专利名称：Epstein Barr病毒肽表位、多表位及其输送系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及Epstein Barr病毒的免疫原性肽。尤其，本发明涉及衍生自Epstein Barr病毒LMP1蛋白的细胞毒性T细胞表位。本发明还提供了含有一个或多个Epstein Barr病毒细胞毒性T细胞表位的药物组合物，多表位，基于腺病毒的疫苗输送系统和治疗与Epstein Barr病毒相关的疾病的方法，这些疾病例如有何杰金氏病和/或鼻咽癌但不限于此。本发明还提供了一种鉴定Epstein Barr病毒细胞毒性T细胞表位的方法。
背景技术：
Epstein Barr病毒(EBV)不仅是分布最广的人类病毒之一，有些矛盾的是，它也和一些肿瘤有关(Anagnostopoulos 1996)。这包括各种B细胞及T细胞非何杰金氏淋巴瘤，何杰金氏病，以及一些淋巴上皮瘤状癌，其典型即为鼻咽癌(NPC)。这些肿瘤与EBV的关系，以及EBV在体外的致癌潜力已有文献记载(Rickinson 1996；Khanna 2000)。CD8+T细胞活性在控制EBV感染中扮演重要角色，这是通过识别衍生自被MHC I型分子呈递到表面的被感染的细胞的小分子肽实现的。EBV特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)制剂可通过刺激来自健康病毒携带者的外周血的记忆T细胞在体外制得，该携带者含有被自身EBV转化的淋巴芽细胞系(LCL)细胞(Khanna1992；Murray 1992)。在一种LCL中，EBV表达六个核抗原(EMNAs1，2，3A，3B，3C和LP)，以及两个潜伏型膜蛋白(LMP1及LMP2)。其中，EBNA3家族(EBNA 3A，3B，3C)在CTL对许多人类白细胞抗原(HLA)的应答中为免疫显性(Khanna 1992；Murray等1992)。
何杰金氏病以及鼻咽癌的肿瘤细胞皆会表达病毒蛋白，已知是为CTL提供靶表位。这两种恶性肿瘤表达核抗原EBNA1，BARF0，LMP1和LMP2。EBNA1包括一个甘氨酸-丙氨酸重复(GAr)，此抗原在蛋白酶体降解中用做顺式抑制信号，并从而阻断该抗原内的CTL表位内源性呈递(Levitskaya 1995)。BARF0表位的CTL呈递被病毒转录体的差别剪接所影响，结果产生了CTL决定簇被去除了的显性蛋白质同种型(Kienzle 2000)。和EBNA1及BARF0相反，LMP1和LMP2两者都是EBV特异性CTL的强靶的，因此许多注意力皆集中在鉴别这两种抗原内的靶表位(Lee 1997；Khanna 1998；Meij 2002)。
LMP1为一跨膜蛋白，其胞质N末端及C末端结构域被6个跨膜区段分隔开。LMP1已经被认为是最重要的潜伏型蛋白之一，用于EBV介导的正常B细胞的转化，并能在转基因鼠中独特地诱导恶性肿瘤生成和增生(Kulwichit 1998)。而且，还已知LMP1对B细胞的细胞表型呈现出多效性，其中包括活化抗原的诱导(Wang 1990)，程序性细胞死亡抑制因子的表达(Henderson 1991；Laherty 1992)，以及经由TRAF信号传递途径的NF-κB活化(Hammarskiold 1992；Mosialos 1995)。先前的研究显示LMP1的作用为一种结构上活化的受体样分子，与配体的结合无关。LMP1的C末端通过C末端活化剂区域(是指CTAR1，氨基酸194-231及CTAR2，氨基酸332-386及CTAR3，氨基酸275-330)引发信号传导。CTAR1和CTAR2区域与NF-κB的诱导有关，CTAR2为主要NF-κB活化剂位点，而CTAR3结构域最近被报导与Janus激酶3结合(Gires 1999)。
发明概述本申请的发明人采用了一种新的基于IFN-γ的分析，在多组病毒携带者中进行广泛的LMP1特异性T细胞应答的序列分析。该方法与功能性细胞毒性分析相结合以评定LMP1特异性CTL溶解被EBV感染的靶细胞的能力。
概括地说，本发明提供了一种衍生自LMP1的新的和有效的EBV肽，其潜在地适用对包括B细胞和T细胞非何杰金氏淋巴瘤、何杰金氏病及如鼻咽癌(NPC)这样的淋巴上皮瘤状癌在内的肿瘤的免疫治疗。
本发明还提供了一种基于腺病毒的疫苗输送系统，该系统当用于输送EBV多表位结构时尤其有效。
因此，本发明中提供了一种分离的EBV CTL肽表位，其包含了LMP1蛋白的至少9个连续的氨基酸残基，其中所述EBV CTL肽不是YLQQNWWTL(SEQ ID NO1)，ESDSNSNEG(SEQ ID NO2)或YLLEMLWRL(SEQ ID NO3)。
第一方面，本发明提供了一种分离的EBV CTL肽表位，其包含氨基酸序列QRH(SEQ ID NO4)。
在一个优选的实施方案中，所述表位包含选自由以下所组成的组的氨基酸序列(i)QRHSDEHHH(SEQ ID NO9)；(ii)GQRHSDEHH(SEQ ID NO10)；(iii)YYHGQRHSD(SEQ ID NO11)；和(iv)WMYYHGQRH(SEQ ID NO12)。
在第一方面的其它实施方案中，所述表位包含选自由以下所组成的组的氨基酸序列(i)YYHGQRHSDEHH(SEQ ID NO13)；(ii)IWMYYHGQRHSD(SEQ ID NO14)；和(iii)LIWMYYHGQRHSDEHHH(SEQ ID NO15)第二方面，本发明提供了一种分离的EBV CTL肽表位，其包含氨基酸序列AGNDG(SEQ ID NO5)。
在第二方面的一个优选实施方案中，所述表位包含选自由以下所组成的组的氨基酸序列(i)AGNDGGPPQ(SEQ ID NO16)；和(ii)PSDSAGNDG(SEQ ID NO17)。
在第二方面的其它实施方案中，所述表位包含选自由以下所组成的组的氨基酸序列(i)SDSAGNDGGPPQ(SEQ ID NO18)；(ii)DSAGNDGGPPQL(SEQ ID NO19)；和(iii)PHSPSDSAGNDGGPPQL(SEQ ID NO20)。
第三方面，本发明提供了一种分离的EBV CTL肽表位，其包含氨基酸序列QNW(SEQ ID NO6)，特别地，其中不包括序列YLQQNWWTL(SEQ ID NO1)。
在第三方面的一个优选实施方案中，所述表位包含选自由以下所组成的组的氨基酸序列(i)IALYLQQNW(SEQ ID NO21)；(ii)ALYLQQNWW(SEQ ID NO22)；(iii)QNWWTLLVD(SEQ ID NO23)；和(iv)LYLQQNWWT(SEQ ID NO24)。
在第三方面的其它实施方案中，所述表位包含选自由以下所组成的组的氨基酸序列(i)IALYLQQNWWTL(SEQ ID NO25)；(ii)YLQQNWWTLLVD(SEQ ID NO26)；和(iii)LIIALYLQQNWWTLLVD(SEQ ID NO27)。
第四方面，本发明提供了一种分离的EBV CTL肽表位，其包含氨基酸序列VLYS(SEQ ID NO7)。
在其中的一个优选实施方案中，所述表位包含选自由以下所组成的组的氨基酸序列(i)ALLVLYSFAL(SEQ ID NO28)；
(ii)LLVLYSFAL(SEQ ID NO29)；(iii)ALLVLYSFA(SEQ ID NO30)；和(iv)VLYSFALML(SEQ ID NO31)。
在第四方面的其它实施方案中，所述表位包含选自由以下所组成的组的氨基酸序列(i)ALLVLYSFALML(SEQ ID NO32)；(ii)GALLVLYSFALM(SEQ ID NO33)；(iii)DWTGGALLVLYS(SEQ ID NO34)；(iv)GGALLVLYSFAL(SEQ ID NO35)；和(v)DWTGGALLVLYSFALML(SEQ ID NO36)。
第五方面，本发明提供了一种分离的EBV CTL肽表位，其包含氨基酸序列DSNSNE(SEQ ID NO8)，特别地，其中不包括氨基酸序列ESDSNSNEG(SEQ ID NO2)。
在第五方面的一个优选实施方案中，所述表位包含选自由以下所组成的组的氨基酸序列(i)DSNSNEGRH(SEQ ID NO37)；(ii)SGHESDSNSNEG(SEQ ID NO38)；和(iii)TDDSGHESDSNSNEGRH(SEQ ID NO39)。
本发明还提供了一种变异体EBV CTL表位。
在特别的实施方案中，所述变异体含有如表4所示的氨基酸序列(SEQ ID NO40-50)。
第六方面，本发明提供了一种分离的蛋白，该蛋白包含根据上述各方面的至少一个EBV CTL表位。
优选，该分离的蛋白是多表位蛋白，其包含选自由ALLVLYSFA(SEQ ID NO30)及IALYQQNW(SEQ ID NO21)所组成的组的氨基酸序列。
在一个优选的实施方案中，该分离的多表位蛋白包含如表5所示的各个EBV CTL表位。
在一个更优选的实施方案中，该分离的多表位蛋白包含如SEQID NO81所示的氨基酸序列。
本发明的第七方面，提供了一种分离的核酸，该核酸编码上述任一方面的EBV CTL表位或多表位。
在一个优选的实施方案中，该分离的核酸编码如SEQ ID NO81所列的多表位氨基酸序列。
在该实施方案中，更优选该分离的核酸编码具有如SEQ ID NO82所列的核苷酸序列。
该方面，还提供了一种分离的核酸，该核酸编码上述各方面的EBV CTL表位变异体。
在特别的实施方案中，所述分离的核酸包含如表4所示的一种核苷酸序列(SEQ ID NO63-65，67-69，71-76及78-80)。
第八方面，本发明提供了一种表达结构，它包含可操作地连接于表达载体中的一个或多个调控核苷酸序列的第六方面的分离的核酸。
在一个优选的实施方案中，该表达结构是基于腺病毒的。
在一个特别的实施方案中，所述表达结构是编码本发明中多数EBV CTL表位的多表位结构。
第九方面，本发明提供了一种宿主细胞或生物体，其包含有第八方面的表达结构。
第十方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含根据上述任一方面的EBV CTL表位或分离的核酸或编码其的表达结构。
优选，该药物组合物是一种免疫疗法组合物。
更优选，该药物组合物是一种疫苗。
第十一方面，本发明提供了一种治疗与EBV相关的疾病的方法，包括对动物施用本发明的一种或多种EBV CTL表位或编码其的表达结构的步骤。
此方面的方法包括施用蛋白质以及核酸组合物，用于对与EBV相关的疾病的治疗和/或预防。
尽管不限于此，与EBV相关的疾病优选包括各种B和T细胞非何杰金氏淋巴瘤，何杰金氏病，以及几种淋巴上皮瘤状癌，其中鼻咽癌(NPC)为特别受注目的形式。
优选，该动物是哺乳动物。
更优选，该动物是人。
在一个优选的实施方案中，第十方面的方法更进一步包括根据要接受治疗的人的HLA类型来选择一种或多种EBV CTL表位的步骤。
第十二方面，本发明提供了一种鉴定EBV CTL表位的方法，上述方法包括以下步骤(i)制备大量衍生自LMP1蛋白的不同肽；(ii)将上述一种或多种所述肽与获自EBV血清阳性个体的一种或多种T淋巴细胞相结合；和(iii)测量在对上述一种或多种肽的应答中的上述一种或多种T淋巴细胞的IFN-γ产量，其中IFN-γ产量高于参考量即表示所述一种或多个肽具有至少一种EBV CTL表位。
在一个优选的实施方案中，该方面的方法进一步包括步骤(iv)检测是否步骤(ii)所产生的上述一种或多种T淋巴细胞能溶解一种或多种被EBV感染的靶细胞。
第十三方面，本发明提供了一种抗体，该抗体能与根据本发明的上述各方面的一种或多种EBV CTL表位结合。
