本发明涉及生态农业和环境保护技术领域，具体地说，涉及利用木薯酒精废水生产的微生物肥料及其在防治农业面源污染方面的应用。
背景技术：
木薯的淀粉含量高，种植、耐干旱贫瘠，不与粮食作物争耕地，价格便宜，是生产乙醇的首选原料。木薯酒精可广泛应用于医药、化工、食品等行业，且可作为可再生能源和清洁能源，市场潜力巨大。但是，在利用木薯发酵生产酒精的过程中，会产生大量高浓度有机废水(cod浓度数万毫克/升)，生产1吨酒精需要排放高浓度废水约15吨，处理达标非常困难，处理成本高，生产企业难以承受。酒精废水对环境的污染问题日益突出，已成为制约国内酒精生产企业发展的瓶颈。
木薯酒精废水主要是酒精生产过程中产生的大量废醪液，其主要含有残余淀粉、糖分、粗蛋白、纤维素、各种无机盐及菌体物质等。厌氧-好氧生物处理法是目前常用的处理方法，例如：中国发明专利(申请号：201010167513.3)中公开了一种酒精废水厌氧消化的方法，经过两级厌氧、好氧、厌氧活性污泥分离、厌氧活性污泥浓缩回用、液固分离、干糟燃烧和废水深度处理过程。中国发明专利(申请号：201110429555.4)中公开了一种木薯酒精废水两级厌氧处理系统，两级厌氧产生的沼气收集利用，然后废水再进入后续好氧段继续处理。中国发明专利(申请号：201210000389.0)中公开了一种木薯酒精废水多级处理系统，是缺氧1—好氧1—缺氧2—好氧2—膜生物反应器组合工艺。中国发明专利(申请号：201210265698.0)中公开了一种木薯酒精混合废液处理和回用方法，是木薯酒精蒸馏工序的蒸馏废液与经过厌氧处理和好氧处理的中水进行混合及处理后回用于木薯粉碎工序或回用于调浆工序。中国发明专利(申请号：201510420641.7)中公开了一种木薯酒精废水的生物处理工艺，包括：高温厌氧处理、中温厌氧处理、膜生物反应器、好氧处理、纳滤深度处理等过程。可见，目前的已有处理工艺都存在流程长、处理费用高、高浓度废水的资源化利用率低的缺点，开发简便易行并且经济效益好的废水资源化利用技术仍然是一项非常紧迫的任务。
枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)是一类好氧型、内生抗逆孢子的杆状细菌，大小(0.8～1.2)μm×(1.5～4.0)μm，革兰氏染色阳性，可产荚膜，芽孢中生或近中生，菌落粗糙，能液化明胶，胨化牛奶，还原硝酸盐，水解淀粉，为典型好氧菌广泛存在于土壤、湖泊、海洋和动植物的体表，自身没有致病性。枯草芽孢杆菌可通过成功定殖于植物根际、体表或体内，同病原菌竞争植物周围的营养、分泌抗菌物质抑制病原菌生长，同时诱导植物防御系统抵御病原菌入侵，从而具有生防的效果。枯草芽孢杆菌还能够产生类似细胞分裂素、植物生长激素的物质，促进植物的生长。例如：美国agraquest公司用枯草芽孢杆菌qst713菌株开发出活菌制剂杀菌剂serenadetm，并于2000年通过美国环保局(epa)的登记，用于防治多种作物的白粉病、霜露病、疫病、灰霉病等病害。枯草芽孢杆菌mbi600在英国的microbiogroupltd.、日本的idemistukosanco.,ltd.等均已获得注册登记，并进行产业化生产，用于防治叶部病害(灰霉病、白粉病)和根部病害(枯萎病、根腐病、黑斑病等)。枯草芽孢杆菌fzb24在德国、美国等国家进行了注册，并在德国bayer公司投入生产，用于防治番茄晚疫病、灰霉病和小麦白粉病，还可作为增产促进剂。随着对枯草芽孢杆菌研究的不断深入，发现其在工业、农业、医药卫生、食品保健、水产养殖等方面具有广泛应用价值。
中国发明专利(申请号：201210328716.5)中公开了一枯草芽孢杆菌t-500菌株，保藏编号为cgmccno.6058，对水稻稻瘟菌、水稻纹枯菌、水稻白叶枯病菌、水稻稻曲病菌、水稻细菌性条斑病菌、禾谷镰刀菌、黄曲霉及黑曲霉菌等病原菌，表现出较强的抑菌活性，并对其引起的病害有较好的防控作用，发酵培养基组成包括：碳源(蔗糖或淀粉)、氮源(黄豆粉、豆饼粉、玉米桨中的一种或几种种混合)、微量元素(牛肉浸出膏、酵母膏或者鱼粉中一种或两种混合)。中国发明专利(申请号：201210229066.9)中公开了一株具有抑菌活性的枯草芽孢杆菌cx31菌株，保藏编号为cctccno.m2012138，该菌株的培养采用牛肉膏蛋白胨培养基。中国发明专利(申请号：201110205587.6)中公开了一株内生枯草芽孢杆菌，保藏编号为cgmccno.4844，对胡椒瘟病有良好的防治效果，培养该菌株采用的培养基为：pda培养基。
