专利名称：锝络合物和靶标部分的共轭体及其在mri诊断中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及改进的99mTc射电金属络合物组合物，含它们的放射性药物制剂，和制备这种放射性药物的试剂盒。
背景技术：
US 5395608公开了许多潜在的五配位氮杂二胺二肟配体，用于制备各种各样放射性同位素的射电金属络合物，包括99mTc，105Rh，109Pd，87Co，186Re，188Re，97Ru，111In，113mIn，67Ga和68Ga，其公开了具有悬垂芳基间隔基的双官能氮杂二胺二肟配体，并且US 5395608的实施例3描述了下式A的化合物 式A其中，Ar＝4-氨基苄基。
US 5395608从广义上描述了这种螯合剂的放射性标记，但是在用射电金属99mTc标记方面没有提供任何具体的实施例。
Pillai等人[J.Nucl.Med.Biol.，527-31(1994)]描述了式A的氮杂二胺二肟类似物的99mTc标记，其中Ar是苄基。所述99mTc标记是在室温下进行的，HPLC记录图表明只有单一的99mTc物种。没有描述过氮杂二胺二肟与靶分子的共轭体。
WO 99/60018公开了用于血栓成像的氮杂二胺二肟配体与肽的螯合剂共轭体。所述肽是转谷酰胺酶(即因子XIIIa)的底物。据认为，这种螯合剂共轭体中优选的是下式的氮杂二胺二肟 其中肽是α2-抗血纤维蛋白溶酶或酪蛋白的片段。
发明内容
现在已经发现，这种氮杂二胺二肟-靶分子螯合剂共轭体的锝金属络合化学可以产生许多锝物种。本发明提供改进的氮杂二胺二肟共轭体锝金属络合物组合物，其中不太希望的锝物种受到了抑制。
因此，已经发现，氮杂二胺二肟螯合剂共轭体在与xTc螯合时能形成若干锝物种(其中x＝94m，99或99m)。这些多重的xTc金属络合物物种可以通过色谱法分离和检测。多重锝物种中的一些是动力学产物，即不稳定的物种，它们在一定的期间内(任选通过加热)会转化形成稳定的产物。从动力学有利的(不稳定的)络合物转化为最终物种的速率依赖于pH值在pH值为9.5时需要2-3小时，而在pH值为10.5时，通常60分钟就足够了。反应可以通过加热促进。也已经发现，多重xTc络合物物种中的一些是亲脂性的，可能会对放射药物的生物分布造成不利影响。本发明提供锝络合物组合物，其中这些动力学和亲脂性物种的量被降到最低程度并且得到控制，从而改善了总的成像特性。本发明还提供最优化向希望的稳定产物转化的方法，以便制备出受控的xTc络合物产品组合物，并以更快和可重现的方式对质量进行控制。
本发明还提供包括改进的锝络合物组合物的放射性药物，和用于制备所述放射性药物的非放射性试剂盒制剂。
发明详述第一方面，本发明提供锝络合物组合物，其包括金属放射性同位素xTc与下式(I)的配体的金属络合物 其中每一个R1和R2独立地为R基团；x是94m，99或99m；Y是-(A)n-Z，其中Z是分子量低于5,000的生物靶标部分；-(A)n-是连接基，其中每一个A独立地为-CO-，-CR2-，-CR＝CR-，-C≡C-，-CR2CO2-，-CO2CR2-，-NR-NRCO-，-CONR-，-NR(C＝O)NR-，-NR(C＝S)NR-，-SO2NR-，-NRSO2-，-CR2OCR2-，-CR2SCR2-，-CR2NRCR2-，C4-8环杂亚烷基，C4-8环亚烷基，C5-12亚芳基，或C3-12杂亚芳基，或者是聚亚烷基二醇，聚乳酸或聚乙醇酸部分；n是0-10的整数；每一个R基团独立地为H或C1-10烷基，C3-10烷基芳基，C2-10烷氧基烷基，C1-10羟烷基，C1-10氟烷基，或者两个或多个R基团与它们所连接的原子一起形成碳环、杂环、饱和或不饱和的环；其中存在于锝络合物组合物中的不到10％的xTc包括式I配体的不稳定xTc络合物。
因此，适当的本发明的放射性同位素xTc是阳电子辐射体94mTc，β射线发射体99Tc，或γ射线发射体99mTc。优选，x是99m，即放射性同位素优选为99mTc。
术语“配体”意思是指氮杂二胺二肟螯合剂与生物靶分子(Z)的共轭体。配体被设计成能形成与生物靶分子共轭的放射性同位素xTc的氮杂二胺二肟金属络合物。
术语“生物靶标部分”意思是指3-100链节的肽或肽类似物，其可以是直链肽或环状肽或其组合；或者是酶底物或抑制剂；合成受体载体；低聚核苷酸，或低聚DNA或低聚RNA片段。生物靶标部分可以是合成或天然来源，但是优选合成来源。适当的本发明的生物靶标部分，其分子量低于5,000道尔顿，优选在200-3000道尔顿范围内，最优选在300-2000道尔顿范围内，尤其优选400-1500。
术语“环状肽”意思是指5-15个的氨基酸序列，其中两端的氨基酸通过共价键键连在一起，所述共价键可以是肽或二硫化物键，或者是合成的非肽键如硫醚、磷酸二酯、二硅氧烷或尿烷键。
术语“氨基酸”意思是指L-或D-氨基酸、氨基酸类似物或氨基酸模拟物，其可以是天然存在的或纯合成来源，并且可以是光学纯的，即单一的对映异构体，因此可以是手性的，或是对映异构体的混合物。优选，本发明的氨基酸是光学纯的。术语“氨基酸模拟物”意思是指天然存在的氨基酸的合成类似物，其是同电子排列体，即被设计成能模拟天然化合物的空间和电子结构。这种同电子排列体对本领域技术人员是众所周知的，包括但不局限于缩肽，retro-inverso肽，硫酰胺，环烷烃或1，5-二取代的四唑[参见M.Goodman，Biopolymers，24，137，(1985)]。
适当的酶底物或抑制剂包括葡萄糖和葡萄糖类似物如氟去氧葡萄糖，脂肪酸或弹性蛋白酶抑制剂。适当的酶底物或抑制剂可以是生物靶肽(如下所述)。
适当的合成受体结合化合物包括雌二醇，雌激素，孕酮，黄体酮及其它甾体激素；用于多巴胺D-1或D-2受体的配体，或多巴胺输送器如托烷；和用于血清素受体的配体。
适当的本发明的生物靶肽是3-20链节的肽(即包括3-20个氨基酸的肽)，优选4-15链节，最优选5-14链节这种片段。所述肽可以是环状的或直链的或者是其组合。所述肽可以是合成或天然来源，但是优选合成来源。这种肽包括-生长激素释放抑制激素，octreotide和类似物，
-层粘连蛋白片段，如YIGSR，PDSGR，IKVAV，LRE和KCQAGTFALRGDPQG，-用于白血球聚集靶点的N-甲酰基肽，-血小板因子4(PF4)的片段，-含RGD的肽，-α2-抗血纤维蛋白溶酶、粘连蛋白或β-酪蛋白、纤维蛋白原或凝血栓蛋白的肽片段，其是转谷酰胺酶(因子XIIIa)的底物。α2-抗血纤维蛋白溶酶、粘连蛋白、β-酪蛋白、纤维蛋白原和凝血栓蛋白的氨基酸序列可以参见以下文献α2-抗血纤维蛋白酶前体[M.Tone等人，J.Biochem，102，1033，(1987)]；β-酪蛋白[L.Hansson等人，Gene，139，193，(1994)]；粘连蛋白[A.Gutman等人，FEBS Lett.，207，145，(1996)]；凝血栓蛋白-1前体[V.Dixit等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，83，5449，(1986)]；R.F.Doolittle，Ann.Rev.Biochem.，53，195，(1984)。