第十四方面，本发明提供了一种检测动物是否携带或曾接触过EBV的方法，所述方法包括这样的步骤将分离自上述个体的一种或多种T细胞与本发明的一种或多种EBV肽相接触，由此上述一种或多种T细胞对一种或多种肽中的至少一个的应答可指示该动物携带EBV或曾接触过EBV。
优选，该动物是哺乳动物。
更优选，该动物是人。
本说明书全文，除非特别指出，各处的”包含”是指”包括在内”而不是”排除在外”，因此所陈述的整体可以包括一个或多个其它未陈述的整体。
附图和表格说明表1EBV免疫的健康捐赠者或NPC病患的HLA抗原类型(I型)被包括在本说明书中。
表2被EBV特异性T细胞从健康病毒携带者所识别到的LMP1序列列表。
表3T细胞对MHCI型和MHCII型限制性LMP1表位的应答频率，该表位存在于不同种族的健康个体与NPC患者中。
表4由高加索人、非洲人、中国人、新几内亚人和印度尼西亚人分离出的存在于EBV中的HLAI型限制性LMP1表位的序列。编码每个表位的核苷酸序列和存在于特定分离体的序列改变都被表示出来。SEQ ID NO30的肽序列变异体被表示为SEQ ID NO40。SEQID NO21的肽序列变异体被表示为SEQ ID NO41-43。肽序列变异体YLLEMLWRL(SEQ ID NO3)被表示为SEQ ID NO44-48。肽序列变异体YLQQNWWTL(SEQ ID NO1)被表示为SEQ ID NO49和50。编码野生型与变异体表位的核苷序列被表示为SEQ ID NO62-80。
表5EBV多表位肽序列和HLA特异性。YLLEMLWRL(SEQ IDNO3)；YLQQNWWTL(SEQ ID NO1)；ALLVLYSFA(SEQ IDNO30)；IAYLQQNW(SEQ ID NO21)；SSCSSCPLSKI(SEQ ID NO51)；PYLFWLAAI(SEQ ID NO52)；TYGPVFMCL(SEQ ID NO53)；RRRWRRLTV(SEQ ID NO54)；LLSAWILTA(SEQ ID NO55)；LTAGFLIFL(SEQ ID NO56)；VMSNT LLSAW(SEQ ID NO57)；IEDPPFNSL(SEQ ID NO58)；CLGGLLTMV(SEQ ID NO59)。
图1一组健康的血清阳性个体中的LMP1特异性T细胞应答体内分布图。A用来自LMP1的重叠合成肽(10μg/ml)刺激来自健康的血清阳性个体的PMBC，且INF-γ产量用如材料和方法部分所描述的ELISPOT分析法测量。结果被表示为每106PBMC中斑点形成细胞的个数(spot forming cell，SFC)。BLMP1蛋白中的T细胞活性的图表分布。C在ELISPOT分析法中被健康的病毒携带者所识别的肽表位的氨基酸序列肽9(SEQ ID NO36)；肽17(SEQ IDNO60)；肽21(SEQ ID NO27)；肽24(SEQ ID NO15)；肽25(SEQ ID NO61)；肽27(SEQ ID NO39)；肽38(SEQ ID NO20)。
图2由CD4+与CD8+T细胞群体分泌的IFN-γ体内检测，再继以LMP1肽的刺激。用如材料与方法中所述的抗人类CD4或CD8免疫磁性颗粒将CD4+细胞或CD8+细胞从新鲜的PBMCs中排除。将这些细胞于生长培养基中重悬，再用DWTGGALLVLYSFALML肽(SEQ ID NO36；组A)与TDDSGHESDSNSNEGRH肽(SEQ IDNO39；组B)(10μg/ml)刺激，然后用ELISPOT分析法检测INF-γ分泌情况。
图3用ELISPOT分析法对最小表位序列做图。用重叠肽(5μg/ml)刺激来自捐赠者MM(组A和B)，RE(组C)，LL(组D)的PBMC，且INF-γ产量用如材料和方法部分所描述的ELISPOT分析法测量。结果被表示为每106PBMC中斑点形成细胞(SFC)的个数。
图4用ELISPOT分析法对最小表位序列做图。用重叠肽(1μg/ml)刺激来自捐赠者LL(组A)，MM(组B)，RE(组C和D)的PBMC，且INF-γ产量在如材料和方法部分所描述的ELISPOT分析法中测量。结果被表示为每106PBMC中斑点形成细胞(SFC)的个数。
图5A对IALYLQQNW特异性CTL克隆MM22的HLAI型限制性分析。一些与捐赠者MM有相同的HLA I型等位基因的自体与异源EBV转化的LCL和PHA胚细胞与CTL克隆MM22相接触。PHA胚细胞用IALYLQQNW肽表位进行预敏。与靶的比例为2∶1的效应物被用于该分析中。B被CTL克隆MM23所识别的CTL识别IALYLQQNW表位。用一系列稀释肽对PHA胚细胞致敏，然后暴露给IALYL QQNW特异性CTL克隆MM23。
图6A对得自捐赠者LL的ALLVLYSFA特异性CTL系进行HLAI型限制性分析。在该肽存在或不存在的情况下，一些与捐赠者LL有相同的HLAI型等位基因的自体与异源PHA胚细胞与表位特异性CTL系相接触。与靶的比例为10∶1的效应物被用于该分析中。B被来自于捐赠者LL的CTL系所识别的CTL识别ALLVLY SFA表位。用一系列稀释肽对PHA胚细胞致敏，然后暴露给ALLVLYSFA特异性CTL系。
图7A变异体和原型HLAA2限制性LMP1表位YLLEMLWRL的CTL识别。PHA胚细胞与一系列各肽的稀释液致敏，然后暴露给任一YLLEMLWRL特异性CTL克隆SB7。B用变异体与原型HLAA2限制性LMP1表位在T2细胞上做MHC稳定性分析。T2细胞起初用200μl的每种肽(10μg/ml)在26℃下孵育14-16小时，接着于37℃下孵育2-3小时。HLAA2在这些细胞上的表达用HLAA2特异性单克隆抗体FACS来分析。
图8重组腺病毒载体的结构图，该载体表达编码含有13种HLAI型限制性LMP1和LMP2表位(SEQ ID NO79，也见于表5)的多表位蛋白的合成DNA(SEQ ID NO79)。编码该多表位蛋白的DNA序列是使用序列特异性引物(表示为LMP-A，LMP-B，LMP-C及LMP-D)和基于交互引导(mutual priming)与重叠延伸的技术来构成。该片段的核酸序列编码(从5’端)一个BamH I限制性酶切位点，一段Kozak序列，一个甲硫氨酸起始密码子，13个前后相连的最小LMP1CTL表位，一个终止密码子，以及一个在3’端的EcoR I限制性酶切位点。LMP多表位的插入片段是从pcDNA3.1表达载体上切下并克隆到pAdTrack表达载体中。在E.coli中扩增和重组后，Ad5-LMPpoly载体通过转染人类胚肾(HEK)293细胞，被包装到转染性腺病毒中。通过冷冻与解冻来收获重组腺病毒。
图9由Ad5LMP多表位编码的CTL表位的内源性加工。
图10Ad5LMP多表位的免疫原性。
图11Ad5-LMPpoly的免疫作用对表达EL4-A2/Kb肿瘤细胞的LMP1提供保护。两组小鼠，每组6只，分别用Ad5-LMPpoly或对照组腺病毒(108PFU/只小鼠)免疫。免疫后21天，用EL4-A2/Kb-LMP1细胞(107个细胞/只小鼠)对小鼠进行皮下进攻，并在进攻后16天监测肿瘤大小。肿瘤大小数据以平均±标准差表示。
发明详述本说明书描述了许多新的和意料不到的衍生自LMP1蛋白的EBV CTL表位。用一种新的基于IFN-γ分析来鉴定EBV CTL表位，并用功能性细胞毒性分析来评估LMP1特异性CTL溶解被EBV感染的靶细胞的能力。
令人惊奇地，本发明的CTL表位优先衍生自CTAR1与LMP1蛋白的跨膜结构域，实际上并不包括CTAR2结构域与N末端。
本发明的衍生自LMP1的EBV肽潜在地适用于治疗与EBV相关的疾病的免疫疗法。尤其，本发明中所考虑的与EBV相关的肿瘤包括B细胞及T细胞非何杰金氏淋巴瘤，何杰金氏病，和例如鼻咽癌(NPC)这样的淋巴上皮瘤状癌。
为实现本发明的目的，”分离的”意指物质由其自然状态被移开或使其能够被人类使用。分离的物质可以完全地或基本上与其在自然状态下所伴随的成分相分离，或可以被操纵以使得它与其自然状态中所伴随的成分共存。分离的物质可以是天然的，化学合成的或重组形式。
“蛋白质”是指一种氨基酸聚合体，该氨基酸可以是自然的或非自然的氨基酸，D-或L-型氨基酸，或是本领域所熟知的化学衍生氨基酸。
“肽”是指具有不超过50个氨基酸的蛋白质。
“多肽”是指具有超过50个以上的氨基酸的蛋白质。
“EBV CTL表位”是指由EBV基因组编码的一种氨基酸序列，在体外或体内，在有MHC I型存在的情况下，当该氨基酸序列遇到至少一种T细胞克隆型(clonotype)时，它可以通过至少一种T细胞克隆型(clonotype)引起免疫应答。此外该定义不排除T细胞表位，例如辅助T细胞或B细胞表位。
如SEQ ID NO4-9所示的共有氨基酸序列为本发明的EBV CTL肽(SEQ ID NO10-39)中最小的共同区域(列于表2)。
适合地，上述EBV CTL肽表位由至少9个但不超过20个相连的氨基酸所组成。
在某些实施例中，上述EBV CTL肽表位由9个，12个或17个相连的氨基酸所组成。
在一个优选的实施方案中，上述EBV CTL肽表位具有选组如下所作成的组的氨基酸SEQ ID NO9；SEQ ID NO10；SEQ ID NO11；SEQ ID NO12；SEQ ID NO16；SEQ ID NO17；SEQ ID NO21；SEQID NO22；SEQ ID NO23；SEQ ID NO24；SEQ ID NO28；SEQ IDNO29；SEQ ID NO30；SEQ ID NO31和SEQ ID NO37。
本发明还考虑到了例如多肽或多表位蛋白这样的分离的蛋白，其包含本发明的一种或多种，或优选大量的EBV CTL表位。例如，所述表位可以是单独存在或重复存在，其中也包括一前一后排列的重复表位。“间隔基”氨基酸也可以包括在存在于上述分离的蛋白中的一个或多个该EBV CTL表位间。
在一个实施方案中，一种纯化的蛋白可能由一种或多种或优选大量的本发明EBV CTL表位所组成。
在另一个实施方案中，一种纯化的蛋白基本上可为由一种或多种或优选大量的本发明EBV CTL表位所组成。
“基本上由…所组成”是指除了EBV CTL表位序列之外，每种EBV CTL肽表位具有不超过5个，或优选不超过3个氨基酸。
就特殊的多表位蛋白而言，这些额外的氨基酸残基可以是指”间隔基”氨基酸。
还发现，本发明的多表位蛋白可以额外地包含一种或多种其它EBV CTL肽，例如一种或多种列于表2或表5的现有技术的LMP表位，和/或EBV CTL表位YLLEMLWRL(SEQ ID NO2)和YLQQNWWTL(SEQ ID NO1)。
在一个优选的实施方案中，分离的多表位蛋白包含大量MHC I型限制性LMP1和/或LMP2CTL表位。
优选，至少有一种上述CTL表位具有选自由以下所构成的组的氨基酸序列ALLVLYSFA(SEQ ID NO30)和IALYQQNW(SEQ IDNO21)。
在一个特别优选的实施方案中，分离的多表位包含13种EBVCTL表位，该表位分别具有以下的氨基酸YLLEMLWRL(SEQ IDNO3)；YLQQNWWTL(SEQ ID NO1)；ALLVLYSFA(SEQ IDNO30)；IAYLQQNW(SEQ ID NO21)；SSCSSCPLSKI(SEQ ID NO51)；PYLFWLAAI(SEQ ID NO52)；TYGPVFMCL(SEQ IDNO53)；RRRWRRLTV(SEQ ID NO54)；LLSAWILTA(SEQ ID NO55)；LTAGFLIFL(SEQ ID NO56)；VMSNTLLSAW(SEQ ID NO57)；IEDPPFNSL(SEQ ID NO58)；CLGGLLTMV(SEQ ID NO59)。
