体、⑤抗体活性检测 等工艺步骤；首先按照本公司的专利申请申请号为200610168125.0,申请 日为2006.12.14，名称为"药物洗脱器械用纳米级孔洞药物释放结构及其制 备方法"中提出的工艺步骤，采用化学腐蚀、电化学腐蚀、阳极氧化、微弧 氧化、微弧氮化方法在医疗器械表面，如316L不锈钢金属裸支架表面制备形 成多孔表面，表面孔洞大小均一，呈多晶相结构，孔洞的大小为400 600nm， 如图1所示，为经处理后316L不锈钢支架表面的扫描电镜照片。其中
① 器械本体表面的预处理利用超声波对器械本体表面清洗清除杂质， 如选用不锈钢裸支架，使用浓度为99. 5%的丙酮分析纯溶液，或浓度为75%的 医用乙醇溶剂，利用频率为28 100khz超声波清洗支架本体材料，清洗 5-15min，去除本体材料表面的杂质，将清洗后的本体材料放置在干燥机中， 温度设定在30 40。C，干燥30 60min后取出备用；
② 制备孔洞采用酸溶液腐蚀致孔方法在器械本体上直接制备大小均一 的孔洞；将器械本体材料浸泡在0 10(TC温度的腐蚀液中，所述的腐蚀液优 选浓度为1 38%的盐酸，或含有1 38%的盐酸混合1 98%的硫酸成分的盐 酸混酸溶液，腐蚀时间根据浓度、温度不同控制在lmin 480h后形成单尺寸 纳米级孔洞；
③ 器械本体表面的后处理将上述处理好的器械本体材料先使用浓度为 99. 5%的丙酮分析纯溶液，再经蒸馏水利用频率为28 100khz超声波清洗本 体材料5-15min;最后将清洗后的本体材料放置在干燥机中，温度设定在30 40°C，干燥30 60min后取出备用；或用蒸馏水配制浓度为1 38%的盐酸溶 液，将本体材料浸泡在配好的溶液中，放置在恒温箱中，温度设定在20。C左 右，放置30min 48h取出；
④ 固定抗体将表面带有孔洞的金属裸支架浸没在含有生物制品抗体的 溶液中，通过调节抗体缓冲液的pH值使抗体溶液带正电荷，从而通过正负电 荷相吸的物理吸附原理将生物制品抗体固定在医疗器械表面，并利用金属裸 支架表面孔洞的深度和尺寸提高抗体在器械表面固定的牢固程度，不仅能够 牢固固定抗体并使支架表面抗体具有很高的活性；
⑤ 抗体活性检测采用人工模拟血液动力学和支架表面抗体活性检测方 法验证固定生物制品抗体的有效性。
所述的器械本体包括支架、导管、导丝、心脏起搏器、心脏瓣膜、外科植入材料、植入硬组织，以及基材为陶瓷、有机聚合物、无机物、金属氧化
物的非金属医疗器械；所述的支架为球囊扩张型支架、自膨胀型支架、血管 支架、非血管支架，基材为不锈钢、镍钛记忆合金、钴基合金、纯钛、钛合 金的支架，以及丝材编织、管材激光切割、模铸、焊接的支架。
所述的生物制品抗体包括下述一种或多种物质肝素、抗血小板膜糖蛋
白(GPIIb/IIIa)受体剂拮抗、抗体治癌药物、阿昔单抗、生物多肽、CD34 抗体、CD31抗体、CD133抗体。 以下给出本发明的较佳实施例 实施例1
为基于CD34抗体抗原结合反应的支架表面固定抗体CD34的方法及抗体
活性的荧光检测，其步骤如下
(1) .将表面带有孔洞的316L不锈钢支架浸没在含有0. l 10ug/mL CD34
抗体，如小鼠抗人CD34抗体，II型，由美国干细胞科技有限公司出品的磷酸 盐缓冲液，PH=7. 2 7.4溶液中，25 37。C温育20 30min后取出；
(2) .将支架用磷酸盐缓冲液，PH二7.2 7.4溶液清洗3次，每次5min， 保持室温25°C向支架吹风15min，待支架干燥后4。C保存；
(3) .将表面带有抗体的支架浸没在500 ^L5X牛血清白蛋白(BSA)的 磷酸盐缓冲液，ra二7.2 7.4溶液中，25 37。C温育20 30min后，取出支 架，空气中晾干；
(4) .将支架放入500 "L 0.01ng/uL人重组CD34抗原，由美国生物公 司出品的磷酸盐缓冲液，PH二7.2 7.4溶液中，25 37。C放置20 30 min， 取出支架，空气中晾干；
