专利名称：：抗－cd33抗体和使用其治疗急性髓性白血病的方法
技术领域：
：本发明涉及结合CD33的抗体。更特别地是，本发明涉及抗CD33抗体，所述抗体的片段和同源物，所述抗体的人源化和表面重整(resurfaced)形式，抗体的功能等价物和改良形式，含有所述抗体的免疫偶联物(immunoconjugate)和组合物，以及其在诊断、研究和治疗中的应用。在另一个方面，本发明涉及编码该抗体的多核苷酸，含有该多核苷酸的载体，用多核苷酸转化的宿主细胞和产生该抗体的方法。
背景技术：
：白细胞分化抗原(leukocytedifferentiationantigen)CD33是一个具有364个氨基酸的跨膜糖蛋白，其与唾液酸粘附素家族的成员具有序列同源性，包括髓鞘相关糖蛋白和CD22，以及唾液酸粘附素本身(S.Peiper，2002，LeucocyteTypingVII，WhiteCellDifferentiation，Antigens，ProceedingsoftheSeventhInternationalWorkshopandConference，OxfordUniversityPress，p.777)。CD33的表达似乎对造血区室(hematopoieticcompartment)有高度的特异性，由骨髓前体细胞进行强表达(S.Peiper，2002)。它可被下列细胞表达，骨髓祖细胞(myeloidprogenitorcells)，如CFU-GEMM、CFU-GM、CFU-G和BFU-E，单核细胞/巨噬细胞，粒细胞前体如前髓细胞和髓细胞细胞，尽管在成熟和分化过程中表达降低，以及可被成熟的粒细胞表达，尽管其表达水平低(S.Peiper，2002)。相反，在体外产生“胚细胞集落(blastcolonies)”(Leary，A.G.etal.，1987，Blood69953)、并诱导造血骨髓长期培养(AndrewsR.G.etal.，1989，J.Exp.Med.1691721；Sutherland，H.J.等人，1989，Blood741563)的多能造血干细胞似乎缺乏CD33的表达。尽管CD33的特殊功能还不清楚，但其与唾液酸粘附素的同源性提示其在凝集素家族的碳水化合物结合特性中的作用，这种作用随后被证实(S.Peiper，2002)。重要的是，抗-CD33单克隆抗体已经显示CD33可在超过80％的人类病例的克隆发生性，急性骨髓性白血病(AML)细胞上表达(LaRussa，V.F.etal.，1992，Exp.Hematol.20442-448)。由于CD33的选择性表达，结合细胞毒类药物的免疫偶联物，能特异识别和结合CD33的单克隆抗体，已经被建议用于选择性靶向AML细胞。这种治疗法期望可使干细胞和原始的造血祖细胞不受影响。使用抗CD33抗体的免疫偶联物，包括抗-CD33-蓖麻毒素免疫偶联物，其已经显示对AML细胞是高度致死性的(Roy，D.C.etal.，1991，Blood772404；Lambert，J.M.etal.，1991，Biochemistry303234)，然而却不伤害支持正常的造血作用和造血系统重建的干细胞(LaRussa，V.F.etal.，1992，Exp.Hemato.20442-448)。使用免疫偶联物的其他研究显示当静脉给药时，放射性标记的抗CD33抗体可迅速靶向外周血和骨髓中的白血病母细胞(Scheinberg，D.A.etal.，1991，J.Clin.Oncol.9478-490；Schwartz，M.A.etal.，1993，J.Clin.Oncol.11294-303)。在体外研究中也观察到靶细胞对抗体的迅速内化(Tanimot，M.etal.，1989，Leukemia3339-348；Divgi，C.R.etal.，1989，CancerRes.Suppl.Vol.30404a)。在临床前研究中，对与强力抗肿瘤抗生素卡奇霉素(卡奇霉素吉妥组单抗(Gemtuzumabozogamicin))偶联的人源化抗-CD33抗体的评价表明了对HL-60细胞培养物、小鼠HL-60肿瘤异种移植物和AML患者的骨髓样品中的白血病细胞的特异性杀伤作用(Hamann，P.R.etal.，2002，BioconjugateChem.1347-58)。基于这些临床前研究的阳性结果，卡奇霉素吉妥组单抗在I期和II期临床研究中被进行评价。在临床I期研究中，观察到的主要毒性是骨髓抑制(myelosuppression)，其原因是骨髓祖细胞上CD33的表达(Sievers，E.L.etal.，1999，Blood933678-3684；SieversE.L.etal.，2001，J.Clin.Oncol.193244-3254)。在II期临床研究中，静脉给药剂量为9mg/m2，超过4小时，14天后重复，产生的响应率为30％。FDA于2000年5月批准了卡奇霉素吉妥组单抗的市场准入，适应征是治疗首次复发的CD33阳性AML患者，年龄在60岁或60岁以上并被认为不能进行细胞毒性化疗的候选人。进入市场后的研究报告表明其可能具有显著的毒性，特别是静脉闭塞性疾病(VOD)，这已经导致标签修正，并启动患者监控程序。大多数这种毒性涉及药物组分卡奇霉素，其显示可在临床前模型中引起肝毒性，因此不是靶向CD33的直接结果。尽管上述讨论的结果表明含有抗CD33抗体和细胞毒类药物的免疫偶联物可成功地用于治疗AML，但仍需要既安全又有效的免疫偶联物。本发明就是涉及这些和其他重要的目标。发明概述[13]因此，本发明的一个目标是提供可特异性结合CD33和可用于治疗AML的抗体。因此，在第一种实施方案中，提供了抗体或其抗原决定簇结合片段(epitope-bindingfragment)，它们具有结合CD33的能力。在第二种实施方案中，提供了鼠抗体My9-6，就它的轻链和重链可变区的氨基酸序列，针对该轻链和重链可变区的基因的cDNA序列，它的CDRs(互补决定区)的鉴定，它的表面氨基酸的鉴定，以及它的以重组形式的表达手段在本文已充分描述。在第三种实施方案中，提供了My9-6抗体的人源化或表面重整版本。其中My9-6抗体或其抗原决定簇结合片段的表面暴露残基(surface-exposedresidues)在轻链和重链中都被替换，以与已知的人抗体表面更相似。这种人源化抗体与鼠My9-6相比，作为治疗性或诊断性试剂，其效用增加。鼠抗体My9-6的人源化版本在本文中从以下方面进行了详尽描述它们各自的轻链和重链可变区的氨基酸序列，轻链和重链可变区基因的cDNA序列，CDRs(互补决定区)的鉴定，表面氨基酸的鉴定，以及以重组形式表达的方法的公开。在进一步的实施方案中，提供了包括至少一个互补决定区的抗体或其抗原决定簇结合片段，其中互补决定区具有选自SEQIDNO1-6中的氨基酸序列SYYIH(SEQIDNO1)，VIYPGNDDISYNQKFXG(SEQIDNO2)，其中X是K或Q，EVRLRYFDV(SEQIDNO3)，KSSQSVFFSSSQKNYLA(SEQIDNO4)，WASTRES(SEQIDNO5)，HQYLSSRT(SEQIDNO6)，并具有与CD33结合的能力。在进一步的实施方案中，提供了包括至少一个重链可变区和至少一个轻链可变区的抗体或其抗原决定簇结合片段，其中所述重链可变区含有三个互补决定区，其分别具有由SEQIDNO1-3表示的氨基酸序列，SYYIH(SEQIDNO1)，VIYPGNDDISYNQKFXG(SEQIDNO2)，其中X是K或Q，EVRLRYFDV(SEQIDNO3)，和其中所述轻链可变区含有三个互补决定区，其分别具有由SEQIDNO4-6表示的氨基酸序列，KSSQSVFFSSSQKNYLA(SEQIDNO4)，WASTRES(SEQIDNO5)，HQYLSSRT(SEQIDNO6)。在进一步的实施方案中，提供了具有一个重链可变区的抗体，其中该重链可变区的氨基酸序列与SEQIDNO7所表示的氨基酸序列QVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFKGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGAGTTVTVSS具有至少90％的序列同一性，更优选与SEQIDNO7具有95％的序列同一性，最优选与SEQIDNO7具有100％的序列同一性。类似地，提供了含有一个轻链可变区的抗体，其中该轻链可变区的氨基酸序列与SEQIDNO8所表示的氨基酸序列NIMLTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQSEDLAIYYCHQYLSSRTFGGGTKLEIKR具有至少90％的序列同一性，更优选与SEQIDNO8具有95％的序列同一性，最优选与SEQIDNO8具有100％的序列同一性。在进一步的实施方案中，提供了具有人源化或表面重整的重链可变区的抗体，其中该人源化或表面重整的重链可变区与SEQIDNO9所表示的氨基酸序列QVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFQGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGQGTTVTVSS具有至少90％的序列同一性，更优选与SEQIDNO9具有95％的序列同一性，最优选与SEQIDNO9具有100％的序列同一性。类似地，提供了具有一个人源化或表面重整的轻链可变区的抗体，该人源化或表面重整的轻链可变区与对应于SEQIDNO10的氨基酸序列EIVLTQSPGSLAVSPGERVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPRLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQPEDLAIYYCHQYLSSRTFGQGTKLEIKR，具有至少90％的序列同一性，更优选与SEQIDNO10具有95％的序列同一性，最优选与SEQIDNO10具有100％的序列同一性。在进一步的实施方案中，本发明提供了免疫偶联物，该免疫偶联物含有与本发明的抗体或其抗原决定簇结合片段共价连接的药物或前体药物，直接或通过可切割或非切割性连接子共价连接。在优选的实施方案中，药物或前体药物是细胞毒性药物或前体药物，如美登木素生物碱(maytansinoid)、紫杉醇(taxoid)、CC-1065、CC-1065类似物，海兔毒肽和海兔毒肽类似物。在进一步的实施方案中，本发明提供了一种组合物，包括本发明的抗体或其抗原决定簇结合片段和药物或前体药物的。在进一步的实施方案中，本发明包括药物组合物，该药物组合物包括本发明的抗体、其抗原决定簇结合片段或免疫偶联物，或者单独，或者与药物或前体药物或其他治疗剂组合，在存在一种或多种药学上可接受试剂的情况下。在进一步的实施方案中，本发明提供了抗体或其抗原决定簇结合片段，被标记用于研究或诊断应用中。在优选的实施方案中，标记是生物素标记，酶标记，放射性标记，荧光基团，发色基团，显像剂或金属离子。在进一步的实施方案中，本发明提供了用于抑制表达CD33的细胞的生长的方法，该方法通过使用本发明的抗体、其抗原决定簇结合片段或免疫偶联物，或者单独，或者与药物或前体药物或其他治疗剂组合，进一步地，单独或在存在一种或多种药学上可接受试剂的情况下。在进一步的实施方案中，本发明提供了治疗患有表达CD33的疾病的患者的方法，包括给予本发明的抗体、其抗原决定簇结合片段或免疫偶联物，或者单独或者与药物或前体药物或其他治疗剂组合，进一步地，单独或在存在一种或多种药学上可接受试剂的情况下。所述疾病可以是一种或多种，例如骨髓增生异常综合征(MDS)、急性髓性白血病(AML)、慢性髓性白血病(CML)和前髓细胞性白血病(PML)，或其他被确定其中表达CD33的疾病。治疗方法，包括体内、离体和体外应用本发明的抗体、抗体片段和免疫偶联物，或者单独使用或者与药物或前体药物或其他治疗药剂组合使用，进一步地，单独地或在存在一种或多种药学上可接受试剂的情况下使用。在进一步的实施方案中，提供了确定生物学样品中是否含有骨髓性癌细胞的方法，其中，生物学样品与诊断试剂，如标记的本发明的抗体或其抗原决定簇结合片段相接触，并检测该试剂在样品中的分布。这种方法可用来诊断如急性髓性白血病(AML)、慢性髓性白血病(CML)和前髓细胞性白血病(PML)。在进一步的实施方案中，提供了具有改良特性的本发明的抗体或抗原决定簇结合片段。例如，可通过采用动物免疫、杂交瘤形成和选择具有特殊特性的抗体的标准技术，来制备与CD33亲和性提高的抗体或抗原决定簇结合片段。改良的抗体也可通过本发明的抗体或其抗原决定簇结合片段的亲合力成熟来制备，例如通过使用寡核苷酸介导的定点诱变、盒式诱变、易错PCR，DNA改组和应用大肠杆菌增变菌。在进一步的实施方案中，本发明提供了编码本发明抗体或其抗原决定簇结合片段的多核苷酸，包含该多核苷酸的重组载体，用该重组载体转化的宿主细胞，和通过培养所述宿主细胞产生所述抗体和其抗原决定簇结合片段的方法。在最后一种实施方案中，本发明提供了一种通过使用本发明抗体或其抗原决定簇结合片段从生物学材料中获得CD33的方法。图1显示了竞争结合试验的结果，其中，在存在浓度不断增加的My9抗体或My9-6抗体下，测定了125I-标记的My9-6抗体(3×10-9M)与CD33阳性U-937细胞的结合作用。图2显示了用于轻链信号序列的My9-6简并引物。图3显示了来自Brookhaven数据库的127个抗体结构的文件名，其可被用来预测muMy9-6可变区的表面。图4显示了用来构建该16个表面重整My9-6版本以及嵌合My9-6抗体的PCR引物。图5显示了用来构建和表达人源化抗体的质粒。(A)轻链克隆质粒。(B)重链克隆质粒。(C)哺乳动物抗体表达质粒。图6A显示了muMy9-6轻链的Edman测序结果，与由RT-PCR产生的cDNA克隆所得的的氨基酸序列进行比较。图6B显示了1319Da和1122Da肽片段的MS-MS序列分析结果，其中所述1319Da和1122Da肽片段分别含有CDR1和CFR2序列的。CDR序列以粗体表示。图7显示了1788Da肽和来自两个cDNA克隆的相应序列的MS-MS序列分析结果。图8A显示了鼠My9-6抗体的cDNA序列和推算的轻链可变区的氨基酸序列。三个CDR用下划线表示。图8B显示了鼠My9-6抗体的cDNA序列和推算的重链可变区的氨基酸序列。三个CDR用下划线表示。图9显示了由Kabat定义所确定的轻链和重链CDR。图10显示了鼠My9-6抗体的轻链和重链氨基酸序列，与8-27和V102基因的胚系序列进行比对。点(.)表示序列同一性。图11A&B显示了与muMy9-6序列最同源的10个轻链(A)和重链(B)抗体序列，在Brookhaven数据库中有解答文件(solvedfile)。序列以同源性从最大至最小的顺序进行排列。图12A&B显示了muMy9-6抗体轻链(A)和重链(B)的每个Kabat位点的平均可及性(accessibility)。10个最同源的轻链和重链序列的每个Kabat位点的相对溶剂可及性(solventaccessibilities)被平均，并沿x轴显示。图13A显示了10个最同源的轻链结构的残基溶剂可及性，用MC软件计算，并显示了每个Kabat位点的平均值，用Excel制表。本表显示了平均溶剂可及性超过25％的非CDR位点的数据。表面残基被规定为具有超过30％平均溶剂可及性的残基。进一步分析具有25％-35％平均可及性的位点，是可通过计算仅在该位点以及其两侧侧向位点具有相同残基的结构的平均可及性而进行。NA是指没有相同的侧向位点。位点15和70需要进一步的计算，以获得在最后一列中给定的最终的表面预测值。图13B显示了10个最同源的重链结构的残基溶剂可及性，用MC软件计算，并显示了每个Kabat位点的平均值，用Excel制表。本表显示了平均溶剂可及性超过25％的非CDR位点的数据。