更优选，该分离的多表位蛋白具有如SEQ ID NO81(图.8)所示的氨基酸序列。
表5及图8中的多表位中的CTL表位是被筛选的包括了广泛的MHC I型特异性的表位。例如，估计这些最优选的HLA特异性包含了约90％的亚洲、非洲以及高加索人群。
还注意到，图8中的分离的多表位蛋白(SEQ ID NO81)已被本申请的发明者证实可以诱导被多表位免疫的小鼠中的CD8+CTL应答，该应答可保护小鼠不受到肿瘤的攻击。
同时还考虑了EBV CTL表位的变异体。
一般来说，此处所用术语”变异体”是本发明的EBV CTL表位，其中被删除了一个或多个氨基酸或被不同的氨基酸所取代，但本质上不改变其免疫原性。本领域熟知某些氨基酸可以被改变成具有广泛相似的特性的其它氨基酸，但并不改变其免疫原性(保守取代)。
选择性取代(selecting substitution)会造成功能的本质改变，选择性改变的保守度较小，其能被忍受的程度也相对较低。一般来说，可能会造成蛋白质特性最大改变的取代是那些其中(a)亲水性残基(如Ser或Thr)被疏水性残基(如Ala，Leu，Ile，Phe或Val)所取代；(b)半胱氨酸或脯氨酸被其它任何残基所取代；(c)具有带正电侧链的残基(如Arg，His或Lys)被带负电的残基(如Glu或Asp)所取代；或(d)具有大侧链的残基(如Phe或Trp)被具有小侧链的残基(如Ala或Ser)或无侧链的残基(如Gly)所取代。
自然发生的变异体EBV CTL表位的特殊例子由表4与SEQ IDNO40-50提供，这些变异体衍生自特定的种族区域的EBV分离物，并将在以下详细讨论。
本发明还讨论了本发明的EBV CTL表位的”衍生物”，例如通过氨基酸残基的化学修饰，生物素酰化，与荧光染料结合，加入表位标记(如c-myc，血细胞凝集素和FLAG标记)，以及便于重组蛋白表达、检测和纯化(如谷胱甘肽-S-转移酶、绿色荧光蛋白，六组氨酸和麦芽糖结合蛋白，但不限于此)的融合配偶体(fusion partners)来生成。
氨基酸的化学修饰包括但不限于，酰化作用修饰，脒化，赖氨酸的pyridoxylation，还原性烷基化，用2，4，6-三硝基苯硫酸(TNBS)将氨基进行三硝基苯化作用，通过将半胱氨酸过甲酸氧化成磺基丙氨氨来进行羧基的酰胺修饰与氢硫基修饰，水银剂衍生物的形成，二硫化物与其它硫醇化合物的混合物的形成，与马来酰亚胺的反应，碘乙酸或碘乙酰胺的羧甲基化，以及在碱性pH下氰酸盐的氨甲酰化，虽然不限于此。
在这方面，本领域技术人员可以参考CURRENT PROTOCOLS INPROTEIN SCIENCE Eds.Coligan等(John Wiley和Sons NY，1995-2000)第15章，其中有广泛的与蛋白质化学修饰相关的方法。
本发明的EBV CTL表位，EBV多表位以及包含此表位的蛋白质可以通过任何现有技术中的已知方法来生产，包括但不限于，化学合成，DNA重组技术和LMP蛋白的蛋白酶剪切以产生肽片段。
在一个实施例中，EBV CTL表位可以通过化学合成制备，包含固相和液相合成。这些方法是本领域中所熟知的，虽然参考文献中有化学合成技术的实施例，如SYNTHETIC VACCINES Ed.Nicholson(Black 孔 Scientific Publications)的第9章以及CURRENTPROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Eds.Coligan等(John Wiley和Sons，Inc.NY USA 1995-2001)的第15章所提供的。在该方面，参考文献也见于WO 99/02550和WO 97/45444。
在另一实施例中，本发明的重组EBV CTL表位，或优选，包含EBV CTL表位的蛋白质，可由本领域技术人员采用标准实验步骤方便地制备，例如Sambrook等，分子克隆实验手册(冷泉港出版社，1989)，特别是第16和17章；CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，Eds.Ausubel等，(John Wiley和Sons，Inc.NY，USA，1995-2001)，特别是第10和16章；以及CURRENTPROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Eds.Coligan等，(John Wiley和Sons，Inc.NY，USA，1995-2001)，特别是第1，5和6章。
核酸与表达结构本发明提供了一种分离的核酸，其编码本发明的EBV CTL表位或多表位。
编码本发明经选择的EBV CTL表位及其变异体的核苷酸序列如表4中所示。编码本发明其它EBV CTL表位的核苷酸序列，可容易地由已公开的完整LMP1编码核酸序列推导出来，例如Genbank获取号X58140。
本发明还提供了编码EBV肽变异体的核苷序列，例如表4中所示(SEQ ID NO63-65，67-69，71-76和78-80)。
编码多表位蛋白的分离的核苷序列如SEQ ID NO82和图8所示。
此处所用术语”核酸”指单链或双链mRNA，RNA，cRNA，RNAi和DNA，其中DNA包括cDNA和基因组DNA。
“多核苷酸”是具有80个或80个以上的连续核苷酸的核酸，而”寡核苷酸”具有少于80个的连续核苷酸。
“探针”可以是单链或双链寡核苷酸或多核苷酸，适当标记后用于在Northern或Southern杂交中检测其互补序列。
“引物”通常为单链寡核苷酸，优选具有15-50个连续核苷酸，它可与其互补核酸模板退火，并由例如Taq聚合酶，依赖于RNA的聚合酶或测序酶(SequenaseTM)这样的DNA聚合酶作用以依赖模板的方式延伸。
本发明还包括利用密码子序列丰余序列修饰的核苷酸。在一个更特别的例子中，密码子的使用可以被修饰以将特定生物或细胞型中的核酸的表达最大化。
本发明还包括经修饰的嘌呤(例如次黄苷，甲基次黄苷和甲基腺苷)和经修饰的嘧啶(如硫尿核苷及甲基胞嘧啶)的用途。
本发明还提供了表达结构，其包括编码至少一个，或优选大量的本发明的EBV CTL表位的核苷酸序列。
恰当地，上述表达结构包含被可操作地连接到表达载体中的一个或多个调控核苷酸序列的所述核苷酸序列。
存在于表达载体中的“调控核苷酸序列”可包括增强子，启动子，剪接供体/受体信号，Kozac序列，终止子及聚腺苷酸化序列，如本领域所熟知的那样并促进被可操作地连接于其上的核苷酸序列的表达，或促进被编码的蛋白质的表达。
这里所用的“可操作地连接”是指所述调控核苷酸序列与本发明的核苷酸序列有位置上的关联，用以引起，调节或控制其转录。
调控核苷酸序列通常对用于表达的宿主细胞或生物是适当的。在本领域中已知有适用于各种宿主细胞的大量的各种适当的表达载体和合适的调控序列。
对于启动子，结构性启动子(如CMV，SV40，牛痘，HTLV1以及人类延长因子启动子)与诱导性/抑制性启动子(如tet-抑制性启动子及IPTG-金属硫蛋白-或蜕皮激素-诱导性启动子)都是本领域中所熟知的，并包含于本发明中。也将意识到，启动子可以是结合超过一个启动子元件的杂交型启动子。
优选，所述表达结构还包括一个或多个选择性标记，这些标记适用于被转化的细菌(如bla，kanR及tetR)的筛选或被转化的哺乳动物细胞(如潮霉素，G418以及嘌呤霉素)的筛选。
表达结构还可以包含了一个融合配偶体(fusion partner)，典型地由表达载体提供)，所以本发明的重组蛋白作为融合蛋白与所述融合配偶体一起被表达。融合配偶体主要的优点是可以协助所述融合蛋白的鉴定和/或纯化。
融合配偶体的例子已在前文中描述过。典型地，在以亲和层析分离融合蛋白时，融合配偶体特别有用。为了使用亲和层析纯融合多肽时，用于层析的相关基质分别为抗体，蛋白A-或G-，谷胱甘肽，直链淀粉，以及镍或钴缀合树脂。许多这样的基质皆可买到试剂盒的形式获得，例如适用于(HIS6)融合配偶体的QIAexpressTM系统(Qiagen)和Pharmacia GST纯化系统。
适合于表达的宿主细胞可为原核或真核细胞，如大肠杆菌(例如DH5α)，酵母细胞，应用于杆状病毒表达系统的Sf9细胞，哺乳动物细胞系如原淋巴细胞系，鼠EL4细胞和分离自被转化的如人或鼠这样的被转化的宿主生物的脾细胞，尽管不限于此。
表达结构可以通过许多已熟知的任一技术导入宿主细胞或生物中，这样的技术包括但不限于热激转化，电穿孔，DEAE-葡聚糖转染，显微注射，脂质体接介导的转染，磷酸钙沉淀，原生质融合，微粒轰击，病毒转化及类似技术。
在一个特别的实施例中，本发明提供了一种以多表位表达结构的形式存在的表达结构。
优选，所述此多表位结构适于用做DNA疫苗。
根据这一实施例，编码大量EBV CTL表位的核酸可以，例如由合成的寡核苷酸采用例如Splice Overlap by Extension PCR这样的技术来合成，如Thomson等，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 925845中所描述的那样。
在一些特别的形式中，本发明的表达结构可用于表达和运送病毒源载体，如痘病毒与腺病毒。
当被用做疫苗运送系统时，病毒源的表达结构可以VLPs的形式或作为“裸露的”核酸结构施用于动物。
在一个特别实施例中，根据该实施例的多表位表达结构包含牛痘病毒启动子，如存在于质粒子载体中的p7.5启动子。例如，Khanna等，1992提出以标记获救重组来生产TK-重组体牛痘病毒。
在一个更优选的实施方案中，本发明提供了一种基于腺病毒的表达结构，用于疫苗运送系统。基于腺病毒的结构可感染大范围的哺乳动物或人类细胞，包括休眠或增生细胞。
这种基于腺病毒的表达结构可以包含结构性或诱导性/抑制性启动子，如四环素诱导性/抑制性系统。
这种基于腺病毒的表达结构的优选形式为缺少至少一个E1基因的衍生自不可复制型A5腺病毒。这样的不可复制型用克隆技术的Aden-X系统来提供。
下文详细提供了特别优选的基于腺病毒的表达结构与疫苗运送系统。
药物组合物与疫苗本发明还提供了包含本发明的一种或多种EBV CTL表位的药物组合物，包括变异体及其衍生物，或是编码相同表位的核酸表达结构。
优选的药物组合物为“免疫疗法组合物”，提供可对如前所述的与EBV相关的疾病的治疗与预防。
在一特别实施例中，所述药物组合物是疫苗。
疫苗的形式可以是富含蛋白疫苗(proteinacious vaccine)的形式，其包含一种或多种本发明EBV CTL表位，包括了亚单位疫苗或DNA疫苗形式，它的一个特别的例子是如前文所述的多表位表达结构。
与DNA疫苗相关的潜在的合适的技术可见于WO 96/03144和Thomson等，1998，J.Immunol.160 1717。
基于腺病毒结构的运送可经系统性施用于动物或是经由如树突细胞这样的初级转导抗原呈递细胞，接着将被转导细胞施用于动物体内。
Ranieri，1999和Gahn等，2001年提出了被腺病毒转导的树突细胞用于治疗与EBV相关的疾病时的运送实例。
恰当地，药物组合物更进一步包含药学上可接受的载体，稀释剂或赋形剂。
“药学上可接受的载体，稀释剂或赋形剂”是指可以安全地进行系统性施用的固体或液体填充物，稀释剂或做成胶囊的物质等。依照施用时的特殊途径，可以使用本领域中所熟知的各种不同的载体。这些载体以选自包括糖类，淀粉，纤维素及其衍生物，麦牙，明胶，滑石，硫酸钙，植物油，合成油，多元醇，藻酸，磷酸缓冲液，乳化剂，等张盐水与盐类，盐类是如同包括了氯化氢的矿物酸盐，溴化物与硫化物，有机酸如醋酸盐，丙酸盐与丙二酸盐以及无热原水(pyrogen-free water)。