当生物靶标部分是肽时，肽的一个或两个端可以任选用适当的代谢抑制基团保护。术语“代谢抑制基团”意思是指抑制或制止在氨基或羧基末端的肽或氨基酸的体内代谢的生物相容基团。这种基团对于本领域技术人员来说是众所周知的，并且在用于肽胺末端时适当地选自乙酰基，Boc(其中Boc是叔丁氧羰基)，Fmoc(其中Fmoc是芴基甲氧基羰基)，苄氧羰基，三氟乙酰基，烯丙基氧羰基，Dde[即，1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己基)乙基]或Npys(即，3-硝基-2-吡啶氧硫基)。对肽胺末端代谢的抑制也可以通过将胺末端连接到氮杂二胺二肟螯合剂上而实现。用于肽羧基末端的适当的代谢抑制基团包括羧酰胺，叔丁基酯，苄基酯，环己基酯，氨基醇或连接到氮杂二胺二肟螯合剂上。优选，选择的至少一个代谢抑制基团是氮杂二胺二肟螯合剂。
肽的羧基末端特别容易被羧肽酶体内解离。因而，氮杂二胺二肟螯合剂优选连接在羧基末端上。当肽包括环状肽时，代谢抑制基团可以是关闭环状肽环的共价键。
本发明优选的生物靶肽是3-20链节的α2-抗血纤维蛋白溶酶或酪蛋白的肽片段，最优选4-15链节，尤其是5-14链节这种片段。本发明优选的α2-抗血纤维蛋白溶酶或者酪蛋白肽包括至少一个代谢抑制基团，和取自以下所述任一个N-末端的氨基酸序列(i)α2-抗血纤维蛋白溶酶，即，NH2-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Ser-Pro-Leu-Thr-Leu-Thr-Leu-Leu-Lys-OH或其变体，其中一个或多个氨基酸已经发生了交换、添加或被脱除如NH2-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Ser-Pro-Leu-Thr-Leu-Thr-Leu-Leu-Lys-Gly-OH，NH2-Asn-Gln-Glu-Ala-Val-Ser-Pro-Leu-Thr-Leu-Thr-Leu-Leu-Lys-Gly-OH，NH2-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Gly-OH；或(ii)酪蛋白，即，Ac-Leu-Gly-Pro-Gly-Gln-Ser-Lys-Val-Ile-Gly。
本发明特别优选的α2-抗血纤维蛋白溶酶肽是包括4个氨基酸序列Asn-Gln-Glu-Gln的肽片段(NQEQ)。最优选的这种α2-抗血纤维蛋白溶酶肽具有如下序列Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Ser-Pro-Xaa-Thr-Leu-Leu-Lys-Gly，其中Xaa是Tyr或I-Tyr(即碘代酪氨酸)。
这种优选的α2-抗血纤维蛋白溶酶肽优选在两个肽末端都具有代谢抑制基团，其中氮杂二胺二肟是代谢抑制基团中的一个。在这种情况下，氮杂二胺二肟螯合剂优选连接在羧基的末端，并且用代谢抑制基团，优选N-乙酰基将N-末端保护，以使α2-抗血纤维蛋白溶酶肽优选为Ac-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Ser-Pro-Xaa-Thr-Leu-Leu-Lys-Gly，其中Xaa是Tyr或I-Tyr(即碘代酪氨酸)。
术语“氟烷基”意思是指具有至少一个氟取代基的烷基，即该术语包含从单氟烷基(例如-CH2F)到全氟烷基(例如CF3)的基团。
本发明人已经发现，除了希望的锝物种之外，氮杂二胺二肟配体形成其他的锝络合物，这些络合物被分类为式I配体的不稳定xTc络合物。本发明的锝络合物组合物的特征在于，在锝络合物组合物中存在的小于10％的xTc包括式I配体的不稳定的xTc络合物。这些“不稳定的xTc络合物”是与式I配体形成的动力学有利的锝金属络合反应产物。它们性质上是不稳定的，在环境条件下会慢慢地转化为希望的热力学稳定的最终化学络合反应产物。不稳定的xTc络合物的化学结构还是未知的，但是它们被认为涉及到式(I)配体的-NY-部分的桥头氮原子与锝的配位。这种配位或许将涉及氮杂二胺二肟配体，该配体或者用作五配位配体(即具有二肟三胺给体型)，或者用作四配位螯合剂，其中在具有单氧核(即Tc＝O3+核)的锝(V)络合物中有一个未配位的肟基。这种通过桥头氮原子进行的配位，当-NY-氮原子配位时，与其中-NY-氮原子不配位的热力学产物的8-环大小的螯形环相比，将由于较小的5-环螯形环而对动力学有利。
尤其是对于放射性药物应用来说，显然，不希望存在随着时间的推移精确组成发生变化的多重锝物种，因为难以实现给药的重复性，并且每一种物种都可能具有不同的生物分布特性。因此，本发明提供用于控制不稳定锝络合物量的方法，这样的话，将会得到最高纯度的希望的热力学产物。我们相信，希望的氮杂二胺二肟配体锝络合物的热力学产物具有以下结构 其中R1、R2和Y定义如上；即，Tc(V)二氧代络合物，其中氮杂二胺二肟配体具有二胺二肟金属给体类型，在这种情况下，-NY-基团的氮不参与配位。与不稳定的xTc络合物相比，假大环环状结构被认为能给与热力学稳定性。当Y的性质使得-NY-中的N原子是叔胺时，那么相当比例的这种叔胺在pH值低于9.0的水溶液中，会由于叔胺的碱度而被质子化(pKa值通常在8-10范围内)。
本发明人已经发现，除了希望的锝物种和不稳定的xTc络合物之外，氮杂二胺二肟配体还可能形成其他的锝络合物，这种锝络合物被分类为亲脂性锝络合物，而且这种亲脂性络合物可能会对xTc组合物的生物分布造成不利影响。术语“亲脂性锝络合物”意思是指锝与式I配体的氮杂二胺二肟金属配位络合物，与希望的氮杂二胺二肟的热力学锝络合物相比，具有明显更大的辛醇水分配系数。这种“亲脂性锝络合物”在C18反相HPLC中，当在流动相中使用最高达50％的有机溶剂时，将强有力地结合到固定相上。因此，当组合物中存在这种“亲脂性锝络合物”时，需要使用有机物含量至少70％，优选至少90％的水/有机溶剂流动相以使它们在反相HPLC分析中能从色谱柱中洗脱出来。
我们相信，当在包括由合成弹性体橡胶制成的塞子的药物管瓶或容器中制备式I的亲脂性配体，和当生物靶分子(Z)包括反应性亲核基团如含胺化合物，特别是具有伯或仲胺的含胺化合物(例如肽的赖氨酸残基)、硫醇(例如肽半胱氨酸残基)、或酚(例如肽的酪氨酸残基)时，尤其有可能能观察到这种“亲脂性锝络合物”。在这种情况下，来自于合成橡胶的挥发性非极性可溶出物可以在真空下从人造塞中脱除出来，并在冷的冷冻干燥柱塞中冷凝。之后，淋溶出来的化合物会与靶分子的亲核基团发生化学反应，导致形成更亲脂性的Z的衍生物。这种化学反应在碱性pH值下有利，其中亲核基团的反应活性相对较高(即，与质子化的胺相反，胺是游离的，或者存在更多的硫醇盐或酚盐物种)。当进行xTc放射性标记时，结果是会观察到“亲脂性锝络合物”杂质。在冷冻干燥过程中从合成橡胶塞中淋溶出许多挥发性的非极性可溶出物是已知的[参见Jahnke等人，Int.J.Pharmaceut.，77，47-55(1991)和J.Parent.Sci.Technol.，44(5)，282-288(1990)]，但是这些可溶出物对于放射性药物的影响事先却从来没有人报道过。在加热过程，如在用于杀菌的高压蒸煮过程中，可能出现这种塞子溶出物，这种现象也是已知的[参见例如，Danielson，J.Parent.Sci.Technol.，46(2)，43-47(1992)]，因此，我们相信，在其他情况下也有可能存在生物靶分子(Z)与这种可溶出物之间的反应，尽管冷冻干燥是最坏的情况。