表面残基被规定为具有超过30％平均溶剂可及性的残基。进一步分析具有25％-35％平均可及性的位点，是通过计算仅在该位点以及其两侧侧向位点具有相同残基的结构的平均可及性而进行。NA是指没有相同的侧向位点。图14显示了My9-6框架表面残基(frameworksurfaceresidues)，其落在CDR残基5之内。图15显示了从Kabat数据库中获取的前5个人抗体序列。通过SR生成对比(Pedersen，1993)。进入CDR的5范围内的muMy9-6残基用下划线表示。图16A&B显示了16个人源化My9-6轻链可变区序列(A)和16个人源化My9-6重链可变区序列(B)，是与鼠My9-6比对的。点(.)表示相对于人源化版本1.0的序列同一性。在鼠和人My9-6之间有差异的表面残基，用下划线标出。图17显示了My9-6KD值，是通过在HL-60膜和HL-60全细胞上的直接结合测定(directbindingassay)、以及在HL-60膜上的竞争结合测定计算得到。除了*处N＝2以外，N＝3。图18显示了huMy9-6V1.0的结合曲线。(A)在HL-60膜上的直接结合。(B)在HL-60全细胞上的直接结合。(C)在HL-60膜上的竞争结合。图19显示了My9-6-DM1与My9-6抗体结合的比较，在HL-60细胞上进行。图20显示了My9-6-DM1对于表达CD33的人肿瘤细胞的体外细胞毒性。图21显示了My9-6-DM1在携带HL-60异种移植物的SCID小鼠中的效能试验结果。My9-6-DM1(A)和未修饰My9-6抗体(C)对HL-60肿瘤生长的作用被评价。小鼠的体重作为毒性的指征(indication)被监测(B，D)。图22显示了My9-6-DM1与游离药物美登素在携带HL-60异种移植物的SCID小鼠中的效能比较(A)。小鼠的体重作为毒性的一个指征被监测(B)。在两个被治疗小鼠中复发的肿瘤用第二个疗程的My9-6-DM1治疗。图23A&B显示了My9-6-DM1和标准化疗在携带HL-60异种移植物的SCID小鼠中的抗肿瘤效能比较(A)。小鼠的体重作为毒性的一个指征被监测(B)。在两个被治疗的小鼠中的复发肿瘤用第二个疗程的My9-6-DM1治疗。图24A&B显示了My9-6-DM1与卡奇霉素吉妥组单抗和标准化疗在HL-60生存模型(survivalmodel)中的抗肿瘤功效的比较。HL-60细胞被静脉注射进SCID小鼠中。指示治疗在注射细胞之后11天开始。除了卡奇霉素吉妥组单抗(Q4D×3)以外，治疗为静脉注射每天×5。发明详述[62]本发明提供了新型鼠抗-CD33抗体和该抗体的人源化版本。进一步提供的是含有一种或多种鼠抗CD33抗体或其人源化版本的CDR的抗体，其特异地识别和结合CD33。鼠My9-6抗体[64]本发明的鼠抗-CD33抗体(murineanti-CD33antibody)，在本文中有许多名称，称为“My9-6”，“鼠My9-6(murineMy9-6)”和“muMy9-6”，就其轻链和重链可变区的推断的胚系氨基酸序列(germlineaminoacidsequence)(图10)，轻链和重链可变区的氨基酸序列(图8A&B)，CDR的鉴定(图9)，表面氨基酸的鉴定(图13A&B)和其以重组版本表达的方法而言，已被充分描述。My9-6抗体的功能已经进一步被描述，显示与存在于CD33阳性U-937细胞的表面上的CD33具有很高的结合亲和性(图1)。125I-标记的My9-6结合U-937细胞，它可被未标记的My9-6和以前描述的抗CD33抗体My9从细胞上竞争下来(BioGenex，cat.no.267M)。术语“可变区(variableregion)”在此用来描述抗体重链和轻链的某些部分，它们在抗体之间序列不同，且协同决定每个特定抗体对其抗原的结合和特异性。可变性并不经常均匀地分布在抗体可变区。其通常集中在称为互补性决定区(CDR)或超变区的可变区的三个片段内，均在轻链和重链可变区内。可变区的更高度保守部分称为框架区。重链和轻链的可变区包括四个框架区，主要采用β-片层构型，每个框架区连接三个CDR，形成与β-片层结构连接的环，在一些情况下形成β-片层结构的一部分。每条链中的CDR被框架区固定紧靠其他链的CDR，这样形成了抗体的抗原结合位点(E.A.Kabatetal.，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第五版，1991，NIH)。“恒定(constantregion)区”不直接参与抗体与抗原的结合，但显示多种效应子功能，如抗体参与的抗体依赖性细胞毒性。人源化My9-6抗体My9-6的人源化版本(HumanizedversionsofMy9-6)，在本文中有不同名称“huMy9-6”，和“人源化My9-6”，也已制备得到。人源化的目标是减少异种抗体如鼠抗体的免疫原性，用于导入进人体内后，在保持抗体的全部抗原结合亲和性和特异性的同时减少免疫原性。人源化抗体可采用若干技术来产生，如表面重整(resurfacing)和CDR嫁接(CDRgrafting)技术。如在此所使用的，表面重整技术综合使用分子建模，统计学分析和诱变，以便改变抗体可变区的非CDR表面，从而模拟目标宿主的已知抗体的表面。抗体的表面重整的策略和方法，和在不同的宿主中减少抗体免疫原性的其他方法，公开在美国专利5,639,641(Pedersen等人)中，在此整体引入，作为参考。简言之，在一个优选方法中，(1)生成许多抗体重链和轻链可变区的位点对比，得到一组重链和轻链可变区框架表面暴露位点，其中所有可变区的对比位点至少大约98％是相同的；(2)针对啮齿类抗体(或其片段)确定一组重链和轻链可变区框架表面暴露的氨基酸残基；(3)鉴定与该组啮齿类表面暴露氨基酸残基最相似的一组重链和轻链可变区框架表面暴露氨基酸残基；(4)步骤(2)中确定的该组重链和轻链可变区框架表面暴露氨基酸残基被步骤(3)中鉴定的该组重链和轻链可变区框架表面暴露氨基酸残基替代，除了那些位于该啮齿类抗体的互补决定区的任何残基的任何原子的5范围内的氨基酸残基；和(5)产生具有结合特异性的人源化啮齿类抗体。可以使用多种其他的技术对抗体进行人源化，包括CDR嫁接(EP0239400；WO91/09967；美国专利5,530,101；和5,585,089)，镶饰(veneering)或表面重整(EP0592106；EP0519596；PadlanE.A.，1991，MolecularImmnunology28(4/5)489-498；StudnickaG.M.etal.，1994，ProteinEngineering7(6)805-814；RoguskaM.A.etal.，1994，PNAS91969-973)，和链改组(chainshuffling)(美国专利No.5,565,332)。人抗体可通过本领域中已知的多种方法来制备，包括噬菌体展示法。也参见美国专利No.4,444,887；4,716,111；5,545,806和5,814,318；和国际专利申请公开号WO98/46645、WO98/50433、WO98/24893、WO98/16654、WO96/34096、WO96/33735和WO91/10741(所述文献整体参考并入，作为参考)。如本文中进一步描述地，通过建模鉴定My9-6的CDR，并预测它的分子结构。然后制备人源化My9-6抗体，其序列已经被完全表征。许多huMy9-6抗体的轻链和重链的氨基酸序列，被显示在图16A和16B中。鼠和人源化My9-6抗体的比较结合值，被提供在图17中。抗体的结合曲线显示在图18中。My9-6抗体的抗原决定簇结合片段[76]尽管鼠My9-6抗体和人源化My9-6抗体的抗原决定簇结合片段在此与鼠My9-6抗体和人源化版本分别进行讨论，但要理解的是本发明的术语“抗体(antibody)”或“多种抗体(antibodies)”可包含全长的muMy9-6和huMy9-6抗体，以及这些抗体的抗原决定簇结合片段。如本文中所使用的，“抗体片段”包括保留了与CD33结合的能力的抗体的任何部分，通常称为“抗原决定簇结合片段”。抗体片段的实例优选包括但不限于，Fab、Fab′和F(ab′)2、Fd、单链Fvs(scFv)、单链抗体，二硫键连接的Fv(sdFv)和含有VL或VH结构域的片段。抗原决定簇结合片段，包括单链抗体，可单独包含可变区或组合了下列的一部分或全部铰链区、CH1、CH2、和CH3结构域。这种片段可含有一个或两个Fab片段或F(ab′)2片段。优选地，抗体片段含有整个抗体的所有6个CDR，尽管含有少于所有这些区域的片段，如三个，四个或5个CDR，也是有功能的。更进一步，功能等价物可能是下列任何一种免疫球蛋白类型的成员或它们的组合IgG、IgM、IgA、IgD、或IgE，及其亚型。Fab和F(ab′)2片段可通过使用酶进行蛋白水解裂解而产生，使用的酶如木瓜蛋白酶(Fab片段)或胃蛋白酶(F(ab′)2片段)。单链FV(scFv)片段是抗原决定簇结合片段，其含有与抗体轻链可变区(VL)的至少一个片段连接的抗体重链可变区(VH)的至少一个片段。连接子可以选择短的，柔性的肽，以保证(VL)和(VH)区域一旦连接就形成合适的三维折叠，以维持全抗体的靶分子结合特异性，而单链抗体片段来源于该全抗体。(VL)或(VH)序列的羧基末端可通过连接子共价连接于互补的(VL)和(VH)序列的氨基酸末端。单链抗体片段可通过分子克隆，抗体噬菌体展示文库或专业技术人员熟知的类似技术来产生。这些蛋白可在例如真核细胞或原核细胞，包括细菌中产生。本发明的抗原决定簇结合片段也可使用本领域中已知的多种噬菌体展示法来产生。在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构区被展示在携带编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面上。特别的是，这种噬菌体可用来展示从抗体谱(repertoire)或组合抗体文库(例如，人或鼠)表达的抗原决定簇结合结构区。表达可结合目的抗原的抗原决定簇结合结构域的噬菌体可用抗原选择或鉴定，例如使用标记的CD33或被结合或俘获到固体表面或珠上的CD33。用于这些方法中的噬菌体通常的是丝状噬菌体，包括fd和M13，结合结构域由具有重组融合到噬菌体基因III或基因VIII蛋白的Fab、Fv或二硫键固定的Fv抗体结构域的噬菌体表达。可用来制备本发明的抗原决定簇结合片段的噬菌体展示方法的实例包括在下列文献中公开的方法Brinkmanetal.，1995，J.Immunol.Methods18241-50；Amesetal.，1995，J.Immunol.Methods184177-186；Kettleboroughetal.，1994，Eur.J.Immunol.24952-958；Persicetal.，1997，Gene1879-18；Burtonetal.，1994，AdvancesinImmunology57191-280；PCT申请No.PCT/GB91/01134；PCT公布WO90/02809；WO91/10737；WO92/01047；WO92/18619；WO93/11236；WO95/15982；WO95/20401；和美国专利No.5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108，每一篇文献整体引入本文，作为参考。噬菌体筛选后，编码片段的噬菌体的区域可被分离，并通过使用重组DNA技术，例如在下面所详述的，在被选择的宿主中表达来产生抗原决定簇结合片段，宿主包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌，。例如，重组产生Fab、Fab′和F(ab′)2片段的技术也可应用，使用本领域已知的方法，如在PCT公布WO92/22324；Mullinaxetal.，1992，BioTechniques12(6)864-869；Sawaietal.，1995，AJRI3426-34；和Betteretal.，1988，Science2401041-1043中所公开的方法；所述文献整体引入本文，作为参考。用来产生单链Fv和抗体的技术的例子包括那些在美国专利No.4,946,778和5,258,498；Hustonetal.，1991，MethodsinEnzymology20346-88；Shuetal.，1993，PNAS907995-7999；Skerraetal.，1988，Science2401038-1040中所描述的。功能等价物(functionalequivalents)[85]也包括在本发明范围内的是My9-6抗体和人源化My9-6抗体的功能等价物(functionalequivalent)。术语“功能等价物”包括具有同源序列的抗体，嵌合的抗体，修饰抗体和人工抗体，例如，其中规定了每个功能等价物具有结合CD33的能力。专业技术人员将会理解在称为“抗体片段(antibodyfragments)”的一组分子和称为“功能等价物”的一组分子中是有重叠的。具有同源序列的抗体是具有与本发明的鼠My9-6和人源化My9-6抗体的氨基酸序列具有序列同一性或同源性的氨基酸序列的抗体。优选与本发明的鼠My9-6和人源化My9-6抗体的可变区氨基酸序列具有同一性。“序列同一性(sequenceidentity)”和“序列同源性(sequencehomology)”当用于本文的氨基酸序列时，被规定为与另一条氨基酸序列具有至少大约90％、91％、92％、93％或94％的序列同一性，更优选至少大约95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列，同一性例如根据PearsonandLipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85，2444-2448(1988)通过FASTA搜索法测定。如本文中所使用的，嵌合抗体是其中抗体的不同部分来自不同动物种的抗体。例如，含有来自鼠单克隆抗体的可变区的抗体与人免疫球蛋白恒定区配对。产生嵌合抗体的方法在本领域中是已知的。见，例如，Morrison，1985，Science2291202；Oietal.，1986，BioTechniques4214；Gilliesetal.，1989，J.Immunol.Methods125191-202；美国专利No.5,807,715；4,816,567；和4,816,397，在此整体引入本文，作为参考。人工抗体包括scFv片段、双链抗体、三链抗体、四链抗体和mru(见Winter，G.andMilstein，C.，1991，Nature349293-299；Hudson，P.J.，1999，CurrentOpinioninImmunology11548-557的综述)，每种都具有抗原结合能力。在单链Fv片段(scFv)中，抗体的VH和VL结构区被一个可变形肽连接。一般这种连接子肽大约15个氨基酸残基长。如果该连接子更小，例如，5个氨基酸，可形成双链抗体，其是二价scFv二聚体。如果连接子减少到少于3个氨基酸残基，可形成三聚和四聚体结构，称为三链抗体和四链抗体。抗体的最小结合单位是CDR，一般是具有足够特异性识别和结合能力的重链CDR2，其可单独使用。这样一个片段被称为分子识别单位或mru。几个这种mru可用短的连接肽连接在一起，因而形成了具有较单个mru更高亲和力的人工结合蛋白。本申请的功能等价物也包括修饰抗体，例如通过任何类型的分子共价附着于抗体上而对抗体进行修饰的抗体。例如，修饰的抗体包括已经被下述方法修饰的抗体例如被糖基化，乙酰化，聚乙二醇化(pegylation)，磷酸化，酰胺化，通过已知的保护/封闭基团衍生作用，蛋白水解裂解，与细胞配体或其他蛋白连接，等等。共价附着不会阻止抗体产生抗独特型(anti-idiotypic)应答。