一篇描述药学上可接受的载体，稀释剂和赋形剂的有用参考文献，见于Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.N.J.USA，1991)。
可用任何安全途径为患者提供本发明的组合物。可使用例如经口，直肠，肠外注射，舌下，口腔，静脉内，关节内，肌肉内，真皮内与皮下的注射，或经吸入，眼球内，腹膜内，脑室内或经透皮肤等及其类似途径。例如，肌肉内与皮下注射较适合于免疫原性组合物，富含蛋白疫苗以及DNA疫苗的施用。
药剂形式包括药片，散剂(dispersions)，悬浮物，注射剂，溶液，糖浆，片剂，胶囊，栓剂，喷剂，穿透皮肤的贴片等及其类似形式。药剂形式也可包括注射或移植一种专门设计的受控制放射装置，或是其它经过修饰形式的有其它作用的移植物。受控制的治疗试剂的放射可受其包被影响，例如，有疏水性聚合物包括丙烯酸树指，蜡，高脂肪酒醇，多乳酸与多甘醇酸(polyglycolic acids)，以及一些纤维素衍生物如羟丙基甲基纤维素。另外，受控制的放射也可以用其它聚合物聚合物基质，脂质体和/或微球体粒子来影响。
适合口服或肠外注射的本发明的药物组合物可以独立单位呈现，如胶囊，小袋，或药片，每单位含有一种以上预定量的本发明的一种或多种药剂，以粉末或颗粒或以溶液，水溶液中的悬浮物，非水溶液，油分散于水中的乳浊液或水分散于油中的乳浊液。这种组合物可用任何配药方法配制，但每种方法皆包含这样的步骤将含有一种或多种必须成分的载体与一种或多种上述药剂结合。一般来说，本发明的药剂与液相载体或精细分隔的固相载体或两者皆有，做完全一致的混合后制成组合物，之后若需要的话，再将产物塑成想要的外型。
可用与药剂设计兼容的方法来以药物有效量施用上述组合物。在本发明内容中，对病患施用的剂量足以在一段适当时间后在患者身上产生有利的应答。施用剂量应由医师判断，视施用对象的各种因素而定，如年龄，性别，体重及其一般健康状况等。
在一个特别的免疫疗法组合物与疫苗的例子中，“药学上可接受的载体，稀释剂或赋形剂”可为一佐剂。在本领域中将会了解，“佐剂”是指包含一种或多种物质的组合物，其可增强疫苗组合物的免疫原性与效力。合适的佐剂没有限定性的例子，包括角鲨烷和角鲨烯(或其它动物油)；嵌段共聚物；洗涤剂如Tween-80；QuilA，矿物油如Drakeol或Marcol，植物油如花生油；棒状杆菌衍生佐剂如氨苄咪唑；丙酸杆菌衍生佐剂如Propionibacterium acne；牛型结核菌(Bacille Calmette和Guerin或BCG)；百日咳博德特氏菌抗原；破伤风类毒素；diptehria类毒素；白细胞介素如白细胞介素2和白细胞介素12；单核因子如白细胞介素1；肿瘤坏死因子；干扰素如gamma-干扰素；组合物如皂苷-氢氧化铝或Quil-A aluminium氢氧化铝；脂质体；ISCOM和ISCOMATRIX佐剂；结核杆菌细胞壁萃取物；合成糖肽如胞壁酰二肽或其它衍生物；Avridine；脂质A衍生物；葡聚糖硫酸酯；单独的DEAE-extran或与磷酸铝的混合物；羧基聚甲烯如聚羰乙烯′EMA；丙烯酸共聚物乳浊液如Neocryl A640(例如US 5047238)；水分散于油中的乳浊液如Montanide ISA 720小儿麻痹病毒，牛痘或动物痘病毒蛋白；或其混合物。
对于亚单位疫苗，这种疫苗的一个制配实施例是以ISCOM来配制，如同WO97/45444所描述的。
抗体本发明还包括针对本发明的EBV CTL表位的抗体。
本发明的抗体可以是单克隆或多克隆抗体。抗体制造，纯化与使用的方法已为大家所熟知，可见于Coligan等，CURRENTPROTOCOLS IN IMMUNOLOGY(John Wiley和Sons NY，1991-1994)的第二章以及Harlow，E.和0 Lane，D，抗体实验室手册，冷泉港，冷泉港实验室，1988，两者在此处都通过引用被合并近来。
一般来说，本发明的抗体会与本发明的一个多肽，片段，变异体或衍生物结合或缀合结合。例如，抗体可包含多克隆抗体。制备这种抗体，可以将本发明的多肽，片段，变异体或衍生物注射到生产型物种，这可以包括小鼠与家兔，以获的多克隆抗血清。本领域技术人员熟知制备多克隆抗体的方法。可以使用的典型方法见于前述的Coligan等，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY，Harlow和Lane，1988。
用于代替获自生产物种的多克隆抗血清，单克隆抗体可以标准方法来制备，这样的方法例如详述于之前所提的Khler和Milstein，1975，Nature 256，495中所描述的，或多个其最近修饰体如Coligan等，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY所描述的，是将一种或多种多肽，片段，变异体或衍生物接种到生产用的物种，取其无限增殖的脾脏细胞或其它抗体产生细胞来制备单克隆抗体。
本发明还包括在上述单克隆或多克隆抗体中，包含抗体的Fc或Fab片段。可选地，抗体可包含针对本发明的分离的蛋白的单链抗体Fv(scFvs)。这种scFv例如可以依照下列各文中的方法来制备，US No5091513，EP239400或Winter和Milstein，1991，Nature 349293的标记与本发明的抗体或抗体片段有关。
标记选择包括以下的组色素原，催化剂，酶，萤光剂，化学冷光分子，镧系离子如铕(Eu34)，放射性同位素与直接视觉标记。直接视觉标记可以由下列物质组成使用，包括胶状或非金属粒子，染色粒子，酶或底物，有机聚合体，乳浊液颗粒，脂质体，或其它含有信号产生物质的小泡，及类似物。
于US 4366241，US 4843000和US 4849338详细陈述许多可用来做标记的酶，它们在这通过引用合并入本发明。本发明中有用的酶标记包括碱性磷酸酶，辣根过氧物酶，萤光素酶，b-半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，溶菌酶，苹果酸脱氢酶及类似物质。蛋白质标记可以单独使用或者与溶液中的第二种酶结合来使用。
虽不限于此，但经实施例，萤光染色剂可为异硫氰酸荧光素(FITC)，奥地绿(oregon green)，异硫氰酸荧光素(TRITL)，别藻蓝素(APC)及R-藻红蛋白(RPE)。
所以本发明可容易地被理解并付诸实际作用，下列非限制性实施例可引导技术人员，其中实施例一提出本发明EBV CTL表位的说明与免疫特性描述，实施例二则提出腺病毒介导的本发明的EBV多表位运输方式。
实施例实施例1材料与方法细胞系的建立与维持以B95.8，BL74与QIMR-WIL病毒分离株来将外周B细胞做外源性病毒转化，由血清阳性的捐赠者来建立EBV转化的LCLs。这些细胞系例行性地保持在添加了2mM L-谷氨酸盐，100IU/ml青霉素以及100μg/ml链霉素外加10％胎牛血清(FCS)的培养基RPMI1640中。此外，肽运输物(TAP)-阴性BxT杂交细胞系。174×CEM.T2(称为T2)(Salter 1986)肽稳定性分析。
为了产生植物凝集素(PHA)胚细胞，以PHA刺激外周血单核细胞(PBMC)(CSL Ltd，Melbourne，Australia)，培养三天后，含有MLA 144上清液的生长培养基和高度纯化的重组人类IL-2(rIL-2)被添加(Khanna 1992)。每两周更换rIL-2与MLA上清液以使PHA胚细胞增殖(不再添加PHA)，直至六周。
病毒分离株LCLs(类淋巴母细胞系)由一组不相关的健康捐赠者来建立，这些捐赠者为血清阳性的非洲人，高加索人以及新几内亚人。建立的方法为，在0.1μg/ml环包菌素A存在的条件下(Moss 1988)，让培养的外周淋巴细胞自发性的生长。总数为29的自发性LCLs(11个高加索人，11个新几内亚人，2个非洲人，以及5个东南亚人)被用来使每个独立个体重获其固有的EBV分离群。此外，由EBV携带者的鼻咽癌活体切片直接测序16种来自东南亚人的病毒分离株。
EBV基因片段的PCR与DNA测序侧面连接LMP1基因不同区域的特定寡核苷酸引物被选择用于PCR扩增(表1)。结果的PCR的产物以QIAquick旋转柱(QiagenInc.Chatsworth，CA)纯化，而且遵照制造者的实验步骤以PRISMready reaction dyedeoxy terminator cycle测序试剂盒(AppliedBiosystems Inc.，Foster City，CA)从两端做测序。
合成肽肽的氨基酸序列是由公布的LMP1序列而来，这些LMP1序列是原自高加索原样型1EBV菌株B95.8。用Merrifield固相法(MimotopesPty Ltd，Melbourne，Australia)在自动肽合成仪上合成45个肽，长度为17个氨基酸，8个残基重叠，且横跨整个LMP1序列。肽试样量被溶于20％DMSO中至2mg/ml。
EBV血清阳性捐赠者招募一组来自不同种族的42位健康病毒携带者与鼻咽癌患者来进行此研究。每位捐赠者经血清学和基于PCR的DNA分型方法进行HLA分型(表2)。
INF-γ-ELISPOT分析ELISPOT分析是用来评估来自带有LMP1肽的大量血清阳性捐赠者的PBMC经刺激后能否诱导T细胞中INF-γ的表达(Bharadwaj2000)。简言之，将96孔充分混合的纤维素酯膜平板(Millipore，Bedford，USA)预先涂上100μL/孔的10μg/mL的抗-IFN-γmAb，1-D1K(Mabtech，Stockholm，Sweden)，于4℃过夜。每板用磷酸缓冲盐(PBS)洗涤3次，不具活性的部位以5％的牛胎血清阻断。来自已知HLA分型的健康的EBV携带者的PBMCs用Ficoll-Hypaque(Sigma)密度梯度离心从全血中分离出来。将PBMCs加入三个一组的孔中，每孔体积100μL含2.5×105个细胞，然后将肽加入PBMCs中至终浓度达5μg/Ml。同时做一组含三种不同细胞数的测试，三个孔分别含2.5×105，1.5×105及1×105个PBMC细胞。分析PBMCs对不同浓度肽的反应，肽浓度分别为10μg/mL，5μg/mL及1μg/ml。在阴性对照中，将PBMCs单独培养在未加肽的生长培养基中。平板于37℃，5％的CO2浓度下培养过夜(约16-20小时)，再前后分别以PBST(0.05％的Tween-20于PBS中)与PBS冲洗三次，然后每孔加入100μl的1μg/mL抗-IFN-γmAb，7-B6-1(Mabtech，Stockholm，Sweden)，并于室温孵育3-4小时。孵育后再前后分别以PBST与PBS各冲洗三次，再在每孔添加100μl的1μg/mL抗生蛋白链霉素-碱性磷酸酯酶缀合物(Sigma)。平板在室温下孵育2小时。然后再次分别以PBST与PBS洗涤孔各三次，用碱性磷酸酶缀合基质(BCIP/NBT；Sigma)与5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐和氮蓝四唑进行30分钟到1小时的显色反应，就可以看到呈黑色斑点状的个别IFN-γ生成细胞。以影像分析软件自动计算斑点数(ImagePro)(Bharadwaj 2001)，并以斑点形成细胞(SFC)/106PBMCs来表示。分泌IFN-γ的T细胞的其数目是通过从实验组的SFC计数中减去阴性对照值来计算。
去除CD4+与CD8+细胞用抗人CD4+或CD8+免疫磁性微粒去除新鲜PBMCs中的CD4+或CD8+细胞(Dynabeads M450-CD4和M450-CD8)，分别(Dynal，Oslo，Norway)依照厂商的建议。通过对被去除的PBMCs用FITC-缀合抗-CD8和PE-缀合抗-CD4抗体双重染色，及用Coulter EPICSXL细胞计数器的流式细胞仪来确定去除的有效性。FACScan分析可确定此实验方法能去除＞95％的CD4+或CD8+细胞。细胞被重新计数，再将细胞重悬于R10中，并设置于一式三份的ELISPOT分析中。