(5) .将支架放入500uL 1 u g/mL异硫氰酸荧光素(FITC)标记的CD34 抗体，如小鼠抗人CD34抗体，II型，由美国干细胞科技有限公司出品的磷酸 盐缓冲液，PH二7.2 7.4溶液，25 37。C温育20 30min后，取出支架；
(6) .将支架用磷酸盐缓冲液，ra=7.2 7.4溶液清洗3次，每次5min 后晾干支架；
(7) .采用荧光显微镜，如日本奥林巴斯荧光显微镜对支架进行荧光照相， 以带有孔洞的316L不锈钢支架作为对照支架，结果如图2所示。
实施例2
为基于CD34抗体抗原结合反应的支架表面固定抗体CD34的方法及抗体 活性的免疫组化检测，其支架表面固定抗体CD34的方法与实施例1中的1-6 步骤相同；对抗体活性的免疫组化检测，如步骤7.采用3-氨基-9-乙基-咔 唑(AEC)染色试剂盒，由中国华美生物工程公司出品，免疫组化染色后拍照， 以带有孔洞的316L不锈钢支架作为对照支架，结果如图3、图4所示。
实施例3
为抗体支架在人工体液中的血液动力学模拟试验与支架表面固定抗体的 方法及牢固度的检测，其步骤如下
(1).将表面固定有小鼠抗人CD34抗体支架，此时支架处于预装前或者 球囊扩张后状态，放置在流动人工模拟体液，如压力100mmHg、流速91cm/s，磷酸盐缓冲液，PH=7. 2 7. 4的溶液中进行冲刷试验；
(2).冲刷24小时后采用实施例2的方法检测支架表面抗体的活性；试 验结果如图5、图6所示，表明采用支架表面孔洞物理吸附抗体的牢固度很好， 能够在高速的动脉血流中仍能良好的固定在支架表面，并保持有较高的活性。
实施例4
为支架表面固定抗体的方法及抗体级联放大的定量检测，其步骤如下
(1) .将表面带有孔洞的316L不锈钢支架浸没在含有0. 1 10 u g/mL CD34 抗体，如小鼠抗人CD34抗体，II型，美国干细胞科技有限公司的磷酸盐缓冲 液，PH=7. 2 7.4溶液中，25 37。C温育20 30 min后取出；
(2) .将支架用磷酸盐缓冲液，PH二7.2 7.4溶液清洗3次，每次5 min， 保持室温25。C向支架吹风15 min，待支架干燥后4。C保存；
(3) .将表面带有抗体的支架浸没在500 PL5^牛血清白蛋白(BSA)的 磷酸盐缓冲液，PH=7. 2 7. 4溶液中，25 37。C温育20 30 min后取出支架， 空气中晾干；
(4) .将支架放入辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠的IgG，由中 国华美生物工程公司出品的磷酸盐缓冲液，ra = 7.2 7.4溶液中，25 37 。C温育20 30 min，取出支架；
(5) .将支架用磷酸盐缓冲液，PH二7.2 7.4溶液清洗3次，每次5min， 将支架放入500 uL TMB底物缓冲液，如10 mg/5 mL无水乙醇0.5 mL，底 物缓冲液，如Na2跳1.42 g;柠檬酸钠0.96 g，加蒸馏水至50 mL， 5 mL; 0.75%过氧化氢32 uL， 25 37'C温育15 min后，加入250 uL 2 M硫酸溶 液以终止反应；
(6) .使用酶标仪测定492nm下溶液的吸光度(A492)，将带有孔洞的316L 不锈钢支架作为对照支架，同时将已知浓度的CD34抗体按照不同浓度梯度， 1:10, 1:20， 1:50， 1:100， 1:500， 1:1000， 1:10000包被在酶标板上按照上 述方法测定A492nm，将A492nm对CD34抗体浓度进行模拟得出标准曲线；
(7) .根据所测的吸光度和标准曲线确定支架表面抗体的量，结果表明带 有孔洞316L不锈钢支架每l腿长度可固定1 20 ng CD34抗体。
实施例5
为测定不同缓冲液对血管支架表面固定抗体相对含量的影响，比较不同 工艺条件下孔洞固定抗体的相对含量，其步骤如下