综上所述，具有促进植物生长、拮抗植物病害的枯草芽孢杆菌的菌株报道较多，其培养方法也各不相同，但是，原料成本普遍较高。而采用木薯酒精废水作为培养枯草芽孢杆菌的主要原料，节省了原料成本，用其生产的微生物肥料防控农业面源污染也未见报道。
技术实现要素：
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种利用木薯酒精废水生产的微生物肥料及其在防治农业面源污染方面的应用。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
本发明所使用的菌株是由发明人从土壤中分离筛选出来的一株高效促进植物生长、拮抗植物病原菌、提高作物品质的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)szx11菌株，该菌株于2013年9月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmccno.8188，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。所述保藏信息已被记载于公开号为cn105779323a，公开日为2016年07月20日的中国专利申请中。
本发明所述的多功能微生物肥料的生产方法如下：
1、木薯酒精废水预处理：将高浓度木薯酒精废水用自来水稀释到cod浓度为3-5万毫克/升，再用生物质热电厂的富含碳酸钾的草木灰调节稀释后的木薯酒精废水的ph到7.0～8.5，于110～121℃灭菌10～30分钟，静置沉降，至40℃以下；上清液即为芽孢杆菌szx11菌株的液体培养基；沉淀物用于配制芽孢杆菌szx11菌株的固态培养基。
2、液体种子制备：向装有预处理好的木薯酒精废水液体培养基的三角瓶中接种斜面保藏的枯草芽孢杆菌szx11菌株，于30～40℃，120～200转/分振荡培养24～36小时，得到液体种子。
3、液态发酵：向装有预处理好的木薯酒精废水液体培养基发酵罐中接种体积比为2％～10％的液体种子，于25～40℃，通无菌空气培养15～36小时；培养好的发酵液经平板细菌计数，活菌数达到2×109cfu/毫升以上。
4、液体微生物肥料的制备：向第3步培养好的发酵液中按重量比加入0.5％～2％的甘油和0.1％～0.5％的吐温80，混合均匀，可得液体微生物肥料，灌装，存放在阴凉干燥处。
5、固体微生物肥料的制备：将第1步得到的木薯酒精废水的沉淀物与秸秆或畜禽粪便按照碳氮比15～25:1混合均匀，制成固态培养基，调节水分含量60％～70％，按照重量比为2％的接种量，接种步骤3培养好的发酵液，好氧发酵10-15天，充分腐熟，得到有机肥；以充分腐熟的有机肥为载体，按照发酵液∶有机肥为1∶3～1∶10的重量比，将发酵液添加到有机肥中，充分混合均匀，通风干燥至含水量30％以下，即得到固体微生物肥料，包装，存放在阴凉干燥处。
本发明所述的枯草芽孢杆菌微生物肥料用于防治农业面源污染的使用方法如下：
1、将液体微生物肥料用水稀释到活菌数为5×106cfu/毫升～5×107cfu/毫升，混合均匀，按照每亩1～5立方米稀释液的用量沟施入作物根部附近的土壤中；同时减少常规施用化肥的量0～50％，可减少农田氮素流失20％～50％。
2、将固体微生物肥料按照每亩0.3～3吨的用量作为基肥施入土壤中，或在作物生长期内，追肥施用；同时减少常规施用化肥0～60％，可减少农田氮素流失30％～70％。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种资源化利用木薯酒精废水生产的微生物肥料及其在防治农业面源污染方面的应用。本发明利用木薯酒精废水作为发酵培养基，大规模快速培养枯草芽孢杆菌，制备促进植物生长、减少土壤中化肥流失的微生物肥料，该工艺生产成本低廉，操作简单，还可以使高浓度木薯酒精废水得到资源化利用，减少污染排放。