多克隆CTL系与LMP1特异性CTL克隆的建立依先前公布的方法(Mossl988；Khannal998)来建立多克隆CTL系与LMP1特异性CTL克隆。简言之，在24孔板中2ml孔体积，用被10μM肽所触发的1×106个自体淋巴细胞刺激2×106个PBMCs(应答物对刺激物比值为2∶1)1小时。3天后加入含有IL-2(10U/ml)的培养基让细胞继续增殖。到第7天时以γ放射性(8000rad)自体LCLs再次刺激淋巴细胞。在培养基中十天后，这些细胞在针对肽敏感的自体PHA胚细胞的标准51Cr放射分析中用作多克隆效应子。
为了生产对LMP1衍生肽有特异性的外周血CTL克隆，在孔体积在培养基中的24孔板的2ml孔中用对肽敏感的(10ug肽/ml)自体免疫细胞(1×106)重新活化健康捐赠者的PBMCs(2×106)。3天后，细胞被接种到0.35％的琼脂糖上，并在含有гIL-2(50IU/ml)的T细胞生长培养基维持。3天后，长出的克隆被转移到圆底的96-孔培养皿中(Life Technologies)，并培养于含有гIL-2(50-100IU/ml)的T细胞培养基中。
T细胞对T细胞的杀伤此项技术(Burrows，1992)是基于在CTL培养基中的细胞对彼此呈递肽抗原的活性，如果是合适的肽，将导致CTL-CTL杀伤。CTL克隆(约300个细胞/孔)孵育在含10μM肽的25μl T细胞培养基中。于37℃培养3小时后用倒置显微镜评估细胞溶解的情形。
细胞毒性分析以合成的肽表位对靶细胞预敏，然后用51Cr孵育90分钟。孵育后在生长培养基中洗涤这些细胞，并将这些细胞用做5小时51Cr放射分析中的靶(Moss，1988)。
MHC稳定性分析为评估MHC与EBV分离群得到的HLA A2-限制性LMPI表位变异体的结合，将T2细胞(2×105)与200μl的每种肽(100μg/ml)在26℃下孵育14-16小时，接着在于37℃下孵育2-3小时。孵育后采用以特异性单克隆抗体(HB82，ATCC)，通过FACS测量HLA A2的表达。
结果不同种族健康病毒携带者体内的LMP1-特异性T细胞应答为了充分描述记忆T细胞对血清阳性病毒携带者体内LMP1的应答，我们使用ELISPOT分析法，这种分析法可以在体内快速地勾勒出LMP1-特异性免疫应答而不会延长体内培养。用整组重叠LMP1肽刺激分离自血清阳性病毒携带者的PBMC(表2)，并检测生产INF-γ的细胞。图1A和B代表用整组重叠肽做ELISPOT分析的数据(17个氨基酸长度，8个残基重叠)。在检测的21个健康捐赠者中，有7位对45种肽中的7种有强烈的体内应答(SFC范围从39-824/106个PBMC)(图IA)。这些应答的一个有趣现象是大部分的T细胞反应都直接针对这些存在于LMP1跨膜部分与CTAR1结构域中的表位，然而没有发现任何针对CTAR2和N末端的反应(图1B)。特别地，CTAR1结构域中几乎有80％的区域皆会被T细胞识别。图1列出所有会被不同捐赠者识别的17个氨基酸长度的肽。为了鉴定出能对这些肽有应答的T细胞亚型，我们从7位能识别17mer肽的捐赠者中分离出PBMCs，将其分成CD4消去型与CD8消去型两群，然后再用ELISPOT分析法检测。这些肽中有5种对CD4+与CD8+T细胞都有活性，这表明这些序列包括了MHC I型与MHC II型限制性表位。另一方面，肽DWTGGA LLVLYSFALML清楚地显示出其只对依赖于CD8+T细胞的有活性，然而对肽TDDSGHES DSNSNEGRH的应答则主要是由CD4+T细胞介导(图2A和B)。肽TDDSGHESDSNSNEGRH的依赖于CD4的活性与先前Leen及其同事所观察到的结果一致，他们图绘出了该序列中的HLA DQ2-限制性表位。
LMP1特异性T细胞应答的详细做图在ELISPOT分析中，使用经过截短的17mer肽来得到LMP1特异性CD8+T细胞应答的详细做图。实验起初以12mer重叠性肽来绘制17mer肽中的免疫原性区域。取自4位个体捐赠者的重叠肽的代表性如图3A-D所示。总的12种12mer肽被认为可能是决定因子(参见表3)。基于这些12mer肽，跨越12mer肽的重叠的9mer肽被用于界定出最小表位序列。来自4个不同捐赠者的代表性数据如图4A-D所示。共有18种9mer肽被认为可能是最小的表位序列(表3)。其中两种最小序列(YLLEMLWRL和YLQQNWWTL)在之前已被鉴定为CTL表位(Khanna，1998)，而其它的序列则是在本研究中第一次被发现。
新LMP1 CTL表位的特性为了进一步描述由ELISPOT分析所确定的最小T细胞表位的特性，我们制备出对这些表位有特异性的多克隆CTL细胞系与克隆CTL细胞系。用合成的肽表位刺激来自健康血清阳性捐赠者的PBMCs，并在标准51Cr放射实验来建立CTL克隆或多克隆细胞系。图5与图6为两种新表位(IALYLQQNW和ALLVLYSFA)的一系列数据。先以肽敏感的自体PBMC来刺激，接着再以放射性自体LCL连续重复刺激以产生IALYLQQNW肽特异性CTL克隆。用51Cr放射分析针对于对肽敏感的自体与异体PHA胚细胞以及LCLs来筛选具有IALYLQQNW特异性CTL活性的CTL克隆。图5A中的数据清楚地显示，与CTL仅共享HLA B57的靶细胞被IALYLQQNW特异性CTL克隆所识别，这表明该表位只受HLA B57等位基因限制。自体PHA胚细胞最小表位的滴定进一步确定了该CTL克隆的精细特异性(图5B)。
先前对HIV CTL表位的研究显示，相似的HLAI型分子可呈现出完全相同的肽如CTL表位(Goulder等，2000)。因为HLA B57与HLA B58的一般亚型只有几个氨基酸的差异，并享有相似的肽结合基元，所以我们便探究IALTLQQNW也会受到HLA B58等位基因的限制的可能性。我们对两位HLA B58健康血清阳性捐赠者的研究也确实显示出对最小IALTLQQNW表位有同等强烈的应答(表3)。这些观察显示，该表位展现出对HLAB57与HLAB58两者的双重HLA限制。用与上述相类似的方式鉴定了HLA-A2限制性CTL表位。用肽特异性T细胞系来确认ALLVLYSFA表位的HLA A2限制性(图6A)。ALLVLYSFA表位特异性CTL克隆的精细特异性随后通过最小肽的剂量应答分析来证实(图6B)。
其它17-mer肽，TDDSGHESDSNSNEGRH，在ELISPOT分析中表现出CD8+T细胞应答，分析中有3/21的健康捐赠者其反应大小介于131-190SFC/106PBMC之间(图1A)。建立自两位不同捐赠者的多克隆CTL细胞系会识别以肽包被的自体PHA胚细胞(数据未列出来)。两位捐赠者(MM和RE)分别识别最小肽ESDSNSNEG和DSNSNEGRH，但这些最小表位并不会导致CTL细胞系的产生。值得注意的是，Leen及其同事之前已绘制出一个位于17mer序列之间的HLA DQ2-限制性T细胞表位(表3)。
不同人种对最小HLAI型-限制性LMP1 CTL表位的识别为了确定对HLAI型-限制性LMP1CTL表位识别的频率，我们用ELISPOT分析法从一组不同种族的健康病毒携带者中筛选出PBMC。分析的详细摘要列于表3。此分析中包含4种不同的HLA I型限制性及一种HLA II型限制性T细胞表位。我们观察到对有35-45％测试的捐赠者中对HLA-A2限制性YLLEMLWRL，YLQQNWWTL和ALLVLYSFA表位有强烈应答。这些应答在高加索人中有较高的一致性，而这些表位被东南亚捐赠者识别的频率则较低。HLA-B57限制性IALYLQQNW表位被5/7的HLA B57阳性个体所识别。令人感兴趣的是，一些HLA B58阳性捐赠者(3/5)也识别该表位，且与HLA B57阳性捐赠者同样有效，由此进一步证实了该表位有双重的HLA I型限制性。HLA II型限制性LMP1表位TDDSGHESDSNSNEGRH会被所有三种健康的病毒携带者所识别。
源自不同地理区域的EBV分离群中其HLAI型限制性LMP1 CTL表位的序列分析本发明与我们实验室先前的研究(Khanna，1998)中，LMP1内的表位都通过参考I型EBV菌株，B95.8再活化的CTL来确认。然而在治疗EBV相关恶性肿瘤时，这种表位若是有效CTL治疗的基础，我们就必须首先确定这些表位序列在世界各地不同人群的其它EBV菌株中的保守程度。因此，我们从健康病毒携带者与NPC活体切片中分离出许多EBV，并将其编码LMP1表位的DNA区域做序列分析。四种LMP1表位(IALYLQQNW，ALLVLYSFA，YLLEMLWRL和YLQQNWWTL)的序列分析结果的详细摘要列于表4。来自高加索，非洲以及东南亚捐赠者病毒分离株，其HLAA2限制性(ALLVLYSFA和YLQQNWW TL)以及HLA B57和B58限制性(IALYLQQNW)表位皆高度保留(表4)。只有少数病毒分离株显示出有轻微的表位序列变异。在新几内亚人分离株中，虽然YLQQNWW TL和IALYLQQNW表位通常是保守的，然而取代的情形在ALLV LYSFA中更加普遍。每单一分离株都显示有一个相同的改变，即在第7位由丝氨酸变为丙氨酸(表4)。
对HLA A2限制性表位的序列分析，来自不同人种的EBV分离株中的YLLEMLWRL揭示了一个有趣的遗传变异形式。高加索人分离株有5/11对YLLEM LWRL表位表现出原样型B95.8序列，其它7/11的分离株则有一些改变，影响一个或多个残基(表4)。在四个分离株中，位置2的亮氨酸，位置5的甲硫氨酸以及位置8的精氨酸分别被取代为苯丙氨酸，异亮氨酸以及甘氨酸。其它两个分离株在位置2与位置5或只有位置5显示有取代。对来自东南亚人群的病毒分离株的序列分析显示几乎所有分离株皆有相同的取代情形，其中包括位置2(L→F)和位置5(M→I)的取代。一个分离株显示在位置4有突变(E→D)。在这必须重要地强调，来于自发性LCLs和NPC活体切片两者的病毒分离株一般都表现出相同的突变形式(表4)。在东南亚人群的分离株中，并没有检测到任何的野生型序列。令人感兴趣的是，在东南亚人群中发现的表位YLLEMLWRL表位的显性遗传变异形式(YFLEILWRL)，这也常出现在高加索人群的病毒分离株中。
为了更进一步表针YLLEMLWRL表位的遗传变异体，我们合成每种变异体序列的合成肽，并用EBV特异性CTL来做HLA结合和免疫识别的评估。如图7所示的数据表明，在致敏性自体PHA胚细胞被特异性CTL克隆水解时，大多数变异体序列的合成肽作用效率比原养野生型YLLEMLWRL肽显著要低。只有一种变异体序列YLLEILWRL被认为与野生型表位同样有效(图7A)。此外，在用常见于东南亚人群分离株的变异体肽序列(YFLEILWRL)孵育T2细胞时，并无法挽救HLA A2的表达(图7B)。其它变异体肽(YFLEILWGL，YLMEILWRL和YLLEILWRL)却明显地增加了T2细胞上MHC表达，这表示造成这些变异体丧失其抗原性归因于T细胞受体与MHC-肽复合体间的相互作用不恰当，而不是不与MHC结合。
