本发明涉及一种来自烤鸡肉的荧光碳纳米粒子的制备方法。
背景技术：
现有技术中，荧光纳米粒子是指可以发荧光的纳米微晶体或比量子点更小的有机或无机纳米颗粒，近十年，随着纳米材料的迅速发展，荧光纳米粒子凭借其更强的发光性能、更高的稳定性，逐渐替代传统的荧光染料，广泛应用于生物科学领域，以荧光纳米材料作为荧光标记物进行生物分子的标记和细胞成像受到了广泛的关注，相关的研究使生物标记技术有了长足的发展和进步，其中纳米金、量子点、稀土纳米粒子等常见的纳米材料(如cdse)常含有毒性元素，会危害环境，影响细胞或生物大分子的活性，而碳纳米粒子作为荧光纳米材料家族中的一颗新星，具有化学稳定性、低毒性以及优异的生物相容性等独特的优点，可作为较为理想的细胞标记材料。
常用来制备碳纳米粒子的方法分为自上而下和自下而上两种方法，其中自上而下的方法是指大分子碳材料通过一定的物理、化学等方法破碎成小分子的碳纳米颗粒，包括：电解法、酸刻蚀、激光刻蚀和高温热解等方法；而自下而上的方法是指将小分子的碳材料通过一定的化学手段合成团聚成更大分子量的碳纳米颗粒，其中包括：化学合成法、水热法、溶剂热法等方法，人们日常食用烤制肉品的热加工过程会自然形成碳纳米粒子，无需通过上述复杂的合成步骤，采用天然的食品作为材料制备碳纳米粒子经济环保，可以同时解决废物处理与废物再利用问题，可以将人们日常食用的烤肉中被抛弃的部分重新利用，或者把鸡肉不能食用的边角料进行热加工制备碳纳米粒子，制得的产品价格低廉，鸡肉烤制品作为中国传统肉制品已经被人们食用上千年，以其为原料制备、提取的荧光碳纳米粒子毒副作用小，又具有良好的生物相容性，因此，在动物体内成像与活细胞成像等生物应用方面有着广阔的前景。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种来自烤鸡肉的荧光碳纳米粒子的制备方法。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：一种来自烤鸡肉的荧光碳纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
a、浸提，将烤制后的鸡肉放入装有无水乙醇的搅拌装置中浸提；
b、浓缩，将上一步中浸提后的鸡肉进行浓缩，去除不溶性杂质；
c、分离提纯，通过分离提纯收集强荧光组分，干燥得到荧光碳纳米粒子；
d、制备不同荧光的荧光碳纳米粒子，将荧光碳纳米粒子与盐酸多巴胺按质量比混合，溶解于蒸馏水中，用三羟甲基氨基甲烷调节至碱性，进行避光搅拌，加入有机溶剂停止反应，除去沉淀，挥发后收集液体干燥得到不同荧光的荧光碳纳米粒子。
所述步骤a中无水乙醇的加入量与加入烤鸡肉的液料比为10:1。
所述步骤b中浓缩采用旋转蒸发、冷冻干燥、真空干燥中的一种或二种以上的组合。
所述步骤c中分离提纯采用超滤、透析、超速离心、凝胶色谱、大孔树脂吸附中的一种或任意二种或两种以上的组合。
所述步骤c中的强荧光组分为烤鸡肉中存在的荧光碳纳米粒子。
所述步骤d中荧光碳纳米粒子与盐酸多巴胺质量比10:1-10:2，用三羟甲基氨基甲烷调节至碱性为ph=8.5，避光搅拌时间为36h。
所述步骤d中有机溶剂为异丙醇。
所述异丙醇的加入量与荧光碳纳米粒子溶液的体积比为5:1。