因此，当在具有人造塞子的管瓶或容器中制备锝络合物组合物，特别是当使用冷冻干燥-比如以下第三实施方案的试剂盒时，这种“亲脂性锝络合物”尤其有问题。本发明提供通过适当选择塞子材料和试剂盒配方而抑制或控制“亲脂性锝络合物”的方法。
优选的本发明的锝络合物组合物是这样的，即，其中除了抑制量的不稳定xTc络合物之外，锝络合物组合物中存在的低于5％的xTc包括如上定义的亲脂性xTc络合物。优选，本发明的锝络合物组合物是，其中，锝络合物组合物中存在的低于3％的xTc包括亲脂性xTc络合物。最优选，这些亲脂性xTc络合物的量低于2％，特别优选低于1％，理想的是低于0.5％。
本发明表明，式I配体的亲脂性xTc络合物在体内显示出不希望的肝脏吸收和血液保留。把肝脏吸收量降到最低是很重要的，因为肝脏是放射性药物成像的重要背景器官-特别是对于肺或心脏成像来说。当靶分子(Z)被设计成将肺内血栓如肺栓子(PE)作为靶点时，用于成像的潜力还将受到器官中的放射性和血凝块周围组织(即，肺、心脏、血液和肝脏)的影响。
本发明的各种锝氮杂二胺二肟络合物可以通过适当的色谱法，如HPLC，特别是反相HPLC，即RP-HPLC分离和检测。之前的研究人员并没有认识到这些亲脂性和动力学物种的存在。因此，例如，最初的氮杂二胺二肟与抗血纤维蛋白酶肽的共轭体的HPLC和ITLC分析认为，标称纯度大于90％，即达到令人满意的纯度。后续的生物分布研究表明，在肝脏中有大量的残留，这与被测量的放射化学杂质不一致。所述杂质包括RHT(还原水解的锝)，众所周知这显示的是肝脏的吸收。RHT是通过ITLC检测到的不变物种。此外，分辨能力更强的色谱分析证实了本发明的多重物种。
在使用RP-HPLC时，不稳定xTc络合物显示出的保留时间低于热力学产物的，而亲脂性络合物则显示比热力学产物更长的保留时间。因此，通过使用峰大小进行定量分析，所属技术领域的专业人员可以很容易地监测出，给定的xTc络合反应是否已经完成，并且可以检测出存在的亲脂性xTc锝络合物的量。通过在环境温度(18-25℃)下延长络合反应时间，或者如本发明所教导，随后在更高的温度下进行加热，对于给定的体系来说，可以很容易地形成希望的热力学xTc络合物产物的基准试样。然后，可以用这种基准试样来识别对于所用特定色谱体系观察到的峰。
术语“logP”具有其标准含义，即，辛醇/水分配系数(P)的常用对数(以10为基础)。对许多有机化合物来说，这种辛醇-水分配系数都已公开，并且可以通过许多方法测定，如直接测量法[用99mTc络合物，参见A.R.Ketring等人，Int.J.Nucl.Med.Biol.，11，113-119(1984)]，或色谱法[A.Hoepping等人，Bioorg.Med.Chem.，6，1663-1672(1998)]。优选的测定方法是用已知的标准校准色谱体系以便可以使保留时间与logP相关联。这样做的好处在于，可以同时测定物种的混合物。
本发明优选的锝络合物是对称的，即，使式(I)配体的-NY-部分上的两个-CR22R22NHCR12C(＝N-OH)R1取代基相同。这样做的好处是，锝络合物不包含手性中心，因为这种中心可能会导致形成非对映的锝络合物，并可能需要对特定的异构体进行纯化。
在本发明的氮杂二胺二肟锝络合物中，优选至少一个R2基团是H，更优选所有的R2基团都是H。每一个R1均优选选自C1-3烷基，C2-4烷氧基烷基，C1-3羟烷基，或C1-3氟烷基，最优选C1-3烷基或C1-3氟烷基。特别优选所有的R1均为CH3。
当本发明的锝络合物包括R基团，其中两个或更多个R基团与它们所连接的原子一起形成碳环、杂环、饱和或不饱和环时，优选这种环为3-6元环，特别是5-或6-元环。最优选这种环是饱和碳环。优选的碳环是其中连接到相同或者相邻碳原子上的2个R1基团结合形成3-6元，特别是5-或6-元饱和环的那些碳环。
本发明特别优选的氮杂二胺二肟锝络合物组合物是具有下式(II)配体的那些
其中，每一个R1独立地选自C1-3烷基或C1-3氟烷基，p是0-3的整数，Z定义如式I。因此，在式II中，Y是-CH2CH2(A)pZ。优选的式(II)配体是如上所述对称的配体。
预计，连接基-(A)n-的作用是使在金属配位时形成的相对庞大的锝络合物与生物靶标部分的活性点(Z)隔开，以便例如不损害受体的结合。这可以通过弹性组合(例如简单的烷基链)来实现，从而使庞大的基团具有本身位于远离活性点的自由和/或具有刚性，比如环烷基或芳基间隔基，它们将金属络合物的取向定在远离活性点的方向上。连接基的性质还可以用来改性所得共轭体的锝络合物的生物分布。因此，例如，在连接基中引入醚基有助于把血浆蛋白的结合减到最小，或者是，使用聚合物连接基如聚亚烷基二醇，特别是PEG(聚乙二醇)可以有助于延长药剂在体内血液中的有效期限。
优选的连接基-(A)n-，其主链(即组成-(A)n-部分的连接原子)包含2-10个原子，最优选2-5个原子，特别优选2或3个原子。主链为2个原子的最短的连接基，其优点是氮杂二胺二肟螯合剂能很好地与生物靶标部分分离开来以便将任何的相互作用减到最小。另外的优点是Z基团潜在的螯形环大小是如此的大(对于2原子连接基链来说至少是8元环)，以致于这些基团不可能有效地与氮杂二胺二肟和xTc的配位进行竞争。通过这种方式，使得在这一类型的共轭体中，生物靶标部分的生物靶向特征与氮杂二胺二肟螯合剂的金属络合能力两个方面同时得到保持。非常优选，生物靶标部分Z结合到氮杂二胺二肟螯合剂上的方式使得该键在血液中不容易进行代谢。那是因为这种代谢将导致xTc金属络合物在标记的生物靶标部分到达希望的体内目标点之前发生裂解。因此，生物靶标部分优选通过不容易发生代谢的-(A)n-连接基共价结合到本发明的xTc金属络合物上。适当的这种键是碳-碳键，酰胺键，脲或硫脲键，或醚键。
非肽连接基如亚烃基或亚芳基具有下列优点，即，与共轭的生物靶标部分之间不存在明显的氢键相互作用，这样的话，连接基不会包缠到生物靶标部分上。优选的亚烃基间隔基基团是-(CH2)q-，其中，q是2-5的整数，优选q是2或3。优选的亚芳基间隔基具有下式结构
其中a和b彼此独立地是0、1或2。
因此，优选的Y基团是-CH2CH2-(A)p-Z，其中p是0-3的整数。当Z是肽时，Y优选为-CH2CH2-(A)p-Z，其中-(A)p-是-CO-或-NR-。当-(A)p-是-NH-时，该基团具有另外的优点，即，它源自对称的中间体N(CH2CH2NH2)3，该中间体是市场上可买到的。具有不同链长的三胺前体需要使用合成策略以使各种胺在化学上区别开来(例如通过保护基)。
优选的式II的氮杂二胺二肟螯合剂优选共轭到上述α2-抗血纤维蛋白溶酶肽(和其优选的实施方案)上。