实施例2材料与方法重组LMP1多表位插入片段的构建编码多表位氨基酸序列的DNA序列是由通用密码子设计的。我们将有20个碱基对重叠的5条长寡核苷酸(引物1-5，长度范围在74-100个碱基之间)代表了多表位DNA序列，通过重叠延伸和逐步不对称PCR(stepwise asymmetric PCR)(参见图8)的剪接方式将它们在一起退火。简言之，多表位序列特异性引物LMPA与LMPB用开始为高温的PCR反应(94℃，1分钟)扩增5个循环，反应体积为20μl内含延长酶混合物与PCR缓冲液。5个循环结束时，PCR程序会暂停在72℃，将上述反应液体2μl转移到新的72℃预热的20μl反应液中，用引物LMPC及多表位序列特异性正向引物再进行另五个循环。在第10个循环时，程序会再次暂停，再将2μl后一次的反应液添加到新的20μl反应液中，用引物LMPD及多表位序列特异性正向引物再进行五个循环。所有寡核苷酸都被加入之前，该逐步PCR被一直重复。在最后一个步骤中，用多表位序列特异性正向和反向引物将最后一次的2μl反应液做扩增25个循环。
该片段的核酸序列(从5’末端起)依次编码Bam HI限制性酶切位点，Kozak共有序列，甲硫氨酸起始密码子，13个连续的最小LMPl和LMP2CTL表位(表5)，终止密码子，EcoRI限制性酶切位点(图8)。全长凝胶纯化的PCR片段被克隆到接入pcDNA3表达载体的BamHI/EcoRI位点，通过测序检查突变。
制备Ad5-LMP多表位疫苗载体使用使用Adeno-X系统(CLONTECH，Palo Alto，CA)的高效的连接方法{Mizuguchi 1998 & 1999}来装配和生产基于Ad5的腺病毒(参见图8)。LMP1多表位插入片段被接到pAd-TrackCMV的EcoRI与BamH1位点。然后通过转染人类胚胎肾脏(HEK)293细胞，将重组Ad5载体包装入感染性腺病毒中，并通过冻-融从被转染的细胞收获重组腺病毒(指Ad5-LMPpoly)。
细胞系的建立和维持用B95.8病毒分离株对外周B细胞进行外源性病毒转化，以从血清阳性捐赠者建立起EBV转化的LCLs。这些细胞系一直被常规地维持在添加有2mM L-谷氨酸盐，100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素和10％FCS(生长培养基)的RPMI 1640中(Gibco Invi-trogen Corp。，Carlsbad，CA)。此外，胚胎肾脏细胞系293{Graham，1977}被维持在含10％的牛胎儿血清的DMEM中。
用Ad5-LMPPolv载体对HLA A2/Kb转基因鼠的免疫用于本研究的HLA A2/Kb转基因鼠已再别处描述过(Theobald，1997)。这些小鼠表达一种嵌合I型分子，该分子由人类A*0201等位基因的α1与α2结构域，以及鼠H-2KbI型分子的α3结构域所组成。用108噬斑形成单位(plaque forming units，PFU)的重组Ad5-LMPpoly或对照组腺病毒对这些鼠进行腹膜内接种疫苗。3周后收成脾脏细胞，并测试表位-特异性T细胞应答。用ELISPOT和体内CTL实验来检测这些T细胞应答。
肿瘤攻击和多表位免疫应用两种不同的接种策略来评价LMP多表位疫苗的功效。在第一组实验中，用或Ad5-LMPpoly或对照组腺病毒(109PFU/每只鼠)对HLA A2/Kb鼠进行腹膜内免疫。免疫3周后，用107个活EL4-A2/Kb-LMP1细胞这些鼠被皮下攻击。攻击后，定期地监测这些鼠21天，并以标尺测量肿瘤大小。在第二组实验中，先用EL4-A2/Kb-LMP1(每只鼠107个细胞)肿瘤细胞攻击HLA A2/Kb鼠。攻击10天后，当肿瘤直径大小约位0.2cm时，再用或者Ad5-LMPpoly或者对照组腺病毒免疫这些鼠。定期地监测肿瘤的退化来评价LMP多表位疫苗的治疗效果。根据动物伦理委员会的准则，肿瘤直径＞1.0cm的任何小鼠都必须使其死亡。
结果重组腺病毒LMP多表位编码的CTL表位的内源性加工与CTL识别为了监测是否多表位(Ad5-LMPpoly)所编码的LMP表位(表5)被内源性加工了，我们把被Ad5-LMPpoly感染的靶的细胞暴露给对各种表位具有特异性的LMP1或LMP2特异性CTL多克隆细胞系。这些CTL细胞系是来自于健康的病毒携带者。与HLA配对的成纤维细胞和Ad5-LMPpoly感染的LCLs，被个别的LMP特异性CTL细胞系所识别(图9)。这些结果清楚地显示，被包括在腺病毒LMP多表位内的HLA I型限制性CTL多表位能被有效的加工并呈递给靶的细胞。
在接下来的实验中，腺病毒LMP多表位被用于在体外反复刺激PBMC以产生二级CTL应答，PBMC源自健康的EBV血清阳性个体。所产生的多克隆培养物被用做抗自体PHA胚细胞的效应物，这些胚细胞已先被LMP1或LMP2肽表位致敏。图10的数据清楚地显示LMP多表位能高效地唤起多重CTL应答，其应答对每一位捐赠者所表达的HLA等位基因所限制的表位有特异性。例如，LMP多表位会刺激针对表位YLQ(HLA A2-限制性，LMP1)和CLG(HLA A2-限制性，LMP2)的强烈的T细胞应答，也观察到针对表位ALL(HLA A2-限制性，LMP1)和YLL(HLA A2-，A68-和A69-限制性，LMP1)的应答。
相反地，用EBV转化的LCL刺激诱导非常有限的LMP特异性T细胞的扩展，而且LMP肽致敏的靶的细胞的溶解水平低于可被检测的程度(数据未显示)。
Ad5-LMPpoly疫苗的免疫作用反转了LMP1表达肿瘤的生长为了检测腺病毒LMP1多表位疫苗所诱导的T细胞应答是否能提供针对表达LMP1的肿瘤细胞的保护作用，用Ad5-LMPpoly或对照组腺病毒对两组HLA A2/Kb小鼠(每组10只)进行首次免疫两次，每次间隔14天，然后用EL4-A2/Kb-LMP1细胞攻击，并定期地监测这些小鼠的肿瘤生长情况。虽然两组都有肿瘤长出，但在对照组的腺病毒免疫的小鼠中肿瘤生长情况较剧烈，而且对肿瘤的攻击并不显示任何保护作用(图11)。于此必须强调，用对照组腺病毒或Ad5-LMPpoly免疫的动物不显示针对EL4/A2Kb细胞攻击的保护作用，这表示表位特异性免疫应答是此保护作用的关键(数据未显示)。
讨论何杰金氏病与鼻咽癌有一个重要的共同特征，即EBV抗原的表达通常都受限于EBNA1，LMP1和LMP2。其中EBNA1被HLAI型路径保护，以避免进行加工(Levitskaya，1995)，所以只有LMP1与LMP2才是靶的抗原，可用于发展新的免疫策略以扩展抗原-特异性T细胞免疫以治疗何杰金氏病与鼻咽癌。其治疗方法主要在增加T细胞对LMP抗原的应答，这在治疗与EBV相关的复发鼻咽癌和何杰金氏病中很有用。我们采用ELISPOT分析以充分描绘一组病毒携带者中LMP1特异性T细胞应答。在所有这些受测试的捐赠者中，55-60％的健康高加索人检测到有LMP1特异性T细胞应答。另一方面，这种应答在东南亚的健康病毒携带者与鼻咽癌患者中则较少见。
目前研究有一个令人感兴趣的现象，即80％以上的针对LMP1的T细胞反应都是直接作用于跨膜区和CTAR1结构域。特别有趣的是，不同的受测者皆会优先作用于CTAR1结构域。由ELISPOT分析法鉴定的15mer决定子中，有3/7被定位于CTAR1结构域中。另一方面，我们无法检测到T细胞对任何位于远端C末端CTAR2结构域内的肽有应答，然而，CTAR2结构域对一些LMP1介导的功能来说都是必须的。先前的研究已表明单独的该区域的突变或缺失就会完全破坏LMP1介导的讯号传导与调节过程。虽然T细胞对CTAR2区域没有应答的确切原因还未知，但有可能是EBV会保护此重要的功能区域以避免受到潜在的免应控制。如果知道这种避免的机制就有可能找到对CTAR2结构域起免疫性作用的原因，如此不仅能阻断LMP1介导的转化作用，还能破坏正常细胞与恶性细胞的潜在感染。
先前的研究提出，全世界不同地理区域的LMP1序列有高度的变异性。在使用LMP1作为治疗复发的HD与NPC疾病时的潜在免疫疗法的靶的时，该遗传变异被认为是一个最主要的阻碍。因此，确定B95.8衍生的LMP1表位序列在来自全世界不同地理区的EBV分离株中的保受状况是很重要的。研究一大组来自不同地区的人的外周血液衍生的EBV分离株和NPC活体切片，我们发现来自LMP1的T细胞表位序列通常是高度保守的。这里所测序的4种表位中有3种显示出轻微的变异。有重大变异的唯一序列为HLA A2父型(supertype)-限制性YLLEMLWRL，其在来自不同地区的EBV分离株中有不同的序列形式。这在来自东南亚的分离株中表现的尤其明显，因为其YLLEMLWRL表位区域内有相同形式的遗传变异。而且在分离自NPC与自发性LCLs的分离株间，其遗传变异情形相同。虽然在高加索人和PNG中的YLLE MLWRL表位中也发现共同序列变异体，但这些分离出的表位在每一特定地理区会额外表现出不同的遗传变异。对YLLEMLWRL表位的遗传变异做抗原性分析发现，变异体序列(YFLEILWRL)与野生型序列相较，其普遍见于东南亚人群的变异序列不仅难被表位特异性CTL识别，也明显的不被HLA A2结合。相反地，虽然一些其他的变异序列(YFLEILWGL和YLMEILWRL)不易被T细胞识别，但它们对HLA A2的结合却没有明显影响。虽然该表位内有如此高的程度的遗传变异的确切原因/机制还未明，但有可能是来自NPC流行的东南亚的分离株中的该表位内的突变可以有助于保护这些分离株免受EBV特异性CTL应答的影响。
鉴于LMP1有高度致癌可能性，所以基于全长LMP1的疫苗或免疫疗法策略很不可能是治疗NPC与HD的优先选择。而且，本研究表明了在大多数健康的病毒携带者中，LMP1通常只引发低水平的丁细胞应答。推测这是因为LMP1位于贯穿膜的区域，使其不易进入典型的MHC I型代谢路径。使用高度保守的LMP1与LMP2表位作为多表位疫苗明显地能够克服这些潜在的限制。
相应地，本申请发明人已经证明了用表达含有一系列邻近的最小LMP1与LMP2CTL表位的LMP多表位蛋白的腺病毒载体免疫接种能够引起多重独立的MHC-限制性CTL应答。这些表位不仅被人类细胞进行有效的内源性加工，也能在健康的病毒携带者中唤起对LMP抗原具有特异性的记忆型CTL应答。而且，腺病毒多表位疫苗也能引发初级T细胞应答，这显示其在肿瘤攻击系统中有治疗效果。
于此需特别强调，用于HD和NPC的基于多表位的疫苗有许多优于传统疫苗的地方，它是基于全长的LMP抗原。多表位蛋白尤其不稳定，而且由于它们的限制性2级与3级结构，它们在细胞质中会快速地被分解。另一方面，全长的LMP抗原不可能被快速分解，而且可以引起细胞内多种讯号传导作用导致注射部位的二级癌症的发生。其它重要优点包括，多表位疫苗以相对微小的构造，不需其它相关物质，就可引发长期保护性CTL应答以对抗大量的CTL表位。最后，基于多表位的疫苗也可能能够克服全世界不同地理人群中广泛存在的LMP1遗传变异的潜在问题。
如果基于CTL的NPC与HD的治疗可以应用于显著性数量的患者，靶的群体必须通过以高频率存在的HLA等位基因的频率必须要高。在本文中，除了通过A11，A24和B40被限制的LMP1，LMP2特异性应答的等位基因特别令人感到兴趣，因为这些等位基因在中国南方人群中很常见(A11，56％；A24，27％；B40，28％)，特别其中NPC是地方性疾病。因此，我们发展出一种新的LMP多表位治疗疫苗，使用含有LMP1与LMP2两表位的不具复制能力的腺病毒，这些表位被普遍存于不同种族人群中的HLA等位基因，A2，A11，A23，A24，B27，B40和B57所限制。估计这些优先筛选的MHC I型限制性表位可有效作用在90％以上的亚洲，非洲以及高加索人群。
整个专利说明书的主要目的是要描述本发明的优选实施方案，但而不将本发明限制于任一实施方案或特定的特性集合。此文中所解释描述的实施例可做不同的改变或修饰而不会背弃本发明的精神和范围。
本说明书中提及的所有计算机程序，计算方法，专利以及科学文献在此处通过引用都完整地整合到本说明书中。
参考文献1.Anagnostopoulos，I.and M.Hummel.1996.Epstein-Ban-virus intumours.Histopathology 29297-315.