(1) .将带有孔洞的血管支架，长度为12rran浸没在0. l 10ug/mL CD34 抗体，如小鼠抗人CD34抗体，II型，由美国干细胞科技有限公司出品的磷酸 盐缓冲液，PH=7. 2 7. 4或碳酸盐缓冲液，PH=9. 6溶液25 37。C温育20 30 min后取出，空气中晾干；
(2) .按照实施例4中的检测方法，确定不同pH值对孔洞血管支架表面 固定抗体相对含量的影响，结果表明相同条件下碳酸盐溶液中血管支架固定 的抗体相对含量较多，结果如图7所示。
权利要求
1. 一种在医疗器械表面固定抗体的方法，主要包括①器械本体表面的预 处理、②制备孔洞、③器械本体表面的后处理、④固定抗体工艺步骤，其特 征在于所述的②制备孔洞是采用化学或物理方法在器械本体表面制备大小均 一的孔洞；所述的④固定抗体是将表面带有孔洞的器械本体浸没在含有生物 制品抗体的溶液中，调节抗体缓冲液的pH值使抗体溶液带正电荷，通过正负 电荷相吸将生物制品抗体固定在器械本体表面。
2. 根据权利要求1所述的一种在医疗器械表面固定抗体的方法，其特征 在于所述的①器械本体表面的预处理利用超声波对器械本体表面清洗清除 杂质，使用浓度为99. 5%的丙酮分析纯溶液，或浓度为75。/。的医用乙醇溶剂， 利用频率为28 100khz超声波清洗支架本体材料，清洗5-15min，去除本体 材料表面的杂质，将清洗后的本体材料放置在干燥机中，温度设定在30 40 。C，干燥30 60min后取出备用。
3. 根据权利要求1所述的一种在医疗器械表面固定抗体的方法，其特征 在于所述的②制备孔洞采用化学腐蚀、电化学腐蚀、阳极氧化、微弧氧化、 微弧氮化方法在器械本体上直接制备大小均一的多晶相结构孔洞；将器械本 体材料浸泡在0 10(TC温度的腐蚀液中，所述的腐蚀液优选浓度为1 38% 的盐酸，或含有1 38%的盐酸混合1 98。/。的硫酸成分的盐酸混酸溶液，腐 蚀时间根据浓度、温度不同控制在lmin 480h后形成单尺寸纳米级孔洞。
4. 根据权利要求1所述的一种在医疗器械表面固定抗体的方法，其特征 在于所述的③器械本体表面的后处理将上述处理好的器械本体材料先使用 浓度为99. 5%的丙酮分析纯溶液，再经蒸馏水利用频率为28 100khz超声波 清洗本体材料5-15min;最后将清洗后的本体材料放置在干燥机中，温度设定 在30 4(TC，干燥30 60min后取出备用；或用蒸馏水配制浓度为1 38% 的盐酸溶液，将本体材料浸泡在配好的溶液中，放置在恒温箱中，温度设定 在20。C左右，放置30min 48h取出。
5. 根据权利要求1所述的一种在医疗器械表面固定抗体的方法，其特征 在于所述的器械本体包括支架、导管、导丝、心脏起搏器、心脏瓣膜、外科 植入材料、植入硬组织，以及基材为陶瓷、有机聚合物、无机物、金属氧化 物的非金属医疗器械；所述的支架为球囊扩张型支架、自膨胀型支架、血管 支架、非血管支架，基材为不锈钢、镍钛记忆合金、钴基合金、纯钛、钛合 金的支架，以及丝材编织、管材激光切割、模铸、焊接的支架。
6. 根据权利要求1所述的一种在医疗器械表面固定抗体的方法，其特征 在于所述的生物制品抗体包括下述一种或多种物质肝素、抗血小板膜糖蛋 白(GPIIb/IIIa)受体剂拮抗、抗体治癌药物、阿昔单抗、生物多肽、CD34 抗体、CD31抗体、CD133抗体。
7. 根据权利要求l所述的一种在医疗器械表面固定抗体的方法，其特征 在于所述的④固定抗体(1).将表面带有孔洞的支架浸没在含有0. l 10ug/mL CD34抗体磷酸盐缓冲液溶液中，25 37-C温育20 30min后取出；(2) .将支架用磷酸盐缓冲液溶液清洗3次，每次5min，保持室温向支架 吹风15min，待支架干燥后4"C保存；(3) .将表面带有抗体的支架浸没在500 uL5X牛血清白蛋白(BSA)的 磷酸盐缓冲液溶液中，25 37。C温育20 30 min后取出支架，空气中晾干；(4) .将支架放入500 uL 0.01ng/uL人重组CD34抗原的磷酸盐缓冲液 溶液中，25 37X:放置20 30 min，取出支架，空气中晾干；(5) .将支架放入500uL lug/mL异硫氰酸荧光素(FITC)标记的CD34 抗体的磷酸盐缓冲液溶液，或辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠的IgG， 的磷酸盐缓冲液溶液，25 37。C温育20 30min后取出支架；(6) .将支架用磷酸盐缓冲液溶液清洗3次，每次5min后晾干支架。