本发明改进的锝络合物组合物可以通过以下方法制备，即，使适当氧化态的xTc放射性同位素(即99mTc，99Tc或94mTc)与处于溶液中的式(I)或(II)的配体在适当的溶剂中反应，其中，或者(i)在环境温度下延长反应时间；或者(ii)在升高的温度下加热；或者(iii)其组合；以驱动反应趋向希望的热力学xTc络合物产物，并因此将“不稳定xTc络合物”的量减到最小。常见的锝原料是高锝酸盐，即，TcO4-，它是处于Tc(VII)氧化态的锝。高锝酸盐本身不容易地形成金属络合物，因此制备锝络合物时通常需要加入适当的还原剂如亚锡离子，以通过把锝的氧化态还原到较低的氧化态，通常是将Tc(I)还原为Tc(V)而便于络合。溶剂可以是有机物或者含水溶剂，或者是其混合物。当溶剂包括有机溶剂时，该有机溶剂优选为生物相容溶剂，如乙醇或DMSO。优选，所述溶剂是含水的，最优选等渗盐水。为了获得本发明的锝络合物组合物，反应混合物必须在最低50℃的温度下加热至少10分钟的时间。适当的加热条件是，在温度范围50-80℃下加热10-20分钟，优选60-70℃下加热10-15分钟，最优选在60-65℃下加热10-12分钟，理想的是在60℃下加热10分钟。反应介质的pH值适当的是在pH值8.5-9.5范围内，优选8.8-9.0，最优选pH为8.8。加热过程可以使用任何适当的方法，如液体如水或高沸点油(例如聚硅氧烷)的热浴，加热器，加热板或微波辐射，只要可以实现要求的温度控制即可。加热完成之后，或者容许反应混合物冷却到室温，或者可以用有效的冷却(例如冷却液流或气体或水)，或者通过具有整体感应冷却的加热器冷却。
本发明人也已经确定，通过在反应混合物中存在至少一种弱有机酸与生物相容阳离子的盐可以抑制不希望的亲脂性xTc络合物。术语“弱有机酸”意思是指pKa在3-7范围内的有机酸。术语“生物相容的阳离子”意思是指与离子化的带负电的基团形成盐的带正电的反离子，其中所述带正电的反离子也是无毒的，因此适合于对哺乳动物体，特别是人体给药。适当的生物相容的阳离子的实例包括碱金属钠或钾；碱土金属钙和镁；和铵离子。优选的生物相容阳离子是钠和钾，最优选钠。
适当的这种弱有机酸是乙酸，柠檬酸，酒石酸，葡糖酸，葡庚糖酸，苯甲酸，苯酚或者膦酸。因此，适当的盐是乙酸盐，柠檬酸盐，酒石酸盐，葡糖酸盐，葡萄庚糖酸盐，苯甲酸盐，酚盐或者膦酸盐，优选乙酸盐。乙酸盐优选是乙酸钠或乙酸钾，最优选乙酸钠。使用这些盐的另外的优点是，酸阴离子很弱地与锝发生络合(如酒石酸盐，葡糖酸盐或者柠檬酸盐)，并在配体交换或者转螯合过程中被氮杂二胺二肟配体置换。这种条件有助于抑制不希望有的副反应，如锝离子的水解。弱有机酸盐的适当的使用浓度是1-100μmol/ml，优选5-50μmo/ml。
申请人另外还发现，向反应混合物中加入辐射防护剂不仅能稳定之前形成的xTc络合物产物，而且出人意料的是，能促进不稳定的xTc络合物向希望的热力学锝络合物产物转化。这有下列好处，即，可以使用较短的加热时间和/或较低的加热温度。当生物靶标部分热敏到至少某一程度时，这可能是特别有利的。术语“辐射防护剂”意思是指能通过捕获高度反应性的自由基，如由水的射解产生的含氧自由基而抑制降解反应，如氧化还原过程的化合物。
本发明的辐射防护剂适当地选自无菌的氧或空气源；抗坏血酸；对氨基苯甲酸(即，4-氨基苯甲酸或PABA)；龙胆酸(即，2，5-二羟基苯甲酸)和这种酸与如上定义的生物相容阳离子的盐。优选的辐射防护剂是抗坏血酸和对氨基苯甲酸，或者其与生物相容阳离子的盐。特别优选的辐射防护剂是对氨基苯甲酸和其与生物相容阳离子的盐，理想的是对氨基苯甲酸钠。本发明的辐射防护剂是市场上可买到的具有药物级规格的化合物。
本发明人还已经确定，通过选择使用的药物级管瓶塞能影响不希望有的亲脂性xTc络合物的量。这种塞子通常包括溴丁、氯丁或丁基橡胶，或者其混合物，并且我们相信，来自于这些合成橡胶的挥发性淋溶物质(如受阻碍酚性抗氧剂或者酚醛树脂副产物)可以与氮杂二胺二肟螯合物共轭体反应，形成各种水平的亲脂性xTc络合物。我们相信，大部分类型的塞子有这样的问题，只是程度不同而已。因此，塞子的选择也是有助于抑制亲脂性xTc络合物中的一个因素。
本发明锝络合物组合物的制备优选使用如(以下)本发明第三实施方案所述的非放射性试剂盒进行。
用于制备本发明锝络合物组合物的氮杂二胺二肟螯合剂共轭体可以通过使式III的双官能螯合物与生物靶标部分(Z)反应制得 式III其中每一个R1和R2独立地为R基团；E是-(A)n-J，其中J是适合于与Z共轭的官能团；-(A)n-是连接基，其中每一个A独立地为-CO-，-CR2-，-CR＝CR-，-C≡C-，-CR2CO2-，-CO2CR2-，-NR-，-NRCO-，-CONR-，-NR(C＝O)NR-，-NR(C＝S)NR-，-SO2NR-，-NRSO2-，-CR2OCR2-，-CR2SCR2-，-CR2NRCR2-，C4-8环杂亚烷基，C4-8环亚烷基，C5-12亚芳基，或C3-12杂亚芳基，或者是聚亚烷基二醇，聚乳酸或聚乙醇酸部分；
n是0-10的整数；每一个R基团独立地为H或C1-10烷基，C3-10烷基芳基，C2-10烷氧基烷基，C1-10羟烷基，C1-10氟烷基，或者两个或多个R基团与它们所连接的原子一起形成碳环、杂环、饱和或不饱和的环。
术语“适合于共轭的官能团”意思是指这样的官能团，其将与Z的相应的官能团(通常是胺基、羧基或者硫醇基)反应，从而将氮杂二胺二肟螯合剂化学连接到Z上。优选的这种适合于共轭的官能团是-NR5R6，-CO2M，-NCS，-NCO，-SM1，-OM1，马来酰亚胺或者丙烯酰胺，其中R5和R6独立地为R基团或者PG；M是H，生物相容的阳离子，PG或活性酯；M1是H或PG；和PG是保护基。
术语“生物相容的阳离子”定义如上。
术语“保护基”意思指这样的基团，它抑制或者制止不希望有的化学反应，但是却设计成具有充分的反应活性，它在不使分子的其余部分发生化学改性的温和条件下可以从所述官能团上裂解下来。脱保护之后，所述基团可以用来使式III的双官能螯合物共轭到生物靶标部分(Z)上。保护基对本领域技术人员来说是众所周知的，并且当J是-NR5R6时，适当地选自Boc(其中Boc是叔丁氧羰基)，Fmoc(其中Fmoc是芴基甲氧基羰基)，三氟乙酰基，烯丙基氧羰基，Dde[即，1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己基)乙基]或Npys(即，3-硝基-2-吡啶氧硫基)；和当J是-CO2PG时，选自甲酯，叔丁酯，苄酯；当J是-OPG时，适当的保护基是乙酰基，苯甲酰基，三苯甲基或者四丁基二甲基甲硅烷基；当J是-SPG时，适当的保护基是三苯甲基和4-甲氧苄基。另外的保护基的使用参见“Protective Groups in Organic Synthesis”一书，Theorodora W.Greene和Peter G.M.Wuts，(John Wiley &Sons，1991)。
术语“活性酯”意思是指羧酸酯衍生物，其被设计成为较好的离去基团，因此，可以更容易地与生物靶标部分上存在的亲核基团如胺发生反应。适当的活性酯的实例是N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，五氟苯酚，五氟苯硫酚，对硝基酚，羟基苯并三唑和PyBOP(即苯并三唑-1-基-氧三吡咯烷基磷鎓六氟磷酸盐)。