2.Bharadwaj，M.，P.G.Parsons，and D.J.Moss.2001.Cost-efficientquantification of enzyme-linked immunospot.Biotechniques 2001.Jan.；30.(1.)36.-8.3036-38.
3.Burrows，S.R.，S.J.Rodda，A.Suhrbier，H.M.Geysen，and D.J.Moss.1992.The specificity of recognition of a cytotoxic T lymphocyteepitope.Eur.J.Immunol.22191-195.
4.Gahn B，Siller-Lopez F，Pirooz AD，Yvon E，Gottschalk S，Longnecker R，Brenner MK，Heslop HE，Aguilar-Cordova E，RooneyCM.2001.Adenoviral gene transfer into dendritic cells efficientlyamplifies the immune response to LMP2A antigena potential treatmentstrategy for Epstein-Barr virus-positive Hodgkin′s lymphoma.Int.J.Cancer 93706-713.
5.Gires，O.，F.Kohlhuber，E.Kilger，M.Baumann，A.Kieser，C.Kaiser，R.Zeidler，B.Scheffer，M.Ueffing，and W.Hammerschmidt.1999.Latent membrane protein 1 of Epstein-Barr virus interacts with JAK3 andactivates STAT proteins.EMBO J.183064-3073.
6.Goulder，P.J.，y.Tang，S.I.Pelton and B.D.Walker.2000.HLA-B57-restricted cytotoxic T-lymphocyte activity in a single infectedsubject toward two optimal epitopes，one of which is entirely containedwithin the other.J.Virol.74529l-5299.
7.Hammarskjld，M.L.and M.C.Simurda.1992.Epstein-Barr viruslatent membrane protein transactivates the human inmmnodeficiencyvirus type 1long terminal repeat through induction of NF-kappa Bactivity.J.Virol.666496-6501.
8.Henderson，S.，M.Rowe，C.Gregory，D.Croom-Carter，F.Wang，RLongnecker，E.Kieff，and A.B.Rickinson.1991.Induction of bcl-2expression by Epstein-Barr virus latent membrane protein 1 protectsinfected B cells froprogrammed cell death.Cell 651107-1115.
9.Khanna，R.，S.R.Burrows，J.Nicholls，L.M.Poulsen.1998.Identification of cytotoxic T cell epitopes within Epstein-Barr virus(EBV)oncogene laten membrane protein 1(LMP1)evidence for HLA A2supertype-restricted immune recognition of EBV-infected cells byLMPl-specific cytotoxic T lymphocytes Eur.J.Immunol.28451-458.
10.Khanna，R.and S.R.Burrows.2000.Role of cytotoxic tlymphocytes in Epstein-Barr virus-associated diseases.Annu.Rev.Microbiol.5419-48.
11.Khanna，R.，S.R.Burrows，M.G.Kurilla，C.A.Jacob，I.S.Misko，T.B.Sculley，E.Kieff，and D.J.Moss.1992.Localization of Epstein-Barrvirus cytotoxic T-cell epitopes using recombinant vacciniaimplicationsfor vaccine development.J.Exp.Med.176169-176.
12.Kienzle，N.，M.Buck，S.L.Silins，S.R.Burrows，D.J.Moss，A.Winterhalter，A.Brooks，and R.Klaannn2000.Differential splicing ofantigen-encoding RNA reduces endogenous epitope presentation thatregulates the expansion and cytotoxicity ofT cells.J.Immunol.1651840-1846.
13.Kulwichit，W.，R.H.Edwards，E.M.Davenport，J.F.Baskar，V.Godfrey，and N.Raab-Traub.1998.Expression of the Epstein-Barr viruslatent membrane protein 1induces B cell lymphoma in transgemc mice.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S A.9511963-11968.
14.Laherty，C.D.，H.M.Hu，A.W.Opipari，F.Wang，and V.M.Dixit.1992.The Epstein-Barr virus LMP1 gene product induces A20 zincfinger protein expression by activating nuclear factor k B.J.Biol.Chem.26724157-24160.
15.Lee，S.P.，R.J.Tierney，W.A.Thomas，J.M.Brooks，and A.B.Rickinson 1997.Conserved CTL epitopes within EBV latent membraneprotein 2a potential target for CTL-based tumor therapy.J.Immunol.1583325-3334.
16.Leen，A.，P.Meij，I.Redchenko，J.Middeldorp，E.Bloemena，A.Rickinson and N.Blake.2001.Differential immunogenicity ofEpstein-Barr virus latent-cycle proteins for human CD4(+)T-helper 1responses.J Virol 758649-59.
17.Levitskaya，J.，M.Coram，V.Levitsky，S.Imreh，P.M.SteigerwaldMullen G.Klein，M.G.Kurilla，and M.G.Masucci.1995.Inhibition ofantigen processing by the internal repeat region of the Epstein-Barr virusnuclear antigen-1.Nature.375685-688.
18.Meij，P.，A.Leen，A.B.Rickinson，S.Verkoeijen，M.B.Vervoort，E.Bloemena，and J.M.Middeldorp.2002.Identification and prevalence ofCD8(+)T-cell responses directed against Epstein-Barr virus-encodedlatent membrane protein l and latent membrane protein 2.Int.J.Caneer9993-99.
19.Mosialos，G.，M.Birkenbach，R.Yalamanchili，T.VanArsdale，C.Ware，and E.Kieff.1995.The Epstein-Barr virus transforming protemLMP 1engages signaling proteins for the tumor necrosis factor receptorfamil y.Cell 80389-399.
20.Moss，D.J.，I.S.Misko，S.R.Burrows，K.Burman，R.McCarthy，and T.B.Sculley.1988.Cytotoxic T-cell clones discriminate between A-and B-type Epstein-Barr virus transformants.Nature 331719-721.21.Murray，N.and A.McMichael.1992.Antigen presentation in virusinfection.Curr.Opin.Immunol.4401-407.
22.Ranieri E，Herr W，Gambotto A，Olson W，Rowe D，Robbins PD，Kierstead LS，Watkins SC，Gesualdo L，Storkus WJ.1999.Dendritic cellstransduced with an adenovirus vector encoding Epstein-Barr virus latentmembrane protein 2Ba new modality for vaccination.J Virol.7310416-25.
23.Rickinson，A.B.and E.Kieff.1996.Epstein-Ban-Virus，p.2397-2446.In B.N.Fields，D.M.Knipe，and P.M.HoWley(eds.)，FieldsVirology.Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia.
24.Salter，R.D.and P.Cresswell.1986.Impaired assembly andtransport of HLA-A and-B antigens in a mutant TxB cell hybrid.EMBOJ.5943-949.
25.Theobald，M.Biggs，J.Hermandez，J.Lustgarten，J.Labadie，C.Sherman L.A.1997.Tolerance to p53 by A2.1-restricted cytotoxic Tlymphocytes.J.Exp.Med.185833-841.
26.Wang，F.C.Gregory，C.Sample，M.Rowe，D.Liebowitz，R.Murray，A.Rickinson，E.Kieff.1990.Epstein-Barr virus latent membraneprotein(LMP1)and nuclear proteins 2and 3C are effectors of phenotypicchanges in B lymphocytes EBNA-2and LMPl cooperatively induceCD23.J.Virol.642309-2318.