本发明一种来自烤鸡肉的荧光碳纳米粒子的制备方法，荧光碳纳米粒子以及与多巴胺通过类席夫碱反应后的颜色可调的荧光碳纳米粒子，可作为荧光染料在动物体内成像与活细胞成像及相关生物学方面进行应用；所需原料属于食品废弃物或边角料，价格低廉，对其再利用有助于对食品废弃物的处理，赋予其新的价值，荧光碳纳米粒子在烤鸡肉的加工过程中自然形成，无需额外进行合成，烤鸡肉荧光碳纳米粒子尺寸小，具有良好的荧光特性及生物相容性，烤鸡肉荧光碳纳米粒子安全性高，烤鸡肉荧光碳纳米粒子颜色可调，烤鸡肉荧光碳纳米粒子在动物脑内成像效果好，烤鸡肉荧光碳纳米粒子活细胞成像效果好。
附图说明
图1是本发明一种来自烤鸡肉的荧光碳纳米粒子的制备方法的烤鸡肉荧光碳纳米粒子的透射电子显微镜示意图。
图2是本发明一种来自烤鸡肉的荧光碳纳米粒子的制备方法的烤鸡肉荧光碳纳米粒子的粒径统计图。
图3是本发明一种来自烤鸡肉的荧光碳纳米粒子的制备方法的烤鸡肉荧光碳纳米粒子的xrd图谱。
图4是本发明一种来自烤鸡肉的荧光碳纳米粒子的制备方法的烤鸡肉荧光碳纳米粒子的紫外，荧光光谱图。
图5是本发明一种来自烤鸡肉的荧光碳纳米粒子的制备方法的烤鸡肉荧光碳纳米粒子的荧光寿命图谱。
图6是本发明一种来自烤鸡肉的荧光碳纳米粒子的制备方法的烤鸡肉荧光碳纳米粒子的ft-ir图谱。
图7是本发明一种来自烤鸡肉的荧光碳纳米粒子的制备方法的烤鸡肉荧光碳纳米粒子的xps图谱。
图8是本发明一种来自烤鸡肉的荧光碳纳米粒子的制备方法的烤鸡肉荧光碳纳米粒子的ph稳定性的图谱。
图9是本发明一种来自烤鸡肉的荧光碳纳米粒子的制备方法的烤鸡肉荧光碳纳米粒子的细胞毒性结果图谱。
图10是本发明一种来自烤鸡肉的荧光碳纳米粒子的制备方法的烤鸡肉荧光碳纳米粒子在动物脑内分布图。
图11是本发明一种来自烤鸡肉的荧光碳纳米粒子的制备方法的烤鸡肉荧光碳纳米粒子的细胞成像图。
具体实施方式
实施例一，来自烤鸡肉的荧光碳纳米粒子的制备方法，具体步骤为：将约100g的鸡肉在250oc条件下烤制30min，将烤制后的鸡肉放入搅拌器中加入500ml无水乙醇在室温下搅拌36h，通过抽滤，将固体舍弃后，液体在55oc条件下旋转蒸发乙醇溶液至5ml左右，将其溶于100ml蒸馏水中，加入300ml氯仿萃取，将水相依次通过0.45µm、0.22µm的水系滤膜，收集滤液，随后用大孔吸附树脂柱分离提纯，在365nm紫外灯照射下辅助观察，收集强荧光组分，接着用截留分子量0.5kda的膜对强荧光组分进行透析72h，通过冷冻干燥技术，得到荧光碳纳米粒子的固体粉末；将荧光碳纳米粒子与盐酸多巴胺以质量比10:1的比例混合，并溶解于去离子水中，用三羟甲基氨基甲烷调节ph至8.5，避光搅拌24小时，加入上述混合液5倍体积的异丙醇，高速离心(10000rpm，10min)除去沉淀，旋转蒸发除去异丙醇，冷冻干燥后得到颜色改变的荧光碳纳米粒子。
实施例二，烤鸡肉荧光碳纳米粒子性质的表征，s1、烤鸡肉荧光碳纳米粒子的形态及大小尺寸，图1和图2是烤鸡肉荧光碳纳米粒子的透射电子显微镜照片及粒径统计图，结果显示，经过分离提纯的烤鸡肉荧光碳纳米粒子大小均匀，形态规则成近球型，统计得到烤鸡肉荧光碳纳米粒子粒径尺寸集中在1-4nm；s2、烤鸡肉荧光碳纳米粒子的x射线光电子衍射(xrd)实验，图3是烤鸡肉荧光碳纳米粒子的xrd图谱，可见2theta=22.68o处仅有一馒头峰，根据xrd图谱，说明该荧光碳纳米粒子不存在晶格属于无定形的结构；s3、烤鸡肉荧光碳纳米粒子的紫外光谱和荧光光谱特征，图4是烤鸡肉荧光碳纳米粒子的紫外光谱和荧光光谱，由紫外光谱图可见在250nm处出现了n→π*跃迁的