式III的双官能螯合物可以如S.Liu等人所述那样共轭到生物靶标部分(Z)上[Chem.Rev.，99，2235-2268(1999)]。这样，例如，式III的胺官能化的氮杂二胺二肟螯合剂(即J＝-NR5R6)可以通过酰胺键共轭到生物靶标部分(Z)的羧基上。这种偶合可以直接进行(例如使用固相肽合成法)，或者通过本领域已知的适当的中间体，如生物靶标部分的羧基的活化酯进行。做为选择，双官能螯合剂的悬垂胺基可以首先转化为异硫氰酸酯(-NCS)或异氰酸酯(-NCO)基团，它可以通过分别形成硫脲和脲键而共轭到含胺的生物靶标部分上。做为选择，双官能的氮杂二胺二肟螯合剂的悬垂胺基也可以与二酸的一个酸官能团反应，以通过连接基引入末端羧基。带有羧基官能团的双官能螯合剂(即，J＝-CO2M)可以按类似的方式用于通过酰胺键直接偶合到含胺的生物靶标部分上。双官能螯合物也可以带有被设计成能与生物靶标部分上的硫醇基反应形成稳定的硫醚键的基团。这种基团的实例是马来酰亚胺(其可以通过使马来酸酐与相应的胺反应，随后与乙酸酐一起加热来制备)，和丙烯酰胺(其可以通过使烯丙酰氯与胺反应来制备)。
本发明双官能的氮杂二胺二肟螯合剂可以适当地通过式IV化合物的烷基化制备 式IV其中，A，J，R2和n的定义如以上式III，烷基化时或者用(i)适当的氯亚硝基衍生物Cl-C(R1)2-C(＝NO)R1；(ii)式Cl-C(R1)2-C(＝NOH)R1的α-氯代肟；(iii)式Br-C(R1)2-C(＝O)的α-溴酮，随后将二胺二酮产物用羟胺转化为二胺二肟。
路线(i)参见S.Jurisson等人的文章[Inorg.Chem.，26，3576-82(1987)]。氯代亚硝基化合物可以通过用亚硝酰氯(NOCI)处理适当的烯烃得到。氯代亚硝基化合物进一步的合成细节参见Ramalingam K.等人，Synth.Commun.，(1995)，25(5)，743-52；Glaser等人，J.Org.Chem.，(1996)，61(3)，1047-48；Clapp LeallynB.等人，J.Org Chem.，(1971)，36(8)，1169-70；Saito Giulichi等人，Shizen Kagaku，(1995)，47，41-9和Schulz Manfred Z.，Chem，(1981)，21(11)，404-5。路线(iii)参见Nowotnik等人[Tetrahedron，50(29)，8617-8632(1994)]。α-氯代肟可以通过肟化相应的α-氯代酮或醛得到，后者可从市场上买到。α-溴酮也可从市场上买到。
第二方面，本发明提供放射性药物，其包括适合于对人给药的无菌形式的上述氮杂二胺二肟锝络合物组合物。这种放射性药物适当的是装在装有密封件的容器中，这种密封件适合于用皮下注射针进行一次或多次穿刺(如卷曲的隔膜密封塞)而保持无菌完整性。这种容器可以包含单一或者多次的患者剂量。优选的多次剂量容器包括包含有多次患者剂量的单一容积的管瓶(如体积10-100cm3)，这样，在适宜的制剂使用期限内，可以在不同的时间间隔取出单一的患者剂量到临床的注射器中，以便适于临床的情况。
本发明的放射性药物也可以装在预先装填的注射器中。这种预先装填的注射器被设计成能包含单一人次剂量，这样一种形式可以直接从注射器对患者给予所述剂量。这种预先装填的注射器适当的是通过灭菌制造过程制备，以使产物呈无菌形式。因此，预先装填的注射器优选是一次性的，或者是适合于临床使用的其他注射器，由此保持放射性药物的无菌完整性。包含有放射性药物的预先装填的注射器可以有利地装在注射器罩中，以保护操作员免受放射剂量的影响。适当的这种放射性药物注射器罩在本领域中是已知的，并优选包括铅或者钨。这种预先装填的注射器在发货给顾客时，优选已经装有注射器罩，并且装在能提供进一步的辐射屏蔽的容器内，以便在从厂家运输到顾客的过程中，使包装表面的外辐射剂量减到最小。
根据体内待成像的位置、吸收量和靶点对背景的比例，适合于99mTc诊断显像的放射性药物的99mTc放射性含量在180-1500MBq(3.5-42mCi)范围内。对于用99mTc放射性药物对心脏进行成像的情况来说，可以使用约1110MBq(30mCi)来进行应力研究，其余的研究大约为350MBq(10mCi)。对于用99mTc放射性药物进行血栓成像的情况，大约750MBq(21mCi)将是适当的。
第三方面，本发明提供用于制备本发明xTc放射性药物组合物的非放射性试剂盒。这种试剂盒被设计成能得到适合于对人给药的无茵的放射性药物产品，如通过直接注射到血液中。对于99mTc来说，试剂盒优选被冷冻干燥，并被设计成能从99mTc放射性同位素发生器中重新用无菌的99mTc-高锝酸盐(TcO4-)组成，以便在不进行进一步操作的情况下获得适合于对人给药的溶液。适当的试剂盒包括含有非络合的式(I)或(II)的氮杂二胺二肟配体的容器(例如隔膜密封的管瓶)，以及药学上可接受的还原剂如连二亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、抗坏血酸、甲脒亚硫酸，亚锡离子，铁(II)或铜(I)；以及至少一种弱有机酸与如上定义的生物相容阳离子的盐。所述弱有机酸盐用于抑制不希望的亲脂性xTc络合物(如上所述)的形成。
非放射性的试剂盒可以任选进一步包括用作转螯合剂的第二种弱有机酸或其与生物相容阳离子的盐。所述转螯合剂是与锝快速反应形成弱络合物，然后被氮杂二胺二肟置换的化合物。这样，就由于与锝络合相竞争的高锝酸盐的快速还原而把形成还原水解锝(RHT)的风险降到最低程度。适当的这种转螯合剂是上述弱有机酸和其盐，优选酒石酸盐，葡糖酸盐，葡庚糖酸盐，苯甲酸盐，或膦酸盐，优选膦酸盐，最优选二磷酸盐。优选的这种转螯合剂是MDP，即亚甲基二膦酸，或其与生物相容阳离子的盐。
作为使用游离态配体的可选方案，所述试剂盒可以任选包含氮杂二胺二肟配体的金属络合物，其在加入锝时进行转金属化(即配体交换)，得到希望的产品。适当的这种用于转金属化的络合物是铜或锌络合物。
用于所述试剂盒的药学上可接受的还原剂优选亚锡盐如氯化亚锡，氟化亚锡或酒石酸亚锡，并且可以呈无水或水合形式。亚锡盐优选氯化亚锡或氟化亚锡。
所述非放射性试剂盒可以任选进一步包括另外的组分如辐射防护剂，抗菌防腐剂，pH值调节剂，或填充剂。术语“辐射防护剂”定义如上。术语“抗茵防腐剂”意思是指可抑制潜在有害的微生物如细菌、酵母或霉菌生长的试剂。根据剂量的大小，抗茵防腐剂也可以显示出某些杀菌性能。本发明抗茵防腐剂的主要作用是抑制重新组成后xTc放射性药物组合物，即放射性诊断产品本身中任何这种微生物的生长。但是，抗茵防腐剂也可以任选用来抑制在重新组成之前本发明的非放射性试剂盒的一个或多个组分中潜在有害的微生物的生长。适当的抗菌防腐剂包括对羟苯甲酸酯，即对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯或丁酯或其混合物；苯甲醇；苯酚；甲酚；溴化十六烷基三甲铵和乙基汞硫代水杨酸钠。优选的抗菌防腐剂是对羟苯甲酸酯。