这些修饰作用可通过已知的技术来完成，包括但不限于，特异化学性裂解，乙酰化，甲酰化，衣霉素的代谢合成，等等。另外，被修饰的抗体可含有1个或更多个非典型氨基酸(non-classicalaminoacids)。通过在不同的框架内、不同的链上互相交换不同的CDR产生功能等同物。因此，例如，对于指定组的CDR可通过取代不同的重链可能形成不同类型的抗体，由此，例如IgG1-4、IgM、IgA1-2、IgD、IgE抗体类型和同型抗体可被产生。同样，在本发明范围内的人工抗体可通过将给定的一组CDR嵌入进整个合成框架区中而产生。功能等价物很容易在特定组CDR侧向的可变区和/或恒定区序列内使用本领域中已知的多种方法通过突变，删除和/或插入来产生。本发明的抗体片段和功能等价物包括与鼠My9-6抗体相比，与CD33的结合达到可检测程度的分子。结合的可检测程度包括鼠My9-6抗体与CD33结合能力的至少10-100％范围内的所有值，优选至少50％、60％或70％，更优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％。改良抗体(improvedantibodies)[94]CDR对抗原决定簇识别和抗体结合具有首要的重要性。但是，对于包括CDR的残基可进行一些改变，而影响抗体识别和结合其同类抗原决定簇的能力。例如，可以制造不影响抗原决定簇识别，但增加抗体与抗原决定簇的结合亲和性的改变。因此，也包含在本发明范围内的是改良形式的鼠和人源化抗体，它们也特异性识别和结合CD33，优选具有增加的亲和性。几个研究已经调查了抗体序列中不同位点上引入一个或多个氨基酸改变的影响，这基于对原始抗体序列和其特性如结合和表达水平的了解(Yang，W.P.etal.，1995，J.Mol.Biol.，254，392-403；Rader，C.etal.，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95，8910-8915；Vaughan，T.J.etal.，1998，NatureBiotechnology，16，535-539)。在这些研究中，已经通过改变CDR1、CDR2、CDR3或框架区内重链和轻链基因序列产生了原始抗体的等价物，使用的方法如寡核苷酸介导的定点诱变、盒式诱变、易错PCR、DNA改组或大肠杆菌的突变株(Vaughan，T.J.etal.，1998，NatureBiotechnology，16，535-539；Adey，N.B.等人.，1996，第16章，277-291页，见“肽类和蛋白的噬菌体展示”，主编，Kay，B.K.等人，AcademicPress)。改变原始抗体序列的这些方法已使二级抗体的亲和性改善(Gram，H.etal.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，3576-3580；Boder，E.T.etal.，2000，Proc.Natl.AcadSci.USA，97，10701-10705；Davies，J.andRiechmann，L.，1996，Immunotechnolgy，2，169-179；Thompson，J.etal.，1996，J.Mol.Biol.，256，77-88；Short，M.K.etal.，2002，J.Biol.Chem.，277，16365-16370；Furukawa，K.etal.，2001，JBiol.Chem.，276，27622-27628)。通过改变抗体的一个或多个氨基酸残基的类似的定向策略，在此描述的抗体序列可用来开发具有改进功能，包括与CD33改进的亲和性，的抗CD33抗体。改良的抗体也包括具有改良特性的抗体，其可通过标准的动物免疫，杂交瘤形成和具有特殊特性的抗体的选择技术来制备。免疫偶联物(immunoconjugates)[101]本发明也涉及免疫偶联物，包括本文中所公开的与药物或前体药物连接的抗体、抗体片段、功能等价物、改良抗体及其类似物。优选的药物或前体药物是细胞毒性剂，并包括例如美登木素生物碱和美登木素生物碱类似物、紫杉醇、CC-1065和CC-1065类似物，海兔毒肽和海兔毒肽类似物。免疫偶联物可通过体外方法制备。为了将药物或前体药物与抗体连接，可使用连接基团。合适的连接基团在本领域中是为人所熟知的，包括二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团和酯酶不稳定基团。优选的连接基团是二硫化物基团和硫醚基团。例如，可使用二硫化物交换反应(disulfideexchangereaction)或通过在抗体和药物或前体药物之间形成硫醚键构建偶联物。美登木素生物碱和美登木素生物碱类似物是优选的细胞毒剂之一。合适的美登木素生物碱的例子包括美登木醇和美登木醇类似物。合适的美登木素生物碱公开在美国专利No.4,424,219；4,256,746；4,294,757；4,307,016；4,313,946；4,315,929；4,331,598；4,361,650；4,362,663；4,364,866；4,450,254；4,322,348；4,371,533；6,333,410；5,475,092；5,585,499；和5,846,545中。关于美登木素生物碱，连接基团可包含反应性化学基团。在一个优选的实施方案中，反应性化学基团可通过一个二硫键连接部分与美登木素生物碱共价结合。特别优选的反应性化学基团是N-琥珀酰亚胺酯(N-succinimidylester)和N-磺基琥珀酰亚胺酯(N-sulfosuccinimidylester)。特别优选的包含连接基团的美登木素生物碱是美登木醇的C-3酯及其类似物，上述连接基团中含有反应性化学基团，其中连接部分含有二硫键，化学反应基团包括N-琥珀酰亚胺酯或N-磺基琥珀酰亚胺酯。美登木素生物碱上的许多位点可作为化学性连接连接部分的位点。例如，具有羟基基团的C-3位点、用羟甲基修饰的C-14位点、用羟基修饰的C-15位点和具有羟基的C-20位点均被认为是有用的。但C-3位点是优选的，美登木醇的C-3位点是特别优选的。其他的化学键包括酸不稳定键，光不稳定键，肽酶不稳定键和酯酶不稳定键。并入本文的美国专利No.5,208,020的公开内容，教导了携带这些键的美登木素生物碱的生产。如在下面所详述的，免疫偶联物My9-6-DM1使用含硫醇的美登木素生物碱(DM1)。DM1由下面的结构分子式(1)表示[110]紫杉烷也是优选的细胞毒剂。适合用于本发明的紫杉烷公开在美国专利No.6,372,738和6,340,701中。本发明的紫杉烷交联物和细胞结合剂可使用目前已知的或以后开发的任何技术来形成。许多偶联的方法在US专利5,416,064和US专利5,475,092中被讲授。CC-1065及其类似物也是优选用于本发明中的细胞毒性药物。CC-1065及其类似物公开在美国专利No.6,372,738；6,340,701；5,846,545；和5,585,499。CC-1065是一种从zelensis链霉菌(Streptomyceszelensis)培养肉汤中分离的强力抗肿瘤抗生素。在体外CC-1065较普遍使用的抗癌药物，如阿霉素，氨甲喋呤和长春花新碱，效价大约1000倍(B.K.Bhuyanetal.，CancerRes.，42，3532-3537(1982))。药物如氨甲喋呤、道诺红菌素、阿霉素、长春花新碱、长春花碱、苯丙氨酸氮芥、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥，加利车霉素，海兔毒肽和海兔毒肽类似物也适合制备本发明的交联物。药物分子也可通过中间载体分子如血清白蛋白与抗体分子连接。抑制表达CD33的细胞的生长[114]也包括在本发明中的是抑制表达CD33的细胞生长的方法。这些方法使用本发明的抗体或免疫偶联物，以及本发明的抗体或免疫偶联物结合一种或多种其他的治疗药剂。合适的治疗性药剂包括那些直接或间接抑制表达CD33的细胞生长的药剂。如在此所使用的术语“抑制(inhibit)”和“抑制作用的(inhibiting)”应该理解为包括对细胞生长的任何抑制性作用，包括细胞死亡。抑制性作用包括瞬时的作用，持续的作用和永久的作用。治疗性应用[117]本发明也包括本发明的抗体或免疫偶联物的治疗性应用，其中所述的抗体或免疫偶联物可以药学上可接受的剂型给予受试对象。可以静脉推注或持续输注一段时间，通过肌肉内、皮下、关节内、鞘内、口服、局部或吸入途径给药。它们也可通过肿瘤内，肿瘤旁，病灶内或病灶旁途径给药以发挥局部以及全身性治疗作用。药学上可接受的药物剂型一般包括药学上可接受的药剂如载体，稀释剂和赋形剂。这些药剂是为人所熟知的，最合适的药剂可由本领域的专业技术人员根据临床情况需要来确定。合适的载体，稀释剂和/或赋形剂的实例包括(1)Dulbecco氏磷酸缓冲盐水，pH～7.4，含有大约1mg/ml至25mg/ml人血清白蛋白，(2)0.9％盐水(0.9％w/vNaCI)，和(3)5％(w/v)葡萄糖。在其他的治疗性应用中，本发明的抗体或免疫偶联物可与一种或多种其他的治疗剂共同给药。治疗剂是可以寻求杀死或限制癌细胞生长，同时对宿主的损害最小的药物。因此，这种治疗剂可利用癌细胞特性(例如，代谢，血管化作用或细胞表面抗原的递呈)与健康宿主细胞之间的任何差异。肿瘤形态学的差异是干预的潜在部位。例如，治疗剂可以是抗体如抗VEGF抗体，其可用来延缓实体肿瘤内部的血管化作用，因此降低其生长速率。合适的治疗剂包括但不限于，细胞毒性或细胞生长抑制剂(cytostaticagents)。紫杉醇是优选的治疗剂，它也是一种细胞毒剂。其他的治疗剂包括但不限于，佐剂如盐酸格拉司琼，雄激素抑制剂如醋酸亮丙瑞林，抗生素如阿霉素，抗雌激素药物如它莫西分，抗代谢药物如干扰素α-2a，酶抑制剂如ras法呢基转移酶抑制剂，免疫调节物如阿地白介素(aldesleukin)，和氮芥衍生物如盐酸苯丙氨酸氮芥，和类似物。当以含水剂型存在，而不是被冻干时，抗体一般配制的浓度为大约0.1mg/ml至100mg/ml，尽管该范围以外较大的变化也是允许的。对于疾病的治疗，抗体或偶联物的合适剂量要依赖于要治疗的疾病类型，如上所规定，疾病的严重性和病程，抗体应用的目的是否是预防性或治疗性的，以往治疗的疗程，患者的临床病史和对抗体的反应，以及主治医生的判断。抗体适合在一个时间或在一系列治疗过程中给予患者。根据疾病的类型和严重性，大约0.015至15mg抗体/患者体重(kg)是给予患者的初始候选剂量，例如一次或多次单独给药，或连续输注。对于在几天或更长时间内重复给药，根据情况，治疗要一直重复直至达到对疾病症状所需的抑制。但不排除可使用其他的给药方案。本发明的治疗性应用包括治疗患病受试对象的方法。用本发明的方法治疗的疾病是以表达CD33为特征的疾病。这种疾病包括骨髓增生异常综合征(MDS)和癌症如急性髓性白血病(AML)，慢性髓性白血病(CML)和前髓细胞性白血病(PML)。专业技术人员要理解的是本发明的方法也可用来治疗还未描述但特征是表达CD33的其他疾病。本发明的治疗性应用也可在体外和离体实施。体外应用的实例包括纯化被CD33阳性细胞如髓系细胞污染的细胞群。该法包括在存在细胞毒My9-6免疫偶联物的情况下培养细胞群，然后去掉死的CD33阳性细胞。体外非临床应用的条件是为人所熟知的(见，例如Uckunetal.，1986，JExp.Med.163，347-368；Uckunetal.，1985，J.Immunol.134，3504-3515；Ramakrishnanetal.，1985，JImmunol.3616-3622)。临床离体应用的实例包括在自体骨髓在回输给相同患者之前的处理，以便杀死患病或恶性髓系细胞(RoyD.C.etal.，1995，J.Clin.Immunol.15，51-57)。诊断和研究应用[128]除了在此所讨论的抗体治疗性应用以外，本发明的抗体可用于许多已知的诊断和研究应用中。例如，本发明的抗体可用于CD33的纯化，检测，和靶向，包括在体外和体内的诊断方法中。例如，抗体可用于免疫测定中，定量和定性测量生物学样品中细胞表达的CD33水平。见，例如Harlowetal.，AntibodiesALaboratoryManual(ColdSpringHarborLaboratoryPress，2nded.1988)，在此整体合并为参考文献。例如，本发明的抗体可用于竞争结合测定，直接和间接夹心测定(sandwichassays)，以及免疫沉淀测定(immunoprecipitationassays)中(Zola，MonoclonalAntibodiesAManualofTechniques，pp.147-158(CRCPress，Inc.，1987))。本发明的抗体也可用于体内的成像，其中将用可检测部分如不透射线试剂或放射性同位素标记的抗体给予受试对象，优选进入血流，检测宿主中标记抗体的出现和位置。这种成像技术可用于恶性肿瘤的分期和治疗。抗体用在宿主中可检测到的任何部分来标记，不管是核磁共振、放射学，或本领域中已知的其他检测方式。标记可以是能够直接或间接产生可检测信号的任何可检测部分。例如，标记可以是生物素标记，酶标记(例如，荧光素酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶和辣根过氧化物酶)，放射标记(例如，3H、14C、32P、35S和125I)，荧光基团如荧光或化学发光化合物(例如，异硫氰酸荧光素、若丹明)，成像剂(例如，Tc-m99和铟(111In))和金属离子(例如，镓和铕)。可应用本领域中已知的任何方法将抗体与标记偶联，包括在Hunteretal.，1962，Nature144945；Davidetal.，1974，Biochemistry131014；Painetal.，1981，J.Immunol.Meth.40219；Nygren，J.，1982，Histochem.andCytochem.30407中描述的那些方法。本发明的抗体也可用作亲和纯化剂。在此过程中，采用本领域中为人所熟知的方法，抗体被固定在合适的支持物上，如Sephadex树脂或滤纸。因此，CD33可从生物学样品中分离和纯化。多核苷酸，载体，宿主细胞和制备抗体的方法[135]本发明进一步提供了含有编码本发明的抗体或其抗原决定簇结合片段的核苷酸序列的多核苷酸。本发明也包括了编码可结合CD33的多肽，，和在严谨型杂交条件下与编码本发明抗体的多核苷酸杂交的多核苷酸，其中所述的严谨型杂交条件包括在60℃，6×SSC、0.5％SDS、5×Denhardt溶液，和100μg/ml热变性的鲑鱼精DNA中预杂交2小时；60℃杂交18小时；在4×SSC，0.5％SDS，0.1％焦磷酸钠中60℃30分钟，冲洗2次；2×SSC，0.1％SDS60℃30分洗涤2次。多核苷酸可通过本领域中已知的任何方法获得，多核苷酸的核苷酸序列可通过本领域中已知的任何方法测定。例如，如果抗体的核苷酸序列是已知的，编码抗体的多核苷酸可从化学合成的寡核苷酸组合而成(例如，如Kutmeieretal.，1994，BioTechniques17242中所述)，简言之，涉及合成含有部分编码抗体的序列的重叠寡核苷酸，对这些寡核苷酸退火和连接，然后是通过PCR扩增被连接的寡核苷酸。构建含有抗体编码序列和合适的转录和翻译控制信号的重组载体的方法在本领域中是为人所熟知的。这些方法包括，例如，体外重组DNA技术，合成技术，和体内遗传重组。因此本发明提供了可复制的载体，该载体含有编码本发明抗体分子，或其重链或轻链，或重链或轻链可变结构区，或任何之一的抗原决定簇结合片段的核苷酸序列，可操作地与启动子连接。重组载体通过传统的技术被转移至宿主细胞，然后转染的细胞通过传统的技术培养产生本发明的抗体。因此，本发明包括含有编码本发明抗体，或其抗原决定簇结合片段的多核苷酸的宿主细胞，所述的多核苷酸可操作地与异源启动子相连。