特征吸收峰，由纳米粒子的荧光光谱可见随着波长增加出现了明显的红移现象，烤鸡肉荧光碳纳米粒子的最大激发波长出现在370nm处，在370nm激发下使用硫酸奎宁法测得烤鸡肉纳米粒子的荧光量子产率为12.85%；s4、烤鸡肉荧光碳纳米粒子的荧光寿命，图5是烤鸡肉荧光碳纳米粒子的荧光寿命图谱，配置1mg/ml的烤鸡肉荧光碳纳米粒子水溶液，在370nm的激发光下激发，最大发射峰为450nm发射，测得荧光寿命，经实验中发现烤鸡肉荧光碳纳米粒子是双指数猝灭，经拟合计算烤鸡肉荧光碳纳米粒子的荧光寿命是7.37ns；s5、烤鸡肉荧光碳纳米粒子的傅立叶变换红外光谱表征，图6是烤鸡肉荧光碳纳米粒子的红外图谱，图中结果表明经过纯化后的烤鸡肉荧光碳纳米粒子在3299cm-1含有o-h的伸缩振动峰，2966cm-1和2927cm-1处有2种c-h的伸缩振动峰，1668cm-1有c=o的伸缩振动峰，1451cm-1有c-n的变形振动峰，1121cm-1有c-o的伸缩振动峰；s6、烤鸡肉荧光碳纳米粒子的x射线光电子能谱(xps)的表征，图7是烤鸡肉荧光碳纳米粒子xps的图谱，图中结果表明啤酒碳点中主要含有c和o两种元素并且含有少量的n元素；s7、烤鸡肉荧光碳纳米粒子的ph稳定性实验，图8是烤鸡肉荧光碳纳米粒子的ph的稳定图，配置不同ph(2—11)的b-r缓冲溶液，取荧光碳纳米粒子溶液分别加入不同的ph溶液中(1mg/ml)，用荧光分光光度计测荧光强度，取三次平均值，图中可以看出烤鸡肉荧光碳纳米粒子在酸性条件下荧光较稳定，在ph＝4处荧光强度最高，其荧光强度在碱性条件下较酸性条件更低。
实施例三，细胞毒性实验，选用hepg2细胞和含有10%的胎牛血清的高糖dmem培养基，添加抗生素和非必需氨基酸，将mcf-7细胞以10000个/孔接种于96孔板中，待贴壁完全后(12h)，弃去原培养基，将烤鸡肉荧光碳纳米粒子以培养基溶解后，再以培养基稀释成不同浓度，并加入到上述96孔板中，孵育48h后，以mtt法测定增值率，如图9所示，烤鸡肉荧光碳纳米粒子在较大浓度下(4mg/ml)，hepg2细胞存活率仍能达到60％以上，说明烤鸡肉荧光碳纳米粒子毒性较低。
实施例四，动物脑部分布实验，选用健康雄性3-5周龄balb/c小鼠，随机分为3组将其在超净空气层流架上适应性饲养2周，正常供应食物与水，实验前断粮24h，然后用烤鸡肉荧光碳纳米粒子灌胃小鼠，剂量为2g/kg，对照组b小鼠灌胃生理盐水，口服给药2小时、6小时、20小时后将小鼠处死，并收集其脑组织，使用xfp-bix-miis小动物成像检测，如图10中a组所示，烤鸡肉荧光碳纳米粒子可以进入小鼠的脑内，在365nm激发下发出明显的蓝光荧光信号，由此说明烤鸡肉荧光碳纳米粒子可以作为良好的荧光染料应用于动物体内成像。
实施例五，烤鸡肉荧光碳纳米粒子的细胞成像实验，hepg2细胞经胰酶消化后形成单细胞悬液，以1×105cells/ml的密度接种于培养皿中，向培养基中加入2ml浓度为5mg/ml的烤鸡肉荧光碳纳米粒子，在37oc，5％的co2条件下孵育24h，随后倾去培养基，并用磷酸盐缓冲液洗脱2次，将培养皿置于激光共聚焦显微镜下，在405nm波段下激发，观察荧光碳纳米粒子的细胞标记情况，如图11所示，与对照组相比，经烤鸡肉荧光碳纳米粒子标记的细胞都能发出明显的荧光，在405nm波段激发下发出明显的蓝光，由此说明烤鸡肉荧光碳纳米粒子可以作为良好的荧光染料应用于细胞荧光成像。