术语“pH值调节剂”意思是指用于保证重新组成的试剂盒的pH值在对人或哺乳动物给药的可接受限值范围之内(大约为pH值4.0-10.5)的化合物或化合物的混合物。适当的这种pH值调节剂包括药学上可接受的缓冲剂，如tricine、磷酸盐或TRIS[即三(羟甲基)氨基甲烷]，和药学上可接受的碱如碳酸钠、碳酸氢钠或其混合物。对于本发明的氮杂二胺二肟来说，优选pH值调节剂包括碳酸氢钠。
当生物靶标部分是α2-抗血纤维蛋白溶酶的肽片段时，优选的试剂盒配方包括式(I)的配体，亚锡还原剂，生物相容阳离子的乙酸盐，二磷酸转螯合剂加上pH值调节剂。优选的这种试剂盒包括式(II)的配体；氯化亚锡；乙酸钠；MDP或其生物相容盐；辐射防护剂，特别是PABA或其生物相容盐，尤其是PABA的钠盐；和作为pH值调节剂的碳酸氢钠。最优选的这种试剂盒进一步包括式(II)的配体，其中每一个R1都是CH3，(A)p是NH，Z是Ac-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Ser-Pro-Xaa-Thr-Leu-Leu-Lys-Gly-，其中Xaa是Tyr或I-Tyr，Ac是N-乙酰基。
第四方面，本发明提供一种使用本发明的放射性药物诊断显象血栓的方法，其中生物靶分子是α2-抗血纤维蛋白溶酶的3-20个链节的肽片段。优选，α2-抗血纤维蛋白溶酶的肽片段包括Asn-Gln-Glu-Gln序列。最优选α2-抗血纤维蛋白溶酶的肽片段包括序列Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Ser-Pro-Xaa-Thr-Leu-Leu-Lys-Gly，其中Xaa定义如上。肺栓子(PE)由大量的血纤维蛋白组成，它们是交联的并在因子XIIIa的作用下稳定。血纤维蛋白和因子XIIIa两者都是由非活性前体具体地说在血栓位上生成的。本发明的α2-抗血纤维蛋白溶酶的肽片段是有效的因子XIIIa底物，因此通过这一酶的作用共价结合到肺栓子内的血纤维蛋白上。因此，本发明氮杂二胺二肟-α2-抗血纤维蛋白溶酶肽片段共轭体的99mTc络合物能在体内栓塞部位被选择性地吸收，对于这种部位给出正的吸收量或者相对于正常的组织呈现“热点”成像。类似的逻辑适用于体内其他类型的血栓(例如深静脉血栓形成或dvt)，因为因子XIIIa以类似的方式起作用。因此，本发明的因子XIIIa底物共轭体可用于体内血栓成像，特别是肺栓子和深静脉血栓形成。
参考以下详述的非限定性实施例对本发明进行说明。
实施例1描述了化合物1的合成，这一化合物1是本发明的氮杂二胺二肟螯合剂。
实施例2描述了优选的肽靶分子的受保护形式的合成，这种肽靶分子是用于血栓定靶的α2-抗血纤维蛋白溶酶的肽片断。
实施例3描述了化合物3的合成，该化合物3是实施例1氮杂二胺二肟螯合剂与实施例2靶肽的共轭体。实施例3也描述了化合物4-7的合成。
实施例4是一个对比实施例，其表明现有技术教导的化合物3的99mTc放射性标记。
实施例5描述了用于本发明的HPLC体系。在体系J中，得到表面上可接受的RCP，但是亲脂性的xTc络合物却保留在了色谱柱中(即，当流动相中使用最高达40％的乙腈时，它们对于固定相具有太大的亲合性)。体系H具有一定的洗脱梯度，其在流动相中包括更多的有机溶剂(最高达90％的乙腈)，由此成功地把亲脂性锝络合物从色谱柱中洗脱出来，以使其能够被分析。使用体系J时，纯度过高估计4％是由于未检测出来的亲脂性99xTc络合物(参见图3)。实施例10和
图1表明，亲脂性99mTc络合物的这一量级对于体内肝脏吸收具有重要的影响。
实施例6描述了本发明的冷冻干燥的试剂盒的制备。优选配方82/6，因为冻结干燥的团块在冷冻干燥过程中不太倾向于坍塌。配方82/6对于放久了的99mTc发生器洗脱液也更稳定(即在发生器洗脱之后最高达6小时)，得到令人满意的起始RCP和制剂充分的重组后稳定性。
实施例7描述了冷冻干燥试剂盒的重新组成，获得本发明的99mTc络合物组合物。
实施例8表明，含赖氨酸(钾)的肽，即具有胺基(化合物3和4)的肽显示出显著水平的亲脂性锝络合物。当把这些替换为不含胺的氨基酸如化合物5时，亲脂性络合物的量被大大降低。这也能通过苯甲酰胺衍生物(化合物6)得以证明。
实施例9表明了在本发明的99mTc络合物组合物上使用辐射防护剂的作用。
实施例10举例说明了管瓶塞对于99mTc络合物组合物的影响。
实施例11表明了亲脂性xTc络合物含量对于99mTc络合物组合物的生物分布的影响。亲脂性杂质的变化导致在1小时p.i.时血液中放射性的保留有明显(p＜0.05)的增加(1.88-3.26％)，相应的倾向是尿排出量降低(63.07-51.04％)，尽管这在统计学上并不明显。存在于肝脏中的放射性也显著(p＜0.05)地从2.24％增加到了10.24％。因此，增加量的亲脂性杂质导致99mTc-化合物3在血液中的保留显著增加，并且导致在肝脏中有明显较高的吸收。反过来，这导致尿液排泌有降低的倾向。
实施例12表明了弱有机酸盐对亲脂性锝络合物含量和所得生物分布的影响。向99mTc-化合物3的配方中加入三水乙酸钠表明，正如所预期的，由于抑制了亲脂性99mTc络合物的存在量，所以血液清除率增加，肝脏吸收量降低。因此，组合物的诊断显象潜力得以显著改善。药剂被吸收到心脏和肺中的吸收量是微不足道的，因此该药剂可由于令人满意的低背景吸收而潜在可用于肺的PE成像。
实施例13表明，本发明改进的xTc络合物组合物仍然具有有效的凝块吸收，即保持生物定靶活性。如实施例11和图1所表明，由于存在亲脂性99mTc络合物而产生的主要生物学特征是肝脏中id的百分数增加。
图1表明了组合物中亲脂性99mTc络合物含量对于肝脏吸收量的影响。
图2示出有代表性的表明本发明所述各物种的氮杂二胺二肟99mTc络合物组合物的HPLC记录图，图2A是正常的实际尺寸的峰图像，图2B是放大的刻度。
图3比较了使用两种不同的体系-体系J和体系H，对相同的氮杂二胺二肟99mTc络合物制剂的HPLC记录图。使用体系H检测到了亲脂性xTc络合物(为存在的放射性同位素标记物质的大约5％的量)，但是使用体系J却不会检测到这一物质。
其中Ac是乙酰基。
实施例13，3，11，11-四甲基-7-(2-氨乙基)-4，7，10-三氮杂十三烷-2，12-二酮二肟(化合物1或Pn216)的合成向三(2-氨乙基)胺(1ml，6.68mmol)的乙腈(10ml)溶液中加入碳酸氢钠(1.12g，13.36mmol，2当量)。慢慢地加入3-氯-3-甲基-2-亚硝基丁烷[R.K.Murmann，J.Am.Chem.Soc.，79，521-526(1957)；1.359g，10.02mmol，1.5当量]在无水乙腈(5ml)中的溶液。将反应混合物置于室温下搅拌3天，然后过滤。残余物用乙腈很好地洗涤，并蒸发滤液。然后通过RP-HPLC纯化粗产物(色谱柱Hamilton PRP-1；梯度在20分钟内0-100％的B；其中洗脱剂A是2％的NH3水溶液，洗脱剂B是乙腈，流速为3ml/分钟)，得到化合物1(164mg，7％)。
δH(CD3OD，300MHz)2.77(2H，t，J6Hz，CH2NH2)，2.50-2.58(10H，m，H2NCH2CH2N(CH2CH2NH)2)，1.85(6H，s，2x CH3C＝N)，1.23(12H，s，2x(CH3)2CNH).