在优选的实施方案中，为了表达整个免疫球蛋白分子，编码重链和轻链的载体可在宿主细胞中共表达。多种宿主表达载体系统可用来表达本发明的抗体分子。这种宿主表达系统代表一些载体，通过这些载体可产生并随后纯化目的编码序列，但也代表一些细胞，当用合适的核苷酸编码序列转化或转染时，可原位表达本发明的抗体分子。这些包括但不限于微生物如用含有抗体编码序列的重组细菌噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如，大肠杆菌，枯草杆菌)，；用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，酿酒酵母和毕赤酵母)；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体感染的(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)或用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统；或携带了重组表达构建物的哺乳动物细胞系统(例如，COS，CHO，BHK，293，3T3细胞)，所述构建物含有来自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒后期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)。优选地，细菌细胞如大肠杆菌，更优选地，真核细胞，特别是为了表达整个重组抗体分子，可用来表达重组抗体分子。例如，哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，与一种载体，如来自人巨细胞病毒的主要中间体早期基因启动子组合在一起，是抗体的有效表达系统(Foeckingetal.，1986，Gene45101；Cockettetal.，1990，Bio/Technology82)。对于长期，高产量的生产重组蛋白，优选稳定的表达。例如，稳定表达抗体分子的细胞系可被工程化。与其使用含有病毒复制起始点的表达载体，宿主细胞不如用合适表达控制元件控制的DNA(例如，启动子，增强子，序列，转录终止子，聚腺苷酰位点等等)和可选择标记物转化。在导入外源DNA后，工程化细胞可在富营养培养基中生长1-2天，然后转至选择性培养基中。重组质粒中的可选择标记物为选择提供了抗性，使细胞稳定地将质粒整合进其染色体中，生长形成转化灶，依次被克隆，扩大成为细胞系。这种方法的优势是可用来工程化表达抗体分子的细胞系。这种工程化细胞系特别用于筛选和评价可直接或间接与抗体分子相互作用的化合物。一旦本发明的抗体分子被重组表达，可通过本领域中已知的纯化免疫球蛋白分子的任何方法来纯化，例如通过色谱(例如，离子交换色谱，亲和性，特别是在蛋白A和筛分柱色谱后与特异抗原的亲和色谱)，离心，差示溶解性(differentialsolubility)，或通过纯化蛋白的任何其他标准技术。实施例[145]本发明现通过参照下面的实施例来进行描述，其目的仅为说明，并不限制本发明。实施例1鼠My9-6抗体[147]在此第一个实施例中，公开了本发明鼠My9-6抗体的完全基本氨基酸结构和cDNA序列，以及其结合特性和以重组形式表达的方式。因此，提供了本发明抗体及其制备的全部和完全的公开，这样免疫学领域中的普通技术人员将能够制备所述的抗体，不需创造性试验。1.1.My9-6抗体的产生，生产和特性[149]用CD33抗原转染的3T3鼠成纤维细胞系用来进行免疫。5月龄BALB/c雌鼠在0天用转染的3T3鼠成纤维细胞系(2.5×106细胞，悬浮在0.2mLPBS中)腹腔内免疫。用0.2mL细胞悬液如下激发动物第13天，5×106细胞；第21天，5×106细胞。在第24天，处死小鼠，取其脾脏。脾脏置于两个毛玻璃片之间以获得单细胞悬液，用含有青霉素和链霉素(SFM)的无血清RPMI培养基洗涤。在冰上，脾细胞团重新悬浮于10mL、0.83％(w/v)氯化铵水溶液10分钟以溶解红细胞，然后用无血清培养基(SFM)洗涤。脾细胞(1.6×108)与来自非分泌性鼠骨髓瘤细胞系P3X63Ag8.653(ATCC，Rockville，MD；cat.no.CRL1580)的骨髓瘤细胞(5.4×107)混合在试管中，用无血清RPMI培养基(SFM)洗涤。去掉上清液，细胞团稀释至2×107细胞/mL。细胞以2×107细胞/板接种在包被以15mg/mL刀豆素A的组织培养板中。培养板37℃温育温育1小时。轻轻地从培养板中去掉上清液。逐滴缓慢加入1mL聚乙二醇溶液(40％PEGw/v)。晃动培养板，温育30秒。去掉PEG并弃除。缓慢加入5mLSFM冲洗板两次，然后弃液。最后一次冲洗后，加入5mL添加了5％胎牛血清(FBS)的SFM。培养板37℃温育过夜。温育后，用细胞刮从板上刮除细胞，并集中。冲洗培养板，并收集细胞。离心获得细胞团，并重新悬浮在添加了5％FBS，青霉素-链霉素和次黄嘌呤/氨基蝶呤/胸腺嘧啶(HAT)的RPMI-1640生长培养基中。细胞以2×105细胞/孔接种在含有巨噬细胞培养层的96孔平底组织培养板中。用于免疫和杂交瘤生产的一般条件的描述见J.Langone和H.Vunakis(主编，MethodsinEnzymology，Vol.121，″ImmunochemicalTechniques，PartI″；1986；AcademicPress，Florida)和E.Harlow和D.Lane(″AntibodiesALaboratoryManual″；1988；ColdSpringHarborLaboratoryPress，NewYork。也可使用生产免疫杂交瘤的其他技术，如本领域中专业技术人员所熟知的。从杂交瘤克隆的培养上清液筛选与用CD33抗原转染的细胞和人组织细胞淋巴瘤细胞系U-937(ATCCCRL-1953.2)结合，和缺少与鼠成纤维细胞系结合能力的克隆。这些克隆被扩大并进行亚克隆。亚克隆的培养上清液通过上述的结合测定被进一步筛选。通过这种步骤，亚克隆3E7-H2-3D8(My9-6)被选择重链和轻链基因被克隆和测序，描述如下。使用ELISA对表达CD33抗原的细胞系和这种抗原的阴性细胞系筛选杂交瘤上清液对CD33抗原的特异结合。细胞分别从组织培养瓶中收获，悬浮在含有10％FBS的生长培养基中，离心成团，用PBS洗涤。洗涤的细胞(100μL大约1-3×106细胞/mL)加入至包被以植物血球凝集素(100μL20μg/mLPHA)的Immulon-2HB板的孔中，离心并在PHA包被的孔中粘附10分钟。轻弹有细胞的培养板去掉PBS，然后37℃过夜干燥。37℃下用5mg/mLBSA的PBS溶液封闭孔1小时，然后用PBS温柔洗涤。然后将等体积的杂交瘤克隆的上清液(100μL；在封闭缓冲液中稀释)加入至含有表达CD33抗原和不表达CD33的细胞的孔中，并在环境温度下温育1小时。用PBS冲洗孔，与羊抗鼠IgG抗体辣根过氧化物酶偶联物(100μL；封闭缓冲液中)温育1小时，然后冲洗多次，使用ABTS/H2O2底物检测结合作用。来自3E7杂交瘤亚克隆的典型上清液在与过度表达CD33抗原的细胞温育过程中产生的信号为0.50吸光度单位，相比而言，与CD33抗原阴性的细胞温育过程中获得的值为0.10。杂交瘤生长在BALB/c小鼠的腹水中。解冻一瓶冰冻的杂交瘤细胞，细胞在组织培养瓶中扩大获得产生腹水所必需数量的细胞。接触过抗原的BALB/c小鼠(已经预先用0.5mL降植烷经腹腔注射10-14天)腹腔注射0.5mL磷酸缓冲盐水(PBS)中的1×106细胞。注射细胞后12至18天，用注射器从小鼠的腹腔吸取腹水。收集的腹水液1000rpm离心5分钟，然后将上清液12,000rpm离心30分钟。从清澈的上清液中按如下纯化抗体步骤1硫酸铵沉淀。置于冰上的上清液用2体积的冷PBS稀释，搅拌，然后缓慢地用1体积冷的，饱和的(100％)硫酸铵溶液处理。当通过离心收集沉淀物时，溶液置于冰上大约5小时。沉淀团以小量的PBS溶解，得到的溶液在缓冲液中透析以进行蛋白A的亲和纯化步骤。步骤2Sepharose-蛋白A的亲和纯化。鼠My9-6的同型是具有κ轻链的IgG1。因此亲和柱在含有3MNaCl，8.0的0.1Mtris.HCl缓冲液中进行平衡。相同缓冲液中抗体溶液流经亲和柱，用平衡缓冲液充分冲洗柱子，然后用含有0.15MNaCl的0.1M乙酸进行洗脱。通过测定280nm处的UV吸光度检测各馏分，用1Mtris中和，然后在PBS中透析以便使用和储存。纯化的抗体首先鉴定与表达CD33的细胞，如转染的鼠3T3成纤维细胞系和人U-937细胞系的结合和不能与在杂交瘤上清液筛选中描述的抗原阴性细胞系结合。为了进一步明确其与CD33抗原结合的特异性，在标记的muMy9-6和市售的抗CD33抗体My9之间进行竞争结合实验。使用Goldmacheretal.，(1989，J.Cell.Physiol.141，222-234)所述的方法进行结合试验。鼠My9-6抗体采用Iodo-gen技术用125I进行放射标记(Fraker，P.J.andSpeck，J.C.，1978，Biochem.Biophys.Res.Commun.80，849-857)。恒定量(3×10-9M)的125I-标记的muMy9-6与不断增加浓度的非放射活性抗体，未标记的muMy9-6或未标记的My9混合，混合物与细胞(每个样品1×106细胞)4℃温育30分钟。这些温育在60μl缓冲液中进行，该缓冲液由添加了2.5％人血清的修改用于悬浮培养物的极限必需培养基(SMEM)组成。然后从含有未结合物质的培养基中分离细胞，离心通过浓度为1.009g/ml的硅油(Aldrich)和石蜡油(Baker)混合物而进行。然后通过在油界面上切割离心管去掉细胞团，并用来在γ计数仪(LKB的RIAgamma1274型)上测定细胞相关的放射活性。测定的细胞相关放射活性与未标记的，竞争抗体的浓度作图。结果在图1中显示两种抗体，My9和My9-6，获得非常相似的竞争结合曲线。这证明了My9和My9-6与相同的抗原结合，而且两种抗体具有非常相似的结合亲合力。因为My9是已被公开和接受的抗CD33标准品，因此可以得出结论My9-6是一种抗CD33抗体。My9抗体可从BioGenex(SanRamon，Ca94583；cat.no.AM267-5M)购得。1.2.My9-6抗体重链和轻链基因的克隆[158]如在MolecularProtocols(NB1455-p173)中所述，从汇合的T175瓶中的My9-6杂交瘤细胞中纯化总RNA。在1％MOPS凝胶上检查RNA的完整性，通过UV分光光度法测定浓度。使用GibcoSuperscriptII试剂盒和或寡dT或随机六聚体引物，用4-5μg总RNA进行RT反应。可通过使用Co等人(1992，J.Irnmunol.148(4)1149-54)所述的RACE法和Wang等人(2000，J.Immunol.Methods.233167-177)所述的简并引物来实施PCR反应。RACEPCR需要一个中间步骤将聚dG尾加至第一条cDNA链的3’末端上。用Qianeasy柱(Qiagen)纯化RT反应，在50μl1×NEB缓冲液4中洗脱。用0.25mMCoCl2、1mMdGTP和5单位末端转移酶(NEB)，在1×NEB缓冲液4中对洗脱液进行dG加尾反应。混合物在37℃温育30分钟，然后1/5的反应混合物(10μl)直接加入至PCR反应混合物中作为模板DNA。RACE和简并PCR反应是相同的，除了在引物和模板上有差异以外。如上面所提到的，末端转移酶反应混合物直接用作RACEPCR模板，而RT反应混合物直接用作简并PCR反应。在两种反应组中，使用相同的3’轻链引物，HindKLTATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC(SEQIDNO11)和3′重链引物，Bg12IgG1GGAAGATCTATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC(SEQIDNO12)。在RACEPCR中，1个聚dC5′引物被用于重链和轻链，EcoPolydCTATATCTAGAATTCCCCCCCCCCCCCCCCC(SEQIDNO13)，而简并5′末端PCR引物为SaclMKGGGAGCTCGAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA(SEQIDNO14)用于轻链，等量的EcoRlMHlCTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTC(SEQIDNO15)和EcoRIMH2CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG(SEQIDNO16)的混合物，用于重链(混合碱基H＝A+T+C，S＝G+C，Y＝C+T，K＝G+T，M＝A+C，R＝A+G，W＝A+T，V＝A+C+G，N＝A+T+G+C)。在MJ研究热循环仪上使用由Wang等人(2000，J.Immunol.Methods.233167-177)改编的程序进行PCR反应1)94℃，3分钟；2)94C，15秒；3)45℃，1min；4)72℃，2分钟；5)循环返回步骤#229次；6)最后72℃延伸10分钟，完成反应。PCR产物使用PCR引物产生的的限制性酶被克隆进pBluescriptIISK+(Stratagene)中。重链和轻链克隆通过LarkTechnologies或Seqwright测序服务进行测序。RACEPCR对My9-6轻链从未成功过。因此，为了证实cDNA序列的5’末端，进行另外简并pCR和克隆。从简并PCR克隆中测得的My9-6轻链cDNA序列，被输入至NCBI的Blast搜索网址上(ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，保存最上面的提交信号序列的5个鼠抗体序列。从这些信号肽使用Codehop网络软件(blocks.fhcrc.org/codehop.html)设计简并PCR引物。EcoRI限制性位点加入至3个Codehop简并引物中(图2)，如上所述这些用于RT-PCR反应中。1.3.重链和轻链样品的制备和测序[165]muMy9-6抗体的重链和轻链通过SDS-PAGE在还原条件下被分离。还原和变性的抗体在12％Tris-甘氨酸凝胶上进行电泳(Novex，SanDiego，CA)。电泳后，使用CAPS/MeOH缓冲液将凝胶点至Immobilonpsq膜上。转移后，用PonseauS对膜进行染色。切除对应轻链和重链的带，用于蛋白质测序。抗体的轻链从膜上通过自动Edman降解化学法在ABI494Procise测序仪上直接测序。重链的N末端被封闭，因此根据Gharahdaghi等人(1996)用胰蛋白酶原位消化蛋白。消化的混合物然后通过MALDI-TOF质谱法在KratosKompactSEQ装置上进行分析。被选择的肽进行MS/MS以测定其序列。实施例2.通过表面重整对抗体可变区进行人源化[169]表面重整My9-6抗体以提供适合作为治疗或诊断试剂的人源化版本，一般根据美国专利5,639,641中公开的原理和方法进行，如下所述。2.1.表面预测(surfaceprediction)[171]对于一组具有可溶解结构的抗体，可变区残基的溶剂可及性用来预测鼠My9-6抗体可变区的表面残基。一组127个独特抗体结构的文件(file)(图3)的氨基酸溶剂可及性使用MC软件包进行计算(Pedersenetal.，1994，J.Mol.Biol.235(3)959-973)。来自该组127个结构的10个最相似的轻链和重链氨基酸序列使用NCBI网址(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)上的序列比对软件进行测定。