8. 根据权利要求1所述的一种在医疗器械表面固定抗体的方法，其特征 在于所述的④固定抗体之后进行⑤抗体活性检测采用人工模拟血液动力学 和支架表面抗体活性检测方法验证固定生物制品抗体的有效性，通过荧光显 微镜对支架进行荧光照相，或采用3-氨基-9-乙基-咔唑(AEC)染色试剂盒，免 疫组化染色后拍照。
9. 根据权利要求l所述的一种在医疗器械表面固定抗体的方法，其特征 在于所述的④固定抗体之后进行⑤抗体活性检测将表面固定有小鼠抗人 CD34抗体支架，此时支架处于预装前或者球囊扩张后状态，放置在流动人工 模拟体液，如压力lOOmmHg、流速91cm/s，磷酸盐缓冲液溶液中进行冲刷试 验。
10. 根据权利要求1所述的一种在医疗器械表面固定抗体的方法，其特 征在于所述的④固定抗体与⑤抗体活性检测(1) .将表面带有孔洞的支架浸没在含有0. l 10ug/mL CD34抗体磷酸 盐缓冲液溶液中，25 37'C温育20 30 min后取出；(2) .将支架用磷酸盐缓冲液溶液清洗3次，每次5min，保持室温向支 架吹风15 min，待支架干燥后4"C保存；(3) .将表面带有抗体的支架浸没在500 uL5X牛血清白蛋白(BSA)的 磷酸盐缓冲液溶液中，25 37。C温育20 30 min后取出支架，空气中晾干；(4) .将支架放入辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠的IgG的磷 酸盐缓冲液溶液中，25 37t:温育20 30 min，取出支架；(5) .将支架用磷酸盐缓冲液溶液清洗3次，每次5min，将支架放入500 PLTMB底物缓冲液，如10mg/5mL无水乙醇0.5mL，底物缓冲液，如Na2HP04 1.42g;柠檬酸钠0.96g，加蒸馏水至50mL， 5 mL; 0.75%过氧化氢32 u L， 25 37t:温育15 min后，加入250 uL 2 M硫酸溶液以终止反应；(6) .使用酶标仪测定492nm下溶液的吸光度，将已知浓度的CD34抗体 按照不同浓度梯度，1:10, 1:20， 1:50， 1:100， 1:500， 1:1000， 1:10000包 被在酶标板上，将A492nm对CD34抗体浓度进行模拟得出标准曲线。(7) .根据所测的吸光度和标准曲线确定支架表面抗体的量，结果表明带 有孔洞316L不锈钢支架每lmm长度可固定1 20 ng CD34抗体。
全文摘要
本发明涉及一种在医疗器械表面固定抗体的方法。主要包括①器械本体表面的预处理、②制备孔洞、③器械本体表面的后处理、④固定抗体等工艺步骤；所述的②制备孔洞是采用化学或物理方法在器械本体表面制备大小均一的孔洞；所述的④固定抗体是将表面带有孔洞的器械本体浸没在含有生物制品抗体的溶液中，调节抗体缓冲液的pH值使抗体溶液带正电荷，通过正负电荷相吸将生物制品抗体固定在器械本体表面；最后采用人工模拟血液动力学和支架表面抗体活性检测方法验证固定生物制品抗体的有效性；可提高抗体在器械表面固定的牢固程度，并保持抗体在医疗器械表面具有很高的活性。
文档编号A61L27/28GK101310778SQ20071010764
公开日2008年11月26日 申请日期2007年5月23日 优先权日2007年5月23日
发明者余占江, 蒲忠杰 申请人:乐普(北京)医疗器械股份有限公司