本发明生产的微生物肥料用于蔬菜的生产，不仅可以提高产量和品质，而且可以改善土壤环境质量，从源头防治农业面源污染，显示出广阔的应用前景。该微生物肥料不仅具有拮抗植物病害、促进植物生长和改善作物品质的功能，还具有防治农业面源污染的功能。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明采用的菌株是从植物表面分离筛选出来的一株高效植物促生菌——枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)szx11菌株，该菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmccno.8188。
由本发明提供的枯草芽孢杆菌生防菌剂能有效防治多种土传植物病害，并能够促进作物对养分的吸收和利用，还能提供一定量的钾肥。本发明提供的技术方案生产的农用微生物菌剂应用于农业生产可以减少化肥和农药的使用量，从而改善农田环境质量，防治农业面源污染；而且生产成本很低，使高浓度废水得到资源化利用，减少污染物排放。具体实施方式如下：
实施例1木薯酒精废水生产枯草芽孢杆菌液体微生物肥料
木薯酒精废水预处理：用生物质热电厂的富含碳酸钾的草木灰调节废水的ph到7.8左右，于115℃灭菌15分钟。
液体种子制备：液体种子制备：向装有预处理好的木薯酒精废水的三角瓶中接种斜面保藏的枯草芽孢杆菌，于35℃，150转/分振荡培养24小时，得到液体种子。
液态发酵：向装有预处理好的木薯酒精废水发酵罐中接种体积比为5％的液体种子，于35℃，通无菌空气培养20小时；培养好的发酵液经平板细菌计数，活菌数达到2×109cfu/毫升以上。
液体微生物肥料的制备：向培养好的发酵液中按重量比加入1.5％的甘油和0.2％的吐温80，混合均匀，可得液体微生物肥料，灌装，存放在阴凉干燥处。
实施例2木薯酒精废水生产枯草芽孢杆菌固体微生物肥料
木薯酒精废水预处理：用生物质热电厂的富含碳酸钾的草木灰调节废水的ph到7.8左右，于115℃灭菌20分钟。
液体种子制备：液体种子制备：向装有预处理好的木薯酒精废水的三角瓶中接种斜面保藏的枯草芽孢杆菌，于37℃，150转/分振荡培养20小时，得到液体种子。
液态发酵：向装有预处理好的木薯酒精废水发酵罐中接种体积比为3％的液体种子，于37℃，通无菌空气培养18小时；培养好的发酵液经平板细菌计数，活菌数达到2×109cfu/毫升以上。
固体微生物肥料的制备：以充分腐熟的有机肥为载体，按照发酵液∶有机肥为1∶5的重量比，将发酵液添加到有机肥中，充分混合均匀，通风干燥至含水量30％以下，即得到固体微生物肥料，包装，存放在阴凉干燥处。
实施例3枯草芽孢杆菌微生物肥料用于防治农业面源污染
采用蔬菜大棚小区实验，设置8个条件完全相同的实验小区，每个小区60m2，2个小区为1组平行试验，共分成4组，种植小油菜，在小油菜幼苗期，第1组2个小区不施肥作对照；第2组2个小区各施用1×107cfu/克的枯草芽孢杆菌固体微生物肥料100公斤作为基肥，在油菜完全发芽3周后各追施一次1×107cfu/毫升的枯草芽孢杆菌液体微生物肥料的稀释液；第3组2个小区按照15公斤/亩的施肥量在油菜完全发芽后和3周后各施用尿素一次；第4组2个按照15公斤/亩的施肥量在油菜完全发芽后和3周后各施用尿素一次，并按照第2组方式施用微生物肥料，各小区相同的灌溉和管理方式。油菜生长5周后调查产量和品质，同时测定土壤中残留的氮素含量。
结果显示，单独施用微生物肥料(第2组实验)和单独施用尿素(第3组实验)的油菜产量基本一致，都比不施肥的对照小区(第1组实验)增产50％左右；两种肥料都施用(第4组实验)的比对照小区增产90％左右；油菜中硝酸盐和亚硝酸盐含量以不施肥和单独施用微生物菌剂的最低，均低于国家标准限量值的1/3，施用尿素后又施用微生物菌剂的也低于国家标准限量的1/2，而单独施用尿素的油菜中硝酸盐和亚硝酸盐含量都明显超标。第4组实验小区的土壤中，硝态氮、铵态氮和亚硝态氮的含量均显著低于第3组实验小区的土壤，表明施用微生物肥料，不仅能够提高油菜的产量和品质，而且有利于防控农田土壤氮素的流失，可以从源头防治农业面源污染。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。