实施例2肽Ac-NQEQVSPY(3I)TLLKG(化合物2)的合成通过把Fmoc-Gly-锚定在树脂上而将受保护的肽Ac-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Gln(Trt)-Val-Ser(tBu)-Pro-Tyr(3I)-Thr(tBu)-Leu-Leu-Lys(Boc)-GIy-OH集中在2-氯三苯甲基树脂上，然后用适当的受保护的氨基酸和偶合剂DCC与HOBt连续进行脱保护/偶合循环。固相肽合成参见P.Lloyd-Williams，F.Albericio和E.Girald的文章，Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides andProteins，CRC Press，1997。将末端天门冬酰胺乙酰化，使用0.5％的TFA使其从树脂上裂解下来，化合物2在不进行进一步纯化的情况下以三氟醋酸盐的形式使用。
实施例3化合物3-7的合成如实施例2所述，将受保护的Ac-NQEQVSPY(3I)TLLKG肽(化合物2)从固相树脂上裂解下来，然后在溶液中，使用PyBOP(苯并三唑-1-基-氧三-吡咯烷-磷鎓六氟磷酸盐)和HOBt(1-羟基苯并三唑)作为偶合剂使其与化合物1偶合。通过在试剂K[试剂K是82.5％的TFA，5％的苯酚，5％的工艺用水，5％的茴香硫醚，2.5％的乙硫醇(EDT)]中脱保护而得到化合物3。粗共轭体首先通过RP-HPLC用TFA纯化，随后进行第二次纯化，并用乙酸进行盐交换，冷冻干燥，用0.22μ的过滤器过滤，之后进行最终的冷冻干燥，得到化合物3。
MS测定其分子量为1970+-1道尔顿。
按类似方式制备用于化合物4和5的肽。化合物7是通过在DMF中对化合物1(Pn216)用戊二酐进行衍生制备的。化合物6是通过使化合物1(Pn216)和苯甲酸酐在乙腈中，在三乙胺的存在下反应制备得到的。
实施例4化合物3的Tc-99m放射性标记[对比实施例]将0.1ml等分量溶于水的化合物3(1mg/毫升)和去氧生理盐水(0.9％w/v，1ml)及0.035ml NaOH水溶液(0.1M)一起转移到充氮的10ml细颈瓶中。向该溶液中加入锝发生器洗脱液(1ml，约0.4GBq)，然后加入氯化亚锡水溶液(0.1ml，约10μg)。标记的pH值是9.0-10.0。将管瓶在实验室环境温度(15-25℃)下培养30分钟，以进行标记。所得制剂或者稀释到希望的放射性浓度下或者进行HPLC纯化(体系B)，以在试验之前脱除未标记的原料和放射性杂质。纯化后，真空脱除有机溶剂，并将样品再溶解在约5ml pH值为7.4的0.1M磷酸盐缓冲液中，得到6-9MBq/ml的工作浓度。
在使用之前通过如下所述的薄层色谱(TLC)体系评价放射化学纯度i)ITLC SG 2cm×20cm，用0.9％w/v的生理盐水洗脱ii)Whatman No.1 2cm×20cm，用50∶50v/v乙腈∶水洗脱被标记的底物留在或接近于TLC体系(i)的起端，并在体系(ii)中移动靠近溶剂前沿。
实施例5HPLC体系流速 在所有的体系中均为1ml/min，TFA＝三氟乙酸。
体系A色谱柱 Waters C18 250×4.5mm，粒径4微米梯度 洗脱分布图在25分钟内，10-60％的B洗脱剂A0.1％的TFA水溶液，洗脱剂B0.1％的TFA乙腈溶液体系B色谱柱 Waters Novapak C18 150×3.9mm，粒径4微米梯度 洗脱分布图在22分钟内，0-100％的B洗脱剂A0.1％的TFA水溶液，洗脱剂B0.1％的TFA乙腈溶液体系H色谱柱 Phenomenex C18(2)Luna 25×0.46cm，5μm；梯度 洗脱分布图0-20分钟，16-40％的B，20-22分钟，40-90％的B，22-30分钟，90％的B，然后30-31分钟，90-16％的B，然后在16％的B中将色谱柱重新平衡14分钟。
洗脱剂A0.05％的TFA水溶液洗脱剂B0.04％的TFA乙腈溶液体系J色谱柱 Phenomenex C18(2)Luna 25×4.6cm，5μm；梯度 洗脱分布图0-20分钟，16-40％的B，20-22分钟，40-
16％的B，然后在16％的B中将色谱柱重新平衡8分钟。
洗脱剂A0.05％的TFA水溶液，洗脱剂B0.05％的TFA乙腈溶液对重新组成的冷冻干燥的试剂盒(Lot 58，实施例6)，用HPLC体系J(实施例5)进行分析表明，使用体系J有94％的RCP(先有技术)，但是使用体系H时，RCP只有90％(本发明)。参见图3。
实施例6冷冻干燥试剂盒的制备将用于注射的大约为总容量的90％的水置于制备容器中并通过氮气吹扫除氧。依次加入亚甲基二磷酸，氯化亚锡二水合物，化合物3(以乙酸盐的形式)，三水乙酸钠和对氨基苯甲酸钠，使得每一种物质溶解，与此同时继续进行氮气吹扫。把对溶液的氮气吹扫替换为氮气溢出溶液的顶部空间。然后加入碳酸氢钠和无水碳酸钠，或单独加入碳酸氢钠，并使其溶解。然后将本体溶液用去氧的WFI调节到100％的最终容积(～5升)。之后把本体溶液通过无菌的0.2μm过滤器过滤到装料器中。在整个充填工作时期内，都对装料器的顶部空间用无菌过滤的(0.2μm)氮气或氩气进行吹扫。以1.0毫升等分量无菌分配到各个管瓶中。将管瓶用塞子A、B或C封堵一半，然后转移到预先急冷的冷冻干燥器架子上。然后将管瓶冷冻干燥，用无菌过滤的(0.2μm)的氮气回填，封堵并密封。
表2试剂盒配方
其中，塞子A＝PH701/45，红色-棕色；塞子B＝4023/50 1083灰色；C＝4432/50 1178灰色。
*lot33包含2mg的NaCl作为填充剂，**lot33包含25μg酒石酸钠二水合物作为转螯合剂，***lot86、87、88、94、98和配方82/4使用36μg SnCl2.2H2O，相当于30μg无水SnCl2。
实施例7从冷冻干燥试剂盒制备99mTc络合物用99mTc-高锝酸盐(2-8毫升的锝发生器洗脱液；0.5-2.5GBq)重新组成实施例6的冻结干燥的试剂盒。将溶液在60℃的水浴中加热10分钟，然后使其在室温静置、通过实施例5描述的体系H用HPLC法测定其放射化学纯度(参见图2)，用如下所述的ITLC方法测定其RHTITLC SG 2cm×20cm，用50∶50(v/v)甲醇∶乙酸铵溶液(1M)洗脱把配体基放射性同位素标记的物种转移到溶剂前沿。RHT保持在起始端。
对该溶液用HPLC体系H进行分析，结果示于下表3，其中％RCP是热力学99mTc络合物的放射化学纯度。
表399Tc络合物的HPLC分析
可变的RCP被认为应归于加热过程中的变化。
实施例8靶分子对99mTc亲脂性络合物金量的影响根据实施例6，使用Lot 63的配方(实施例6)，对于不同的靶分子(Z)制备冷冻干燥的试剂盒制剂。结果示于表4，其示出对重新组成之后的批料中3个管瓶的试验结果，其中分析是根据实施例7进行的表4Z对99mTc亲脂性络合物含量的影响
实施例9辐射防护剂对99mTc亲脂性络合物制剂的影响研究辐射防护剂对氨基苯甲酸钠(Na-PABA)对99mTc络合物制剂纯度的影响---在溶液中和作为冷冻干燥试剂盒制剂两种形式进行研究。所有的制剂均在带有1083 4023/50灰色塞子的10R管瓶中制成，直到最终的放射性浓度(RAC)为0.5GBq/ml。在重新组成后(PR)不同的时间，使用HPLC体系H对制剂进行分析，结果以放射性组合物的百分比为单位示于表5。
表5对包含PABA的制剂的标记分析
Np＝分析没有进行，Td＝热力学产品(主峰)，Kin＝动力学络合物，Lp＝亲脂性络合物。
实施例10塞子对RCP和99mTc亲脂性络合物的影响对各种不同的冷冻干燥试剂盒配方研究管瓶塞对放射性标记的影响。根据实施例7的方法重新组成使用两种不同橡胶塞(WestPharmaceutical Services)制成的冷冻干燥的试剂盒。记录RCP和放射性同位素标记的杂质的差异(参见表6，其表明10次RCP测定的平均值)