这10个抗体可变区每个可变区残基的平均溶剂可及性使用Excel电子表格进行计算，平均可及性超过30％的位点被认为是表面残基。平均可及性在25％和35％之间的位点进一步通过计算侧向于两侧的两个残基相同的结构的个别残基可及性来考虑。2.2.分子建模(molecularmodeling)鼠My9-6可变区的分子模型使用牛津分子软件包AbM来产生。抗体框架区从具有最相似的氨基酸序列的抗体的结构文件中构建(轻链为1sb，重链为1bbj)，非典型CDR通过搜索含有非丰余可溶解结构的C-a结构数据库来构建。用GlaxoSmithKlineSwiss-PdbViewer来观察构型，确定位于CDR5？内的残基。2.3.人抗体选择[175]鼠My9-6可变区的表面位置与Kabat数据库中人抗体序列中的相应位置进行比较(JohnsonandWu，2001，NucleicAcidsRes.29(1)205-6)。抗体数据库管理软件SR(Searle，1998)用来从天然重链和轻链人抗体对中提取和比对表面残基。具有最相同的表面残基的人抗体可变区表面，特别关注位于CDR5？之内的位点，被选择来替换鼠My9-6抗体可变区的表面残基。2.4.通过PCR诱变构建人源化抗体基因[177]对鼠My9-6可变区cDNA克隆进行PCR诱变，来首先改变5’末端序列以匹配肽序列，然后构建表面重整的，人My9-6基因。设计引物组建立原来未在初始简并PCR克隆中测序的鼠源性残基(轻链位点N1，M3，L4，和S7，和重链位点Q3和P7)。设计人源化的引物组制造所有形式的huMy9-6所需的6个氨基酸改变，并设计其他的引物可选择改变4个5？残基(图4)。PCR反应在MJ研究热循环仪上根据下列程序进行1)94℃，1分钟；2)94℃，15秒；3)55℃，1分钟；4)72℃，1分钟；5)循环返回步骤#229次；6)终止于最后的延伸步骤，72℃4分钟。PCR产物用其相应的限制性酶消化，并克隆进pBluescript克隆载体中。克隆被测序以证实氨基酸改变。2.5.人源化抗体的表达载体[180]轻链和重链配对序列被克隆进单个哺乳动物表达载体中。人可变序列的PCR引物产生了可使人信号序列加入进pBluescriptII克隆载体中的限制性位点。然后可变序列能被克隆进哺乳动物表达质粒中，该质粒中对于轻链或重链分别具有EcoRI和BsiWI或HindIII和ApaI(图5)。轻链可变区序列可在框内被克隆在人Igκ恒定区上，重链可变序列被克隆在人Igγ恒定区序列上。在最终的表达质粒中，人CMV启动子驱动轻链和重链cDNA序列的表达。2.6.人源化抗体的瞬时表达[182]293T细胞在Dulbecco′sModifiedEagleMedium(DMEM，BioWhittaker，12-614F)，10％热灭活的胎牛血清(Hyclone，SH30071.03)，4mML-谷氨酰胺(BioWhittaker，17-604E)，和1％青霉素/链霉素混合物(BioWhittaker，17-603E)中，6％CO237℃孵箱中培养。细胞每周以1∶10的稀释度分离三次，保持亚汇合状细胞群。转染前24小时，用胰蛋白酶(BioWhittaker，17-161E)消化细胞；用台盼兰排除法(trypanblueexclusionmethod)计数活细胞，接种在10cm组织培养处理板(Corning，430167)上，密度为每板2×106细胞。转染前一刻，用磷酸缓冲盐水(PBS，用BioWhittaker10×PBS，17-517Q稀释)轻轻地洗涤细胞，向细胞覆盖含有1％超低IgG血清(GibcoBRL，16250-078)的7mL杂交瘤SFM(InvitroGen，12045-076)。瞬时转染法由标准的QiagenPolyfect方案改变而来。对于要转染的1个10cm板，将8μgCsCl级DNA与300μL杂交瘤SFM和80μLPolyfect转染试剂(Qiagen，301107)混合。转染混合物低速旋转混合大约5秒，在环境温度下温育5分钟。温育后，向转染混合物中加入1mL杂交瘤SFM，1％超低IgG血清，用吸液管上下吸放大约5次以混和。然后将转染混合物加入至覆盖细胞的7mL杂交瘤SFM中，轻轻晃动平板保证均匀分布。转染反应在组织培养箱中温育过夜，一般16小时。然后小心地从细胞中去除转染培养基，替换以20mL杂交瘤SFM，1％超低IgG。然后将转染的细胞放回培养箱继续72小时，此后收获上清液，通过ELISA对抗体的产量定量。收获的上清液4℃储存至纯化。2.7.人源化抗体的纯化[185]通过添加1/10体积的1MTris/HCl缓冲液，pH8.0为蛋白A亲和色谱制备上清液。pH调整后的上清液通过0.22μm的滤膜过滤，并负载在蛋白ASepharose柱(HiTrapProteinAHP，1mL，AmershamBiosciences)上，并用结合缓冲液(PBS，pH7.3)平衡。在样品负载的过程中Q-Sepharose前置柱(10mL)连接在蛋白A的上游以减少细胞物质如DNA的污染。在样品负载后，去掉前置柱，倒转蛋白A柱的方向以进行冲洗和洗脱。用结合缓冲液冲洗柱直至获得稳定的基线在280nm处没有吸光度。抗体用含有0.15MNaCl，pH2.8的0.1M醋酸缓冲液洗脱，使用的流速为0.5mL/min。收集大约0.25mL的馏分，加入1/10体积的1MTris/HCl，pH8.0进行中和。峰馏分在PBS，pH7.3中透析过夜。通过测定280nm处的吸光度对抗体进行定量，计算抗体的浓度，假定E2800.1％＝1.4。对抗体馏分进行吸光度光谱分析和SDS-PAGE以证实其纯度。实施例3.人源化抗体的检测[187]3.1.生长细胞进行结合分析[188]从美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)(ATCC#CCL-240)处获得HL-60细胞。将细胞置于5％CO2空气，37℃水套温育箱(NapcoScientificCo.，Tualitan，Oregon)。细胞生长在添加了L-谷胺酰胺(BioWhittaker，Walkersville，MD)含有10％胎牛血清(Hyclone，Logan，Utah)，以及50μg/mL硫酸庆大霉素(LifeTechnologies，GrandIsland，NY)的RPMI培养基中。3.2.对HL-60细胞的直接结合测定[190]从T75培养瓶(NUNCLONTM，cat.no.153732)中收获HL-60细胞，并在OmnifugeRTtabletop离心管(HaereusSeparations，Germany)中4℃大约300xg离心5分钟。细胞以3×106细胞/mL的密度重新悬浮于FACS缓冲液中，包含2％(v/v)羊血清(SigmaChemicalCo.，StLouis，MO)的MEMα培养基，添加了L-谷胺酰胺(LifeTechnologies，GrandIsland，NY)。使用多通道吸液管，将3×105细胞加入至Falcon96-孔圆底培养板(cat.no.3077)的孔中，然后置于冰上。使用Falcon96-孔可变形检测板(cat.no.353911)，在FACS缓冲液中对每个检测或对照物品制备双份11个两倍系列稀释液，起始浓度从2×10-8M开始。然后，100μl每种检测或对照品与细胞混合。对照孔仅加入FACS缓冲液。冰上温育培养板1小时，然后在冷冻离心机中300xg离心5分钟。在含有10％漂白粉的废液烧杯上迅速倒置从培养板中去掉试剂。轻轻旋转晃动重新悬浮细胞，用冷的FACS缓冲液冲洗1次，离心，然后轻轻旋转晃动重新悬浮。FITC标记的羊抗人IgG(JacksonImmunoResearchLaboratories，WestGrove，PA，cat.no.109-096-003)和FITC标记的羊抗鼠IgG(JacksonImmunoResearchLaboratories，WestGrove，PA，cat.no.109-095-088)以1∶100在FACS缓冲液中稀释，向测定板上合适的孔中加入100μl。然后冰上继续温育测定板1小时，避光。以上述的同样方法冲洗孔中未结合的二抗。轻轻旋转晃动重新悬浮细胞，然后加入1％甲醛的磷酸盐缓冲盐水(PBS，10mM磷酸钾，150mM氯化钠，pH7.2)120μl/孔进行固定。然后在装配了自动96孔加样装置的FACSan流式细胞仪(BectonDickinson，MountainView，CA)上分析测定板。3.3.质膜制备[192]根据Vater等人(1995)所述的方法制备质膜。简言之，HL-60细胞在含有10％胎牛血清和50μg/mL硫酸庆大霉素的添加L-谷氨酰胺的RPMI中生长至1×106细胞/mL的密度。当获得总共1×109细胞时，收获细胞，在OmnifugeRT离心管中大约300xg离心，用Hanks平衡盐溶液(LifeTechnologies，cat.no.14175-095)冲洗，一起置入1个50mL圆锥形离心管中。然后沉淀的细胞团在-80℃冷冻至少24小时，以促进细胞溶解和匀浆。为了制备质膜，细胞团在37℃迅速复温，然后在冰上储存；所有随后的步骤在4℃进行。沉淀的HL-60细胞团重新悬浮在8mL含有1mMEDTA，0.25M蔗糖，和1mM苯甲基磺酰氟化物(PMSF)的10mM，pH7.0的Tris-HCl缓冲液中。然后细胞团被转移至15mLDounce组织磨臼(Wheaton，Millville，NJ)中进行细胞破碎(用紧密联接的硼硅玻璃研杵捣20次)。在SorvalRC-5B冷冻超速离心机中使用SS-34转子(Wilmington，DE)6000rpm离心匀浆10分钟，轻轻地从沉淀的细胞团中去掉上清液。再次用8mL缓冲液冲洗细胞团一次，如上进行处理。合并的上清液加至1mL10mMTris-HCl，1mMPMSF，1mMEDTA，pH7.0的37％蔗糖夹层缓冲液上，并进一步在预冷的BeckmanL8-超速离心机用SW55ti转子(BeckmanInstruments，PaloAlto，CA)33,000rpm处理70分钟。从每个试管中取出正位于蔗糖层上面的乳白色质膜层，并用4体积的10mMTris-HCl，1mMEDTA，1mMPMSF，pH7.0稀释。然后将该溶液在超速离心机中18,000rpm继续离心30分钟。小心去掉上清液，得到的沉淀团重新悬浮在10mMTris-HCl，1mMEDTA，1mMPMSF，pH7.0中。HL-60膜制剂等分进1.5mL无菌螺帽Eppendorf管中，在液氮中冷冻，然后储存在-80℃以备使用。使用PierceTMBCAAssay(PierceChemicalCompany，Rockford，IL，cat.no.23235)测定最终制剂的总蛋白浓度。3.4.HL-60膜的直接结合测定[194]如上所述制得的HL-60膜，在去离子水中以10μg/mL的起始浓度，使用Labconco真空干燥器(Labconco，Corp，KansasCity，MO)在Immulon296-孔测定板(DynexLaboratories，Chantilly，VA)的聚苯乙烯表面上在环境温度下过夜干燥。然后ELISA测定板用Tris缓冲盐水(50mMTris-HCl，150mM氯化钠，pH7.5，TBS)的1％馏分V牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich，Inc.，St.Louis，MO，cat.no.A-3294)，0.05％Tween-20(Sigma-Aldrich，Inc.，St.Louis，MO，cat.no.P-2287)溶液封闭，每孔300μL，37℃1小时。在此封闭步骤后，将板中的封闭缓冲液中排出，在纸巾上吸干。在封闭缓冲液中制备检测或对照试剂的两个三倍系列稀释液，分成四份，在可变形96孔检测板上，以3.13×10-9M起始向下滴定至5.29×10-14M。阴性对照孔仅含有封闭缓冲液。50μL每种稀释液转移至质膜包被的检测板上指定的孔中，然后4℃温育过夜。然后将孔内容物吸出至一个含有10％(v/v)漂白粉的废液瓶中，用含有0.1％(v/v)Tween-20(冲洗缓冲液)的TBS冲洗板3次，在纸巾上吸干。用封闭缓冲液稀释1∶1000的羊抗鼠IgG-HRP或驴抗人IgG-HRP在适当的孔中检测结合的抗My9-6抗体的量。这些二抗在检测板上室温下温育1小时，避光。如前洗板和吸干。检测板使用TMB(BioFXLaboratories，Randallstown，MD，cat.no.TMBW-0100-01)显影，然后用终止液(BioFXLaboratories，Randallstown，MD，cat.no.STPR-0100-01)淬灭。使用TitertekMultiskanPlusMKII平板读数仪(Huntsville，AL)在A450nm对检测板进行读数。3.5.对HL-60膜进行竞争结合测定[196]如上所述制得的HL-60膜，在去离子水中以10μg/mL的起始浓度，使用Labconco真空干燥器(Labconco，Corp，KansasCity，MO)在Immulon296-孔测定板(DynexLaboratories，Chantilly，VA)的聚苯乙烯表面上在环境温度下过夜干燥。然后ELISA测定板用Tris缓冲盐水(50mMTris-HCl，150mM氯化钠，pH7.5，TBS)的1％馏分V牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich，Inc.，St.Louis，MO，cat.no.A-3294)，0.05％Tween-20(Sigma-Aldrich，Inc.，St.Louis，MO，cat.no.P-2287)溶液封闭，每孔300μL，37℃1小时。在此封闭步骤后，将板中的封闭缓冲液中排出，在纸巾上吸干。在封闭缓冲液中制备检测或对照试剂的两个三倍系列稀释液，分成四份，在可变形96孔检测板上，以1.25×10-8M起始向下滴定至2.44×10-11M(2x所需的终浓度)。然后这些未标记的竞争试剂与等体积的2.5×10-10M生物素化鼠抗-My9-6(ImmunoGen，Inc.，Cambridge，MA)混合；阳性对照不含竞争试剂，而阴性对照仅含封闭缓冲液。50μL这些稀释液转移至质膜包被的检测板上指定的孔中，然后4℃温育过夜。然后将孔内容物吸出至一个含有10％(v/v)漂白粉的废液瓶中，用含有0.1％(v/v)Tween-20(冲洗缓冲液)的TBS冲洗板3次。检测板在纸巾上吸干，每孔用在封闭缓冲液中1∶5,000稀释的100μl抗生蛋白链菌素-碱性磷酸酶(JacksonImmunoResearchLaboratories，WestGrove，PA，cat.no.016-050-084)检测结合的生物素化的鼠抗My9-6的量。室温下温育1小时后，冲洗孔中未结合的二抗试剂，检测板使用TMB(BioFXLaboratories，Randallstown，MD，cat.no.TMBW-0100-01)显影，用终止液(BioFXLaboratories，Randallstown，MD，cat.no.STPR-0100-01)淬灭。使用TitertekMultiskanPlusMKII平板读数仪(Huntsville，AL)在A450nm对检测板进行读数。3.6.克隆鼠My9-6抗体可变区[198]通过上述的RT-PCR法克隆得到鼠My9-6抗体的可变区。若干单个的轻链和重链克隆被测序以鉴定和避免聚合酶可能产生的序列错误。对于轻链仅获得一条序列，但从重链RT-PCR克隆中分别得出2条序列。为了确定鼠My9-6轻链可变区的实际序列，通过Edman降解，基质辅助激光离子吸收(MALDI)和串联质谱(MS-MS)进行分析。My9-6轻链氨基末端的22个残基通过Edmian降解进行测序，在图6A中显示。来自简并RT-PCR克隆的初始cDNA序列除了可能由简并引物产生的4个残基外全部匹配。通过Edman降解测定的肽序列后来通过5’末端信号肽序列中的简并引物产生的RT-PCR克隆而证实。胰蛋白酶消化片段的MS-MS分析也证实了轻链CDR1和2的序列(图6B)。总之，这些肽分析证实了所预测的鼠My9-6轻链氨基酸序列来自RT-PCR产生的cDNA克隆。如重链序列所普遍的一样，muMy9-6重链氨基末端可被焦谷氨酸残基阻断，因此不能通过N末端Edman降解测序。而是通过胰蛋白酶消化产生内部序列数据，通过基质辅助激光离子吸收(MALDI)和串联质谱(MS-MS)进行分析。鉴定了一个1788道尔顿的片段，其预测的序列与cDNA克隆2的一部分相同(图7)。对于cDNA克隆2这个序列包含了CDR3的5个残基，因此对于muMy9-6重链的阳性鉴定是一个理想的肽，。仅产生最初从简并RT-PCR克隆2获得的序列的多个RACEPCR克隆也可确认该肽序列。来自多个cDNA克隆和肽序列分析的综合结果提供了最终的鼠My9-6轻链和重链序列，在图8中显示。使用Kabat和AbM定义法，鉴定了三个轻链和重链CDR(图8和9)。搜索NCBIIgBlast数据库表明muMy9-6抗体轻链可变区最可能来自鼠IgV？8-27胚系基因，而重链可变区最可能来自IgVhV102胚系基因(图10)。3.7My9-6抗体的可变区表面残基测定[203]Pedersen等人(1994，J.Mol.Biol.235959-973)和Roguska等人(1996，ProteinEng.9895-904)所述的抗体表面重整技术是以预测鼠抗体可变序列的表面残基开始的。表面残基被定义为其总表面区域的至少30％可接触到水分子的氨基酸。缺少可发现muMy9-6表面残基的可溶解结构的情况下，在一组127个抗体结构文件中对10个具有最同源序列的抗体进行配比(图11A&B)。对于这些配比的序列平均每个Kabat位点的溶剂可及性，对于每个残基相对可及性的分布显示在图12中。几种表面位点的平均可及性在25％和35％之间。这些看上去更接近于仅平均具有两个相同的侧向两侧的残基的抗体(图13A和B)。在另外的分析后，muMy9-6重链的25个预测的表面残基未变化，但轻链中的Kabat位点15和70需要进一步考虑。轻链位点15上的丙氨酸在所有10个结构中的平均可及性为34.4％，但仅有一个单一结构1mcp，与muMy9-6具有相同的侧向残基。在这种结构中，Ala15的相对可及性仅为18.2％。因为在这个单一结构中，对于位点15，Ala15较平均残基可及性大幅度降低，所以侧向残基仅有一处差异的三个结构(1ap2，1frg，和1hil)也一起被平均。这三个结构的平均可及性再次达到33.3％，使Ala15成为一个预测的表面残基。最终，表面重整的抗-B4，C242和表面重整的专利本身预测轻链位点15是一个表面残基。总之，保守的方法是假设muMy9-6轻链位点15是一个表面残基。muMy9-6轻链位点70也需要特别的考虑，最终导致其保守预测成为一个表面残基。对于轻链初始的表面预测工作使用仅来自5个最同源轻链结构的MC数据就完成了，在本组中Asp70是一个被预测的表面残基。以后，使用另外5个最同源的结构，位点70被发现其平均可及性为29.1％，如图13A显示。另外，10个结构中的9个具有相同的侧向残基，本组的平均值为29.2％的可及性。因为这个残基看上去非常接近于30％的界值，表面重整专利称位点70位表面位点，可及性数据被进一步核对。对于结构1Ive位点70的相对可及性为22.5％，较下一个最低的相对可及性27.2％低5个百分点。因为1Ive是最同源的结构，它是很低的异常值，因此对除1Ive外还对具有相同侧向残基的8个结构进行了平均，本组的平均可及性为30.1％。这与下面的事实，即初始的muMy9-6轻链分析和表面重整专利称轻链位点70为表面位点，一起形成保守的预测，muMy9-6轻链Asp70是一个表面残基。3.8.分子建模确定残基是否在CDR的5范围之内[207]分析用AbM软件包产生的分子构型以确定muMy9-6表面残基是否位于CDR的5之内。为了表面重整抗体，CDR以外的所有表面残基必须被改变为其人的对应副本，但位于CDR5之内的残基也可能对抗原的结合和特异性有决定作用。因此这些5残基必须在整个人源化过程中被鉴定和考虑。用来表面重整的CDR定义结合了重链CDR2的AbM定义和其他5个CDR的Kabat定义(图9)。鼠的模型用Swiss观察器软件分析，图14显示了在轻链或重链序列的任何CDR残基5之内的残基。3.9.选择最同源的人抗体表面[209]使用SR软件从Kabat抗体序列数据库中为表面重整muMy9-6得出了候选的人抗体表面。这个软件提供了一个界面仅搜索抗体数据库中特殊的残基位点。为了保留天然的配对，轻链和重链的表面残基在一起比较。来自Kabat数据库中最同源的人抗体表面以序列同一性的等级顺序进行配比。如SRKabat数据库软件所配比的一样，最上面的5个表面在图15中显示。然后这些表面被比较以鉴定人抗体表面将需要在CDR5之内的最小变化。抗丙性肝炎病毒抗体，LC3bPB(IvanovskiM.etal.，1998，Blood91(7)2433-42)，需要最小数目的表面残基改变(总共10个)，这些残基中仅有4个位于CDR的5之内。muMy9-6的全长可变区序列也使用SR与Kabat人抗体数据库进行配比，LC3bPB被鉴定为第14个最相似的人可变区序列(数据未显示)。因为LC3bPB抗体提供了最同源的表面，需要最小数目的5残基改变，因此它是表面重整muMy9-6的最佳候选物。3.10.为人源化My9-6抗体构建My9-6基因[211]如上所述使用PCR诱变技术为huMy9-6产生10个表面残基改变。因为LC3bPB的6个表面残基超出了CDR的5以外，因此在所有形式的人源化My9-6中这些残基从鼠改变成人(图16A和B)。位于CDR的5之内的4个表面残基，Kabat轻链位点1，3和45和重链位点64，分别被改变为人或保留为鼠的形式，制成了16个人源化版本的My9-6。在这些中，最人源化的是1.0版本，因为它具有所有10个人的表面残基。就保证最大结合亲和性而言，最保守的版本是1.1版本，它保留了4个位于CDR的5之内的鼠表面残基。每个人源化My9-6抗体基因被克隆进抗体表达质粒(图5)中以进行瞬时和稳定的转染。3.11.结合数据[213]表面重整人源化的关键强度是通过保留了非表面的鼠框架残基，人源化的My9-6应该继续与CD33结合，亲和性不改变。但在CDR5之内的3个表面残基对抗原结合有作用，因此改变这些残基将对结合产生负效应。为了阐明这种关系，16种形式的人源化My9-6包括了在4个5残基位点的每一个上人或鼠残基的所有组合。这些组合的范围从在每个非CDR表面位点上具有人源化残基的最佳或最近似的人源化版本，1.0，至在4个5表面位点中的每一个中保留了鼠残基的最保守形式，1.1，因此应该保留野生型的结合能力。通过比较人源化My9-6形式与鼠My9-6的结合亲和性，保留了野生型结合能力的最近似的人源化形式被选择为表面重整的人源化My9-6。使用人源化版本的鼠My9-6和muMy9-6的直接和竞争结合试验在表达CD33的人白血病细胞系，HL-60上进行。在HL-60质膜或整个细胞上检测3个最近似的人源化版本(V1.0、V1.3、V1.6)以及最保守的版本(V1.1)。图17给出了每种条件的KD值，图18显示了huMy9-6，V1.0，相比muMy9-6的实施例结合曲线。为人源化My9-6版本，包括最近似的人源化版本1.0计算的KD值，位于muMy9-6KD值的试验误差之内。竞争结合试验结果液证明了huMy9-6抗体与muMy9-6本身一样可同样充分地竞争CD33的结合。这些数据证明了全部人源化的My9-6，V1.0对HL-60质膜和整个细胞的近似野生型结合亲和性，不需要检测其他的形式，因为1.0版本是最佳的人源化My9-6抗体。鼠My9-6抗体已经被完全人源化，不丧失结合活性。从鼠至人表面残基的变化不会引起结合活性的丧失，即使这些表面残基中的4个位于CDR的5内。在CDR的5的残基被认为可能形成关键的vanderWaal触点，可能影响这些CDR的结构。My9-6人源化的结果表明如果表面重整的抗体数目增长，基于实际的结合数据的完全残基位点分析可能成为较简单查看位于CDR的5内的任何残基更为有效的靶向可疑残基的方法。人源化My9-6V1.0(huMy9-6)是使用上述方法被人源化的第4个抗体。通过表面重整鼠抗体的可变区框架进行人源化被发展为标准人源化方法，包括CDR嫁接的一种改良方法，需要大量开发和再改造以维持结合活性。这可通过表面重整的huMy9-6抗体进行对比，仅涉及改变10个表面残基，形成了具有完全人源化表面的完全活性的抗体。实施例4.My9-6-DM1免疫偶联物[219]使用与美登木素生物碱药物DM1交联的My9-6抗体进行了人肿瘤异种移植物在小鼠中的临床前功效研究。如下所讨论的，My9-6-DM1保持了未修饰抗体与CD33的特异性和结合亲和性，显示在体外对CD33阳性肿瘤细胞的有效的抗原特异细胞毒性。用My9-6-DM1治疗携有已形成皮下HL-60肿瘤异种移植物的SCID小鼠，多次给药可引起肿瘤的完全消退(regression)(20mg交联抗体/kg/天，静脉给药×5天)，显示没有毒性，在最大可耐受剂量下反应良好。相反，与赋形剂对照相比用My9-6抗体单独治疗对HL-60肿瘤生长没有影响。在使用My9-6-DM1治疗携带皮下THP-1异种移植物的小鼠过程中也观察到类似的治疗功效。4.1.试剂[222]抗体是上述针对人CD33的鼠单克隆My9-6抗体。抗体修饰剂是N-N-琥珀酰亚胺酯4-(2-吡啶二硫代)戊酸盐(SPP)[224]细胞毒性剂是美登素类似物，DM1，可从微生物发酵产物，安丝菌素P3合成。DM1是微管蛋白聚合作用的一种有效抑制剂。[225]4.2.My9-6-DM1的制备[226]My9-6-DM1通过用SPP修饰My9-6抗体，以每分子抗体导入3-5个吡啶二硫代基团而制备。DM1上硫醇取代基和抗体上的活性二硫化物官能基团之间的二硫化物交换提供了含有DM1的抗体偶联物。(n可以是任何整数)[227]4.3.通过流式细胞计数仪分析抗体和抗体偶联物的结合[228]HL-60细胞与多个浓度的My9-6抗体或My9-6-DM1温育。然后细胞被冲洗，与第二个FITC标记的抗鼠IgG抗体温育。再次冲洗后，细胞用2％甲醛固定，使用BDFACScan流式细胞仪定量细胞相关的荧光。My9-6-DM1保留了可与未修饰抗体相比的特异CD33结合能力(图19)。4.4.体外细胞毒性测定[230]使用表达CD33的THP-1细胞和CD33阴性细胞系Namalwa测量My9-6-DM1的细胞毒性。细胞接种在含有交联物的培养基的96孔板中，在37℃温育至集落形成(2-3周)。然后对集落进行评分，在计算中使用Poisson分布测定存活的部分。4.5.体内鼠肿瘤异种移植物研究[232]皮下肿瘤模型-HL-60人前髓细胞性白血病细胞(0.1mL5×106细胞)皮下接种至雌性SCID小鼠的右侧腹部。当肿瘤的大小达到100mm3(大肿瘤模型为400mm3)时通过静脉注射侧尾静脉治疗小鼠。每周测量肿瘤大小和小鼠体重两次。存活模型-HL-60细胞(0.1mL5×106细胞)被静脉注射进雌性SCID小鼠的侧尾静脉内。肿瘤细胞注射处理后11天开始治疗。每天检查小鼠的半死状态，肿瘤质量(tumormass)或死亡。每周测量体重两次。4.6.My9-6-DM1的体外特异性和功效[234]使用克隆源性测定来检测与CD33阴性细胞系(Namalwa)相比My9-6-DM1对表达CD33的细胞(THP-1)的细胞毒性，其中通过定量治疗后生长的集落数目来测定细胞杀伤活性。My9-6-DM1显示了在体外对CD33阳性人肿瘤细胞有效的细胞杀伤活性(图20)。没有观察到对CD33阴性细胞的明显毒性，表明CD33依赖性细胞毒性是由于抗CD33抗体，My9-6的特异靶向作用。4.7.My9-6-DM1对小鼠内人肿瘤异种移植物的作用[236]使用携带人HL-60肿瘤细胞异种移植物的SCID小鼠测定体内My9-6-DM1的作用。HL-60细胞被皮下注射，使肿瘤生长至100mm3的平均大小。My9-6-DM1交联物经静脉输送每天一次，持续5天，剂量在图21中标明。用药剂量表示为交联物中的mg抗体，其对应的DM1剂量为大约15μgDM1/mg抗体。测量肿瘤的体积作为治疗作用的一个标识，监测小鼠的体重以指示治疗引起的毒性。My9-6-DM1可使携带人HL-60细胞异种移植物的小鼠产生长期治愈作用，其剂量引起很小的毒性(图21)。在被测的两个最高剂量下(19和26mg/kg)，观察到肿瘤完全消退，最大的体重损失小于10％(图21A和B)。即使是在最低的被测计量下(13mg/kg)，5只小鼠中有2只显示完全的治愈，而其他4只显示的肿瘤消退为肿瘤生长被延缓了大约20天。采用THP-1白血病细胞系也观察到了类似的结果，My9-6-DM1可使携带人THP-1肿瘤异种移植物的小鼠产生了长期治愈作用(数据未显示)。这些结果与单独使用My9-6抗体治疗获得的结果形成了鲜明的对比。抗体单独对肿瘤细胞生长没有作用，即使在50mg/kg的剂量下(图21C)。My9-6-DM1的活性可与已批准的抗CD33抗体加利车霉素偶联物卡奇霉素吉妥组单抗相媲美。卡奇霉素吉妥组单抗每4天用药3剂量。初步试验证明在无胸腺鼠已公布的MTD(0.3mg/kg)下卡奇霉素吉妥组单抗对SCID小鼠毒性太强(数据未显示)。在本试验中在100和200μg/kg剂量下也观察到了明显的毒性(图21F)。卡奇霉素吉妥组单抗显示在本模型中在最大耐受剂量下(100μg/kg)仅有一般的肿瘤消退作用和生长延缓作用(大约25天)。在一个单独的试验中，My9-6-DM1的抗肿瘤活性可与未交联的母体药物，美登素的活性相媲美。携带HL-60肿瘤异种移植物的小鼠每天治疗，持续5天，偶联物的剂量为23mg抗体/kg或350μgDM1/kg；未交联的药物剂量为350μg/kg；或未交联抗体剂量为23mg/kg。单独用美登素治疗的6只小鼠中的4只在治疗后两天死亡，表明这种水平的药物毒性是非常强的。但药物显示对剩余3只小鼠的肿瘤生长有明显的影响，生长延缓大约10天(图22)。My9-6抗体单独对肿瘤生长没有影响，而My9-6-DM1偶联物可引起肿瘤的完全消退。偶联物治疗对小鼠体重的影响(降低12％)稍高于以前的试验，可能反映了偶联物合成中的批间差异。在第70天开始观察到在6只偶联物治疗的小鼠中出现了肿瘤的再生长。这些动物接受了与首次治疗相同的第二次My9-6-DM1治疗。第二次治疗使“复发”肿瘤完全消退，没有观察到不良的毒性作用，这表明肿瘤的再生长不是因为偶联物抗性细胞的生长。在本异种移植物模型中My9-6-DM1的强效作用表明甚至对HL-60肿瘤偶联物也是有效的。在治疗开始前使肿瘤生长至＞400mm3的体积。另外，将My9-6-DM1的活性与标准的化疗药物进行比较。My9-6-DM1可使SCID小鼠中的大肿瘤完全消退(图23A&B)。另外，复发的肿瘤(6只小鼠中的2只)对My9-6-DM1的第二次治疗是敏感的。用标准的化疗药物(Ara-C和黄胆素)对肿瘤的生长作用很小。较高的药物剂量对小鼠的毒性是很大的(未显示)。4.8.My9-6-DM1在HL-60细胞小鼠存活模型中的功效[243]My9-6-DM1在肿瘤异种移植物模型中的作用是惊人的，而我们也感兴趣的是看到了偶联物在鼠存活模型中的活性，其中HL-60细胞被直接注入至鼠尾静脉中。在这个模型中，对照小鼠在注射细胞后30和50天之间死亡。在注射细胞后11天，开始用My9-6-DM1治疗的小鼠显示存活率大幅度增加，8只小鼠中的7只70天仍存活(图24A)。在本模型中单独使用美登素也显示对鼠存活有明显的影响，尽管8只小鼠中2只在开始治疗后不久死亡，表明有一定的药物毒性。