表6塞子对RCP和99mTc亲脂性络合物的影响
*在加热器部件中，在90℃加热10分钟实施例11亲脂性锝络合物含量对生物分布的影响用正常的雄性Wistar大鼠(体重150-250g)进行实验，并在静脉注射99mTc-化合物3制剂后1小时时进行解剖。后者是用冷冻干燥的试剂盒配方，Lot#58，制备的(详细内容参见实施例6)，它或者被加热，或者在90℃被加热不同的时间，之后冷却到环境温度，然后给药。使用体系H进行HPLC分析(实施例5)，证实了表6(以下)所示的不同量的亲脂性杂质。对每一种制剂计算其生物分布数据，器官/组织数据记录对应于每一单独的动物，三个一组的平均值和标准偏差。对该数据使用Microsoft Excel 97 SR-2电子数据表包进行变量的单一因子/单向分析(ANOVA)试验或不成对双尾T检验(2个样品，不等方差)。如果p值低于0.05，结果被认为有明显不同。结果示于表7
表7对于加热不同时段(在90℃加热0-45分钟)的制剂，其注入剂量百分数的平均值(以及标准偏差)
实施例12弱酸盐对亲脂性锝络合物含量和生物分布的影响通过比对冷冻干燥的试剂盒批号58和65，评价由于在配方中加入三水乙酸钠而引起的生物分布方面的改变。然后如实施例10那样进行试剂盒的重新组成和生物分布研究。通过利用不成对的双尾T检验对该数据进行分析。血液中放射性的保留有显著(p＜0.05)的降低(2.95-2.12％)，并且肝脏结合的放射性有显著(p＜0.05)的减少，从6.10％减少到2.82％。
表8对于其中含有或者没有三水乙酸钠的配方，其注入剂量百分数的平均值(以及标准偏差)
实施例13静脉血栓栓塞大鼠模型中凝块吸收量的比较对亲脂性*Tc络合物的变化已知的制剂(Lot 58和65-参见实施例7)进行研究。这样，用15％的尿烷使大鼠(雄性Wistar，250-350g)麻醉。剖腹术之后，分离腔静脉并使其不含周围脂肪组织。把铂丝(1.5cm×0.5mm)插入下腔静脉中，5分钟后，通过股静脉静脉注入0.4ml鞣花酸(1.2×10-4M)引发凝决形成。60分钟后，通过相同的静脉注入或者lot 58或者65(根据实施例7制备)，又一个60分钟之后，将动物处死，除去凝块，称重并计数。对其他的组织如血液，肺，心脏，也进行解剖和计数。测定示踪物被吸收到凝块中的吸收量(计为相对浓度(cpm/克凝块除以剂量/克动物))，和对背景组织的堵塞。这一模型中形成的凝块，平均重量大约为27mg，n＝32，(5-50mg范围内)。
对于Lot 58来说，凝块中放射性的相对浓度为8.01(n＝4，SD＝3.33)，而对于Lot 65来说，则为7.49(n＝4，SD＝1.84)。
权利要求
1.一种锝络合物组合物，其包括金属放射性同位素xTc与下式(I)的配体的金属络合物 其中每一个R1和R2独立地为R基团；x是94m，99或99m；Y是-(A)n-Z，其中Z是分子量低于5,000的生物靶标部分；-(A)n-是连接基，其中每一个A独立地为-CO-，-CR2-，-CR＝CR-，-C≡C-，-CR2CO2-，-CO2CR2-，-NR-NRCO-，-CONR-，-NR(C＝O)NR-，-NR(C＝S)NR-，-SO2NR-，-NRSO2-，-CR2OCR2-，-CR2SCR2-，-CR2NRCR2-，C4-8环杂亚烷基，C4-8环亚烷基，C5-12亚芳基，或C3-12杂亚芳基，或者是聚亚烷基二醇，聚乳酸或聚乙醇酸部分；n是0-10的整数；每一个R基团独立地为H或C1-10烷基，C3-10烷基芳基，C2-10烷氧基烷基，C1-10羟烷基，C1-10氟烷基，或者两个或多个R基团与它们所连接的原子一起形成碳环、杂环、饱和或不饱和的环；其中存在于锝络合物组合物中的小于10％的xTc包括式I配体的不稳定xTc络合物。
2.权利要求1的锝络合物组合物，其中存在于锝络合物组合物中的小于5％的xTc括式I配体的不稳定xTc络合物。
3.权利要求1或2的锝络合物组合物，进一步的特征在于，存在于锝络合物组合物中的小于5％的xTc包括式I配体的亲脂性xTc络合物。
4.权利要求3的锝络合物组合物，其中存在于锝络合物组合物中的小于3％的xTc包括式I配体的亲脂性xTc络合物。
5.权利要求1-4的锝络合物组合物，其中x是99m。
6.权利要求1-5的锝络合物组合物，其中Z是3-20个氨基酸的肽。
7.权利要求6的锝络合物组合物，其中3-20个氨基酸的肽是α2-抗血纤维蛋白溶酶片断。
8.权利要求7的锝络合物组合物，其中α2-抗血纤维蛋白溶酶片断包括四肽Asn-Gln-Glu-Gln。
9.权利要求8的锝络合物组合物，其中α2-抗血纤维蛋白溶酶片断包括以下肽Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Ser-Pro-Xaa-Thr-Leu-Leu-Lys-Gly，其中Xaa是Tyr或I-Tyr。
10.权利要求1-9的锝络合物组合物，其中Y是-CH2CH2-NR-(A)m-Z，其中m是0-5的整数。
11.权利要求1-10的锝络合物组合物，其中每一个R1独立地为C1-3烷基，C2-4烷氧基烷基，C1-3羟烷基，或C1-3氟烷基。
12.权利要求1-11的锝络合物组合物，其中配体是式(II)的配体 其中，每一个R1独立地选自C1-3烷基或C1-3氟烷基，p是0-3的整数。
13.权利要求12的锝络合物组合物，其中(A)p是-CO-或-NR-。
14.权利要求12和13的锝络合物组合物，其中每一个R1均为CH3，(A)p是NH，Z是Ac-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Ser-Pro-Xaa-Thr-Leu-Leu-Lys-Gly-，其中Xaa是Tyr或I-Tyr，Ac是N-乙酰基。
15.权利要求1-14的锝络合物组合物，其进一步包括辐射防护剂。
16.权利要求15的锝络合物组合物，其中辐射防护剂是对氨基苯甲酸或其生物相容盐。
17.一种放射性药物，其包括呈适合于对哺乳动物给药的形式的权利要求1-16的锝络合物组合物。
18.权利要求17的的放射性药物，其中xTc是99mTc。
19.用于制备权利要求17或18的锝放射性药物的试剂盒，其包括(i)权利要求1的式(I)配体；(ii)生物相容的还原剂，(iii)弱有机酸或其与生物相容阳离子的盐。
20.权利要求19的试剂盒，其中所述配体如权利要求6-11中定义。
21.权利要求19的试剂盒，其中式(II)的配体如权利要求12-14中定义。
22.权利要求19-21的试剂盒，其进一步包括pH值调节剂。
23.权利要求19-22的试剂盒，其中所述生物相容的还原剂包括亚锡。
24.权利要求19-23的试剂盒，其中所述弱有机酸是乙酸，柠檬酸，酒石酸，葡糖酸，葡庚糖酸，苯甲酸，苯酚或者膦酸。
25.权利要求19-24的试剂盒，其进一步包括辐射防护剂。
26.权利要求25的试剂盒，其中辐射防护剂包括对氨基苯甲酸或其生物相容盐。
27.权利要求19-26的试剂盒，其被冷冻干燥。
28.权利要求19-27的试剂盒，其包括(i)权利要求14的式II配体；(ii)包括亚锡的生物相容还原剂；(iii)包括亚甲基二膦酸的弱有机酸或其与生物相容阳离子的盐；(iv)包括对氨基苯甲酸或其生物相容盐的辐射防护剂；(v)包括碳酸氢钠的pH值调节剂。
29.一种使用权利要求17的放射性药物诊断显象血栓的方法，其中锝络合物组合物如权利要求7-9中定义。
全文摘要
本发明涉及改进的氮杂二胺二肟配体的
文档编号C07K14/47GK1708322SQ200380102061
公开日2005年12月14日 申请日期2003年10月24日 优先权日2002年10月25日
发明者G·布劳尔斯, G·法拉, D·J·巴尼特, H·J·瓦斯沃思, J·S·刘易斯 申请人:通用电气健康护理有限公司