本模型与皮下异种移植物模型相比美登素的相对作用表明HL-60肿瘤对这种环境中药物的作用更敏感。开始治疗后进一步的延缓作用证明了靶向和非靶向药物之间的显著差别。但即使在本模型中，标准的化疗没有产生明显的存活率提高(图24B)。最高的组合剂量显示了非常明显的药物毒性。My9-6抗体单独使用和卡奇霉素吉妥组单抗显示对存活率有一定的增加。保藏声明[245]根据布达佩斯条约的条款，制备鼠My9-6抗体的杂交瘤保藏于2002年11月7日，保藏在美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)，1549邮箱，弗吉尼亚州马纳萨斯，20108，并被指定保藏号为PTA-4786。在本公开中，参考了某些专利和已印刷的出版物，其讲授的内容各自整体引入本文，以作参考。尽管本发明已经被详述，并以其特殊实施例作为参考。但对于本领域的普通技术人员来说很明显的是可对于进行各种变化和修改，并不违背其精神和范围。序列表<110>伊谬诺金公司<120>抗-CD33抗体和使用其治疗急性髓性白血病的方法<130>F174222<140>PCT/US2003/032737<141>2003-11-05<150>US60/424.332<151>2002-11-07<160>94<170>PatentInversion3.2<210>1<211>5<212>PRT<213>小鼠(Musmusculus)<400>1SerTyrTyrIleHis15<210>2<211>17<212>PRT<213>小鼠<220><221>MISCFEATURE<222>(16)..(16)<223>″X″可以是K或Q<400>2ValIleTyrProGlyAsnAspAspIleSerTyrAsnGlnLysPheXaa151015Gly<210>3<211>9<212>PRT<213>小鼠<400>3GluValArgLeuArgTyrPheAspVal15<210>4<211>17<212>PRT<213>小鼠<400>4LysSerSerGlnSerValPhePheSerSerSerGlnLysAsnTyrLeu151015Ala<210>5<211>7<212>PRT<213>小鼠<400>5TrpAlaSerThrArgGluSer15<210>6<211>8<212>PRT<213>小鼠<400>6HisGlnTyrLeuSerSerArgThr15<210>7<211>118<212>PRT<213>小鼠<400>7GlnValGlnLeuGlnGlnProGlyAlaGluValValLysProGlyAla151015SerValLysMetSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrSerTyr202530TyrIleHisTrpIleLysGlnThrProGlyGlnGlyLeuGluTrpVal354045GlyValIleTyrProGlyAsnAspAspIleSerTyrAsnGlnLysPhe505560LysGlyLysAlaThrLeuThrAlaAspLysSerSerThrThrAlaTyr65707580MetGlnLeuSerSerLeuThrSerGluAspSerAlaValTyrTyrCys859095AlaArgGluValArgLeuArgTyrPheAspValTrpGlyAlaGlyThr100105110ThrValThrValSerSer115<210>8<211>113<212>PRT<213>小鼠<400>8AsnIleMetLeuThrGlnSerProSerSerLeuAlaValSerAlaGly151015GluLysValThrMetSerCysLysSerSerGlnSerValPhePheSer202530SerSerGlnLysAsnTyrLeuAlaTrpTyrGlnGlnIleProGlyGln354045SerProLysLeuLeuIleTyrTrpAlaSerThrArgGluSerGlyVal505560ProAspArgPheThrGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThr65707580IleSerSerValGlnSerGluAspLeuAlaIleTyrTyrCysHisGln859095TyrLeuSerSerArgThrPheGlyGlyGlyThrLysLeuGluIleLys100105110Arg<210>9<211>118<212>PRT<213>人工序列<220><223>人源化My9-6抗体重链可变区<400>9GlnValGlnLeuGlnGlnProGlyAlaGluValValLysProGlyAla151015SerValLysMetSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrSerTyr202530TyrIleHisTrpIleLysGlnThrProGlyGlnGlyLeuGluTrpVal354045GlyValIleTyrProGlyAshAspAspIleSerTyrAshGlnLysPhe505560GlnGlyLysAlaThrLeuThrAlaAspLysSerSerThrThrAlaTyr65707580MetGlnLeuSerSerLeuThrSerGluAspSerAlaValTyrTyrCys859095AlaArgGluValArgLeuArgTyrPheAspValTrpGlyGlnGlyThr100105110ThrValThrValSerSer115<210>10<211>113<212>PRT<213>人工序列<220><223>人源化My9-6抗体轻链可变区<400>10GluIleValLeuThrGlnSerProGlySerLeuAlaValSerProGly151015GluArgValThrMetSerCysLysSerSerGlnSerValPhePheSer202530SerSerGlnLysAsnTyrLeuAlaTrpTyrGlnGlnIleProGlyGln354045SerProArgLeuLeuIleTyrTrpAlaSerThrArgGluSerGlyVal505560ProAspArgPheThrGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThr65707580IleSerSerValGlnProGluAspLeuAlaIleTyrTyrCysHisGln859095TyrLeuSerSerArgThrPheGlyGlnGlyThrLysLeuGluIleLys100105110Arg<210>11<211>46<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物HindKL<400>11tatagagctcaagcttggatggtgggaagatggatacagttggtgc46<210>12<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物Bg12IgG1<400>12ggaagatctatagacagatgggggtgtcgttttggc36<210>13<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物EcoPolydC<400>13tatatctagaattccccccccccccccccc30<210>14<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物Sac1MK<400>14gggagctcgayattgtgmtsacmcarwctmca32<210>15<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物EcoR1MH1<220><221>misc_feature<222>(18)..(18)<223>″n″可以是任何核苷酸<400>15cttccggaattcsargtnmagctgsagsagtc32<210>16<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物EcoR1MH2<220><221>misc_feature<222>(18)..(18)<223>″n″可以是任何核苷酸<400>16cttccggaattcsargtnmagctgsagsagtcwgg35<210>17<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>简并引物Leaddeg1<220><221>misc_feature<222>(26)..(26)<223>″n″可以是任何核苷酸<220><221>misc_feature<222>(29)..(29)<223>″n″可以是任何核苷酸<400>17ttttgattctgctgtgggtgtccggnacntgygg34<210>18<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>简并引物Leaddeg2<220><221>misc_feature<222>(28)..(28)<223>″n″可以是任何核苷酸<220><221>misc_feature<222>(31)..(31)<223>″n″可以是任何核苷酸<400>18ttttgattcgctgctgctgctgtgggtnwsngg33<210>19<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>简并引物Leaddeg3<220><221>misc_feature<222>(31)..(31)<223>″n″可以是任何核苷酸<220><221>misc_feature<222>(34)..(34)<223>″n″可以是任何核苷酸<400>19ttttgattcccaggtgttcatgctgctgytnytntgggt39<210>20<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人源化作用引物My96LCBsrG1<400>20tacaggtgtacactccgatattgtgatcacccagactcc39<210>21<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人源化引物My96LCOL1<400>21actggaaatcaaacgaactgtggctgcaccatctg35<210>22<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人源化引物My96LCOL2<400>22gccacagttcgtttgatttccagtttggtgcctcc35<210>23<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人源化引物My96HCBsrG1<400>23tacaggtgtacactcccaggttaagctgcagcagtctgg39<210>24<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人源化引物My96HCOL1<400>24ccacggtcaccgtctcctcagcctccacc29<210>25<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人源化引物My96HCOL2<400>25gaggctgaggagacggtgaccgtggtccc29<210>26<211>43<212>DNA<213>人工序列<220><223>人源化引物My9-6LCNMLS<400>26caggtgtacactccaatattatgctcacccagagtccatcatc43<210>27<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>人源化引物My9-6HCQP<400>27caggtgtacactcccaggttcagctgcagcagcctggggctg42<210>28<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人源化引物MY96HCQ64-1<400>28agaagttccaaggcaaggccac22<210>29<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人源化引物MY96HCQ64-2<400>29cttgccttggaacttctgattg22<210>30<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><223>人源化引物MY96HCQ105<400>30cgatgggcccttggtggaggctgaggagacggtgaccgtggtcccttggccccagacatc60<210>31<211>79<212>DNA<213>人工序列<220><223>人源化引物MY96LCEVGPR<400>31aggtgtacactccgagattgtgctcacccagagt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权利要求1.一种分离的抗体或其抗原决定簇结合片段，包括至少一个互补决定区，所述互补决定区具有选自下列SEQIDNO1-6中的氨基酸序列SYYIH(SEQIDNO1)，VIYPGNDDISYNQKFXG(SEQIDNO2)，其中X是K或Q，EVRLRYFDV(SEQIDNO3)，KSSQSVFFSSSQKNYLA(SEQIDNO4)，WASTRES(SEQIDNO5)，HQYLSSRT(SEQIDNO6)并具有与CD33结合的能力。2.一种抗体或其抗原决定簇结合片段，包括至少一个重链可变区和至少一个轻链可变区，其中所述的重链可变区包括三个互补决定区，所述互补决定区分别具有SEQIDNO1-3所示的氨基酸序列，SYYIH(SEQIDNO1)，VIYPGNDDISYNQKFXG(SEQIDNO2)，其中所述的X是K或Q，EVRLRYFDV(SEQIDNO3)，并且其中所述的轻链可变区包括三个互补决定区，所述互补决定区分别具有SEQIDNO4-6所示的氨基酸序列，KSSQSVFFSSSQKNYLA(SEQIDNO4)，WASTRES(SEQIDNO5)，HQYLSSRT(SEQIDNO6)。3.权利要求2的抗体或其抗原决定簇结合片段，其中所述的重链可变区与SEQIDNO7所示的氨基酸序列QVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFKGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGAGTTVTVSS具有至少90％的序列同一性。4.权利要求2的抗体或其抗原决定簇结合片段，其中所述的重链可变区与SEQIDNO7所示的所述氨基酸序列QVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFKGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGAGTTVTVSS具有至少95％的序列同一性。5.权利要求2的抗体或其抗原决定簇结合片段，其中所述的重链可变区具有SEQIDNO7所示的氨基酸序列QVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFKGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGAGTTVTVSS。6.权利要求2的抗体或其抗原决定簇结合片段，其中所述的轻链可变区与SEQIDNO8所示的氨基酸序列NIMLTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQSEDLAIYYCHQYLSSRTFGGGTKLEIKR具有至少90％的序列同一性。7.权利要求2的抗体或其抗原决定簇结合片段，其中所述的轻链可变区与SEQIDNO8所示的所述氨基酸序列NIMLTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQSEDLAIYYCHQYLSSRTFGGGTKLEIKR具有至少95％的序列同一性。8.权利要求2的抗体或其抗原决定簇结合片段，其中所述的轻链可变区具有SEQIDNO8所示的氨基酸序列NIMLTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQSEDLAIYYCHQYLSSRTFGGGTKLEIKR。9.权利要求2的抗体或其抗原决定簇结合片段，其中所述的重链可变区与SEQIDNO9所示的氨基酸序列QVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFQGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGQGTTVTVSS具有至少90％的序列同一性。10.权利要求2的抗体或其抗原决定簇结合片段，其中所述的重链可变区与SEQIDNO9所示的所述氨基酸序列QVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFQGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGQGTTVTVSS具有至少95％的序列同一性。11.权利要求2的抗体或其抗原决定簇结合片段，其中所述的重链可变区具有SEQIDNO9所示的氨基酸序列QVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFQGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGQGTTVTVSS。12.权利要求2的抗体或抗原决定簇结合片段，其中所述的轻链可变区与SEQIDNO10所示的氨基酸序列EIVLTQSPGSLAVSPGERVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPRLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQPEDLAIYYCHQYLSSRTFGQGTKLEIKR具有至少90％的序列同一性。13.权利要求2的抗体或其抗原决定簇结合片段，其中所述的轻链可变区与SEQIDNO10所示的所述氨基酸序列EIVLTQSPGSLAVSPGERVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPRLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQPEDLAIYYCHQYLSSRTFGQGTKLEIKR具有至少95％的序列同一性。14.权利要求2的抗体或其抗原决定簇结合片段，其中所述的轻链可变区具有SEQIDNO10所示的氨基酸序列EIVLTQSPGSLAVSPGERVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPRLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQPEDLAIYYCHQYLSSRTFGQGTKLEIKR。15.一种与CD33特异性结合的纯化的抗体或其抗原决定簇结合片段，其中所述抗体或抗原决定簇结合片段的重链可变区部分具有SEQIDNO7所示的氨基酸序列QVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFKGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGAGTTVTVSS，且其中所述抗体或抗原决定簇结合片段的轻链可变区部分具有SEQIDNO8所示的氨基酸序列NIMLTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQSEDLAIYYCHQYLSSRTFGGGTKLEIKR。16.一种与CD33特异性结合的人源化或表面重整抗体，或其抗原决定簇结合片段，其中所述抗体或抗原决定簇结合片段的重链可变区部分具有SEQIDNO9所示的氨基酸序列QVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFQGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGQGTTVTVSS，且其中所述抗体或抗原决定簇结合片段的轻链可变区具有SEQIDNO10所示的氨基酸序列EIVLTQSPGSLAVSPGERVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPRLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQPEDLAIYYCHQYLSSRTFGQGTKLEIKR。17.一种免疫偶联物，包括与药物或前体药物连接的权利要求1所述的抗体或其抗原决定簇结合片段。18.一种免疫偶联物，包括与药物或前体药物连接的权利要求2所述的抗体或其抗原决定簇结合片段。19.权利要求17的免疫偶联物，其中所述的药物或前体药物选自美登木素生物碱、紫杉醇、CC-1065、CC-1065类似物、海兔毒肽、海兔毒肽类似物、氨甲喋呤，道诺红菌素、阿霉素，长春花新碱、长春花碱、苯丙氨酸氮芥、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、加利车霉素及它们的衍生物。20.权利要求18的免疫偶联物，其中所述的药物或前体药物选自美登木素生物碱、紫杉醇、CC-1065、CC-1065类似物、海兔毒肽、海兔毒肽类似物、氨甲喋呤、道诺红菌素、阿霉素，长春花新碱、长春花碱、苯丙氨酸氮芥、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、加利车霉素及它们的衍生物。21.一种组合物，包括权利要求1所述的抗体或其抗原决定簇结合片段和药物或前体药物。22.一种组合物，包括权利要求2所述的抗体或其抗原决定簇结合片段和药物或前体药物。23.一种药学组合物，包括权利要求1所述的抗体或其抗原决定簇结合片段，以及药学上可接受试剂。24.一种药学组合物，包括权利要求2所述的抗体或其抗原决定簇结合片段，以及药学上可接受试剂。25.一种药学组合物，包括权利要求17所述的免疫偶联物，以及药学上可接受试剂。26.一种药学组合物，包括权利要求18所述的免疫偶联物，以及药学上可接受试剂。27.一种药学组合物，包括权利要求21所述的组合物，以及药学上可接受试剂。28.一种药学组合物，包括权利要求22所述的组合物，以及药学上可接受试剂。29.一种诊断试剂，包括权利要求1所述的抗体，其中所述的抗体或抗体片段是被标记的。30.一种诊断试剂，包括权利要求2所述的抗体，其中所述的抗体或抗体片段是被标记的。31.权利要求29的诊断试剂，其中所述的标记选自生物素标记，酶标记，放射性标记，荧光基团，发色团，显影剂和金属离子。32.权利要求30的诊断试剂，其中所述的标记选自生物素标记，酶标记，放射性标记，荧光基团，发色团，显影剂和金属离子。33.一种抑制表达CD33的细胞之生长的方法，包括将所述的细胞与权利要求1或2所述的抗体或其抗原决定簇结合片段接触。34.一种抑制表达CD33的细胞之生长的方法，包括将所述的细胞与权利要求17或18所述的免疫偶联物接触。35.一种抑制表达CD33的细胞之生长的方法，包括将所述的细胞与权利要求21或22所述的组合物接触。36.一种抑制表达CD33的细胞之生长的方法，包括将所述的细胞与选自权利要求23至28所述的药学组合物接触。37.一种治疗患有其中表达CD33的疾病的受试对象的方法，包括给予所述受试对象有效量的权利要求1或2所述的抗体或其抗原决定簇结合片段。38.一种治疗患有其中表达CD33的疾病的受试对象的方法，包括给予所述受试对象有效量的权利要求17或18所述的免疫偶联物。39.一种治疗患有其中表达CD33的疾病的受试对象的方法，包括给予所述受试对象有效量的权利要求21或22所述的组合物。40.一种治疗患有其中表达CD33的疾病的受试对象的方法，包括给予所述受试对象有效量的权利要求23或24所述的药学组合物。41.一种治疗患有其中表达CD33的疾病的受试对象的方法，包括给予所述受试对象有效量的权利要求25或26所述的药学组合物。42.一种治疗患有其中表达CD33的疾病的受试对象的方法，包括给予所述受试对象有效量的权利要求27或28所述的药学组合物。43.一种治疗患有其中表达CD33的疾病的受试对象的方法，包括将所述受试对象的一个或多个细胞离体接触有效量的权利要求1或2所述的抗体或其抗原决定簇结合片段。44.一种治疗患有其中表达CD33的疾病的受试对象的方法，包括将所述受试对象的一个或多个细胞离体接触有效量的权利要求17或18所述的免疫偶联物。45.一种治疗患有其中表达CD33的疾病的受试对象的方法，包括将所述受试对象的一个或多个细胞离体接触有效量的权利要求21或22所述的组合物。46.一种治疗患有其中表达CD33的疾病的受试对象的方法，包括将所述受试对象的一个或多个细胞离体接触有效量的选自权利要求23至28所述的药学组合物。47.权利要求37中的治疗方法，其中所述疾病选自骨髓增生异常综合症(MDS)，急性髓性白血病(AML)，慢性髓性白血病(CML)和前髓细胞性白血病(PML)。48.权利要求38中的治疗方法，其中所述的疾病选自骨髓增生异常综合症(MDS)，急性髓性白血病(AML)，慢性髓性白血病(CML)和前髓细胞性白血病(PML)。49.权利要求39中的治疗方法，其中所述的疾病选自骨髓增生异常综合症(MDS)，急性髓性白血病(AML)，慢性髓性白血病(CML)和前髓细胞性白血病(PML)。50.权利要求40中的治疗方法，其中所述的疾病选自骨髓增生异常综合症(MDS)，急性髓性白血病(AML)，慢性髓性白血病(CML)和前髓细胞性白血病(PML)。51.权利要求41中的治疗方法，其中所述的疾病选自骨髓增生异常综合症(MDS)，急性髓性白血病(AML)，慢性髓性白血病(CML)和前髓细胞性白血病(PML)。52.权利要求42中的治疗方法，其中所述的疾病选自骨髓增生异常综合症(MDS)，急性髓性白血病(AML)，慢性髓性白血病(CML)和前髓细胞性白血病(PML)。53.权利要求43中的治疗方法，其中所述的疾病选自骨髓增生异常综合症(MDS)，急性髓性白血病(AML)，慢性髓性白血病(CML)和前髓细胞性白血病(PML)。54.权利要求44中的治疗方法，其中所述的疾病选自骨髓增生异常综合症(MDS)，急性髓性白血病(AML)，慢性髓性白血病(CML)和前髓细胞性白血病(PML)。55.权利要求45中的治疗方法，其中所述的疾病选自骨髓增生异常综合症(MDS)，急性髓性白血病(AML)，慢性髓性白血病(CML)和前髓细胞性白血病(PML)。56.权利要求46中的治疗方法，其中所述的疾病选自骨髓增生异常综合症(MDS)，急性髓性白血病(AML)，慢性髓性白血病(CML)和前髓细胞性白血病(PML)。57.一种测定生物样品中是否含有骨髓性癌细胞的方法，包括(a)将所述的生物样品与权利要求29或30所述的诊断试剂接触，和(b)检测所述试剂在所述样品内的分布。58.权利要求57的诊断方法，其中所述癌症选自急性髓性白血病(AML)，慢性髓性白血病(CML)和前髓细胞性白血病(PML)。59.一种特异性结合CD33的改良抗体或其抗原决定簇结合片段，所述的改良抗体或抗体片段如下制备(a)提供DNA，编码抗体或其抗原决定簇结合片段，其包括SEQIDNO7和SEQIDNO8中的至少一个；(b)将至少一个核苷酸突变、删除、插入或添加引入到所述DNA中，以致由所述DNA编码的所述抗体或抗原决定簇结合片段的氨基酸序列被改变；(c)表达所述抗体或抗原决定簇结合片段；(d)筛选所述被表达抗体或抗原决定簇结合片段的所述改良，从而制备改良抗体或抗原决定簇结合片段。60.一种特异性结合CD33的改良抗体或其抗原决定簇结合片段，所述的改良抗体或抗体片段如下制备(a)提供DNA，编码抗体或其抗原决定簇结合片段，其包括SEQIDNO9和SEQIDNO10中的至少一个，(b)将至少一个核苷酸突变、删除、插入或添加引入到所述的DNA中，以致由所述DNA编码的所述抗体或抗原决定簇结合片段的氨基酸序列被改变；(c)表达所述抗体或抗原决定簇结合片段；(d)筛选所述被表达抗体或抗原决定簇结合片段的所述改良，从而制备改良抗体或抗原决定簇结合片段。61.权利要求59或60的改良抗体或抗体片段，其中所述的改良是对CD33的亲和性增加。62.权利要求59或60的改良抗体或抗体片段，其中所述的至少一个核苷酸突变、删除、插入或添加可通过选自下列的方法来完成寡核苷酸介导的定点诱变、盒式诱变、易错PCR、DNA改组和应用大肠杆菌增变株。63.一种分离的多核苷酸，编码权利要求1或2所述的抗体或其抗原决定簇结合片段。64.一种分离的多核苷酸，编码权利要求1或2所述的抗体或其抗原决定簇结合片段的轻链或重链。65.一种重组载体，含有权利要求63所述的多核苷酸。66.一种重组载体，含有权利要求64所述的多核苷酸。67.一种宿主细胞，用权利要求65所述的重组载体转化。68.一种宿主细胞，用权利要求66所述的重组载体转化。69.一种用于产生具有结合CD33能力的抗体或其抗原决定簇结合片段的方法，所述方法包括(a)培养一种权利要求67所要求保护的宿主细胞，在所述宿主细胞表达抗体或抗原决定簇结合片段的条件下，和(b)收集如此表达的抗体或抗原决定簇结合片段。70.一种用于产生具有结合CD33能力的抗体或其抗原决定簇结合片段的方法，所述的方法包括(a)培养权利要求68的宿主细胞，在所述宿主细胞可表达抗体或抗原决定簇结合片段的条件下，和(b)收集如此表达的抗体或抗原决定簇结合片段。71.一种用于从生物材料中获得CD33的方法，所述方法包括(a)将生物材料与权利要求1或2所述的抗体或抗原决定簇结合片段接触，(b)允许权利要求1或2所述的抗体或抗原决定簇结合片段与所述生物材料中的CD33结合，和(c)从该生物材料中分离与CD33结合的抗体或抗原决定簇结合片段，从而从生物材料中获得CD33。全文摘要本发明涉及结合CD33的抗体。更特别地是，本发明涉及抗CD33抗体，所述抗体的片段和同源物，所述抗体的人源化和表面重整形式，所述抗体的功能等价物和改良形式，含有所述抗体的免疫偶联物和组合物，及其在诊断、研究和治疗中的应用。本发明也涉及编码该抗体的多核苷酸，含有该多核苷酸的载体，用多核苷酸转化的宿主细胞，以及制备该抗体的方法。文档编号C07K16/46GK1795009SQ200380102406公开日2006年6月28日申请日期2003年11月5日优先权日2002年11月7日发明者M·G·霍费,D·塔瓦雷斯,R·J·卢茨申请人:伊谬诺金公司