表1
表2
表3
TDDSGHESDSNSNEGRH
表4
表5
序列表<110>The Council of the Queensland Institute of MedicalResearchKhanna，RajivJaikumar，Duraiswamy<120>Epstein Barr Virus Peptide Epitopes，Polyepitopesand Delivery System Therefor<130>11441US2<140>PCT/AU2003/01451<141>2003-11-03<150>2003901792<151>2003-04-15<150>2002952524<151>2002-11-07<160>125<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>1Tyr Leu Gln Gln Asn Trp Trp Thr Leu1 5<210>2<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>2Glu Ser Asp Ser Asn Ser Asn Glu Gly1 5<210>3<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus
<400>3Tyr Leu Leu Glu Met Leu Trp Arg Leu1 5<210>4<211>3<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>4Gln Arg His1<210>5<211>5<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>5Ala Gly Asn Asp Gly1 5<210>6<211>3<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>6Gln Asn Trp1<210>7<211>4<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>7Val Leu Tyr Ser1<210>8<211>6
<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>8Asp Ser Asn Ser Asn Glu1 5<210>9<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>9Gln Arg His Ser Asp Glu His His His1 5<210>10<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>10Gly Gln Arg His Ser Asp Glu His His1 5<210>11<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>11Tyr Tyr His Gly Gln Arg His Ser Asp1 5<210>12<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>12Trp Met Tyr Tyr His Gly Gln Arg His1 5
<210>13<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>13Tyr Tyr His Gly Gln Arg His Ser Asp Glu His His1 5 10<210>14<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>14Ile Trp Met Tyr Tyr His Gly Gln Arg His Ser Asp1 5 10<210>15<211>17<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>15Leu Ile Trp Met Tyr Tyr His Gly Gln Arg His Ser Asp GluHis His1 5 10 15His<210>16<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>16Ala Gly Asn Asp Gly Gly Pro Pro Gln1 5<210>17
<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>17Pro Ser Asp Ser Ala Gly Asn Asp Gly1 5<210>18<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>18Ser Asp Ser Ala Gly Asn Asp Gly Gly Pro Pro Gln1 5 10<210>19<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>19Asp Ser Ala Gly Asn Asp Gly Gly Pro Pro Gln Leu1 5 10<210>20<211>17<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>20Pro His Ser Pro Ser Asp Ser Ala Gly Asn Asp Gly Gly ProPro Gln1 5 10 15Leu<210>21<211>9
<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>21Ile Ala Leu Tyr Leu Gln Gln Asn Trp1 5<210>22<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>22Ala Leu Tyr Leu Gln Gln Asn Trp Trp1 5<210>23<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>23Gln Asn Trp Trp Thr Leu Leu Val Asp1 5<210>24<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>24Leu Tyr Leu Gln Gln Asn Trp Trp Thr1 5<210>25<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>25Ile Ala Leu Tyr Leu Gln Gln Asn Trp Trp Thr Leu1 5 10
<210>26<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>26Tyr Leu Gln Gln Asn Trp Trp Thr Leu Leu Val Asp1 5 10<210>27<211>17<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>27Leu Ile Ile Ala Leu Tyr Leu Gln Gln Asn Trp Trp Thr LeuLeu Val1 5 10 15Asp<210>28<211>10<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>28Ala Leu Leu Val Leu Tyr Ser Phe Ala Leu1 5 10<210>29<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>29Leu Leu Val Leu Tyr Ser Phe Ala Leu1 5<210>30
<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>30Ala Leu Leu Val Leu Tyr Ser Phe Ala1 5<210>31<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>31Val Leu Tyr Ser Phe Ala Leu Met Leu1 5<210>32<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>32Ala Leu Leu Val Leu Tyr Ser Phe Ala Leu Met Leu1 5 10<210>33<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>33Gly Ala Leu Leu Val Leu Tyr Ser Phe Ala Leu Met1 5 10<210>34<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>34Asp Trp Thr Gly Gly Ala Leu Leu Val Leu Tyr Ser1 5 10
<210>35<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>35Gly Gly Ala Leu Leu Val Leu Tyr Ser Phe Ala Leu1 5 10<210>36<211>17<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>36Asp Trp Thr Gly Gly Ala Leu Leu Val Leu Tyr Ser Phe AlaLeu Met1 5 10 15Leu<210>37<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>37Asp Ser Asn Ser Asn Glu Gly Arg His1 5<210>38<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>38Ser Gly His Glu Ser Asp Ser Asn Ser Asn Glu Gly1 5 10
<210>39<211>17<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>39Thr Asp Asp Ser Gly His Glu Ser Asp Ser Asn Ser Asn GluGly Arg1 5 10 15His<210>40<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>40Ala Leu Leu Val Leu Tyr Ala Phe Ala1 5<210>41<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>41Ile Ala Leu Tyr Leu His Gln Asn Trp1 5<210>42<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>42Ile Ala Leu Tyr Leu Gln His Asn Trp1 5<210>43
<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>43Leu Ala Leu Tyr Leu Gln Gln Asn Trp1 5<210>44<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>44Tyr Phe Leu Glu Ile Leu Trp Arg Leu1 5<210>45<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>45Tyr Phe Leu Glu Ile Leu Trp Gly Leu1 5<210>46<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>46Tyr Leu Leu Glu Ile Leu Trp Arg Leu1 5<210>47<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>47Tyr Phe Leu Asp Ile Leu Trp Arg Leu1 5
<210>48<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>48Tyr Leu Met Glu Ile Leu Trp Arg Leu1 5<210>49<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>49Tyr Leu His Gln Asn Trp Trp Thr Leu1 5<210>50<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>50Tyr Leu Gln His Asn Trp Trp Thr Leu1 5<210>51<211>11<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>51Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile1 5 10<210>52<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>52Pro Tyr Leu Phe Trp Leu Ala Ala Ile
1 5<210>53<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>53Thr Tyr Gly Pro Val Phe Met Cys Leu1 5<210>54<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>54Arg Arg Arg Trp Arg Arg Leu Thr Val1 5<210>55<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>55Leu Leu Ser Ala Trp Ile Leu Thr Ala1 5<210>56<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>56Leu Thr Ala Gly Phe Leu Ile Phe Leu1 5<210>57<211>10<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>57
Val Met Ser Asn Thr Leu Leu Ser Ala Trp1 5 10<210>58<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>58Ile Glu Asp Pro Pro Phe Asn Ser Leu1 5<210>59<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>59Cys Leu Gly Gly Leu Leu Thr Met Val1 5<210>60<211>18<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>60Leu Val Leu Gly Ile Trp Ile Tyr Leu Leu Glu Met Leu TrpArg Arg1 5 10 15Leu Gly<210>61<211>17<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>61
Arg His Ser Asp Glu His His His Asp Asp Ser Leu Pro HisPro Gln1 5 10 15Gln<210>62<211>27<212>DNA<213>Epstein Barr Virus<400>62gccctccttg tcctctattc ctttgct27<210>63<211>27<212>DNA<213>Epstein Barr Virus<400>63gcgctccttg tcctctattc ctttgct27<210>64<211>27<212>DNA<213>Epstein Barr Virus<400>64gcactcttgg tcctctattc ctttgct27<210>65<211>27<212>DNA<213>Epstein Barr Virus<400>65gcgctccttg tcctctatac ctttgct
27<210>66<211>27<212>DNA<213>Epstein Barr Virus<400>66attgctctct atctacaaca aaactgg27<210>67<211>27<212>DNA<213>Epstein Barr Virus<400>67attgctctct atctacacca aaactgg27<210>68<211>27<212>DNA<213>Epstein Barr Virus<400>68cttgctctct atctacaaca aaactgg27<210>69<211>27<212>DNA<213>Epstein Barr Virus<400>69attgctctct atctacaaca caactgg27<210>70<211>27<212>DNA<213>Epstein Barr Virus<400>70
tacttattgg agatgctctg gcgactt27<210>71<211>27<212>DNA<213>Epstein Barr Virus<400>71tacttcttgg agattctctg gcgactt27<210>72<211>27<212>DNA<213>Epstein Barr Virus<400>72tacttcttgg agattctctg ggggctt27<210>73<211>27<212>DNA<213>Epstein Barr Virus<400>73tacttattgg agattctctg gcgactt27<210>74<211>27<212>DNA<213>Epstein Barr Virus<400>74tacttcttgg agattctctg gcggctt27<210>75<211>27<212>DNA<213>Epstein Barr Virus
<400>75tacttcttgg acattctctg gcggctt27<210>76<211>27<212>DNA<213>Epstein Barr Virus<400>76tacctaatgg agattctctg gcgactt27<210>77<211>27<212>DNA<213>Epstein Barr Virus<400>77tatctacaac aaaactggtg gactcta27<210>78<211>27<212>DNA<213>Epstein Barr Virus<400>78tatctacacc aaaactggtg gactcta27<210>79<211>27<212>DNA<213>Epstein Barr Virus<400>79tatctacaac acaactggtg gactcta27<210>80<211>27
<212>DNA<213>Epstein Barr Virus<400>80tacttcttgg aaattctctg gcggctt27<210>81<211>122<212>PRT<213>Synthetic protein sequence<400>81Met Pro Tyr Leu Phe Trp Leu Ala Ala Ile Ser Ser Cys SerSer Cys1 5 10 15Pro Leu Ser Lys Ile Thr Tyr Gly Pro Val Phe Met Cys LeuArg Arg20 25 30Arg Trp Arg Arg Leu Thr Val Leu Leu Ser Ala Trp Ile LeuThr Ala35 40 45Leu Thr Ala Gly Phe Leu Ile Phe Leu Cys Leu Gly Gly LeuLeu Thr50 55 60Met Val Val Met Ser Asn Thr Leu Leu Ser Ala Trp Ile GluAsp Pro65 70 75
80Pro Phe Asn Ser Leu Tyr Leu Leu Glu Met Leu Trp Arg LeuTyr Leu85 90 95Gln Gln Asn Trp Trp Thr Leu Ala Leu Leu Val Leu Tyr SerPhe Ala100 105 110Leu Ile Ala Leu Tyr Leu Gln Gln Asn Trp115 120<210>82<211>366<212>DNA<213>Synthetic nucleotide sequence<400>82atgccctacc tgttctggct ggccgccatc agcagctgca gcagctgccccctgagcaag 60atcacctacg gccccgtgtt catgtgcctg aggaggaggt ggaggaggctgaccgtgctg120ctgagcgcct ggattctgac cgccctgacc gccggcttcc tgatcttcctgtgcctgggc180ggcctgctga ccatggtggt gatgagcaac accctgctga gcgcctggatcgaggacccc240cccttcaaca gcctgtacct gctggagatg ctgtggaggc tgtacctgcagcagaactgg300tggaccctgg ccctgctggt gctgtacagc ttcgccctga tcgccctgtacctgcagcag360
aactgg366<210>83<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>83Leu Tyr Leu Gln Gln Asn Trp Trp Thr Leu Leu Val1 5 10<210>84<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>84Ala Leu Tyr Leu Gln Gln Asn Trp Trp Thr Leu Leu1 5 10<210>85<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>85Ile Ala Leu Tyr Leu Gln Gln Asn Trp Trp Thr Leu1 5 10<210>86<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>86Ile Ile Ala Leu Tyr Leu Gln Gln Asn Trp Trp Thr1 5 10<210>87<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus
<400>87Leu Ile Ile Ala Leu Tyr Leu Gln Gln Asn Trp Trp1 5 10<210>88<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>88His Glu Ser Asp Ser Asn Ser Asn Glu Gly Arg His1 5 10<210>89<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>89Gly His Glu Ser Asp Ser Asn Ser Asn Glu Gly Arg1 5 10<210>90<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>90Asp Ser Gly His Glu Ser Asp Ser Asn Ser Asn Glu1 5 10<210>91<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>91Asp Asp Ser Gly His Glu Ser Asp Ser Asn Ser Asn1 5 10<210>92<211>12
<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>92Thr Asp Asp Ser Gly His Glu Ser Asp Ser Asn Ser1 5 10<210>93<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>93Pro Ser Asp Ser Ala Gly Asn Asp Gly Gly Pro Pro1 5 10<210>94<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>94Ser Pro Ser Asp Ser Ala Gly Asn Asp Gly Gly Pro1 5 10<210>95<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>95His Ser Pro Ser Asp Ser Ala Gly Asn Asp Gly Gly1 5 10<210>96<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>96Pro His Ser Pro Ser Asp Ser Ala Gly Asn Asp Gly1 5 10
<210>97<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>97Thr Gly Gly Ala Leu Leu Val Leu Tyr Ser Phe Ala1 5 10<210>98<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>98Trp Thr Gly Gly Ala Leu Leu Val Leu Tyr Ser Phe1 5 10<210>99<211>12<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>99Asp Trp Thr Gly Gly Ala Leu Leu Val Leu Tyr Ser1 5 10<210>100<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>100Leu Val Leu Tyr Ser Phe Ala Leu Met1 5<210>101<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>101Gly Ala Leu Leu Val Leu Tyr Ser Phe1 5
<210>102<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>102Gly Gly Ala Leu Leu Val Leu Tyr Ser1 5<210>103<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>103Thr Gly Gly Ala Leu Leu Val Leu Tyr1 5<210>104<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>104Trp Thr Gly Gly Ala Leu Leu Val Leu1 5<210>105<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>105Asp Trp Thr Gly Gly Ala Leu Leu Val1 5<210>106<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>106
Gln Gln Asn Trp Trp Thr Leu Leu Val1 5<210>107<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>107Leu Gln Gln Asn Trp Trp Thr Leu Leu1 5<210>108<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>108Leu Tyr Leu Gln Gln Asn Trp Trp Thr1 5<210>109<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>109Ile Ile Ala Leu Tyr Leu Gln Gln Asn1 5<210>110<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>110Leu Ile Ile Ala Leu Tyr Leu Gln Gln1 5<210>111<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus
<400>111Gly Asn Asp G1y Gly Pro Pro Gln Leu1 5<210>112<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>112Ala Gly Asn Asp Gly Gly Pro Pro Gln1 5<210>113<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>113Ser Ala Gly Asn Asp Gly Gly Pro Pro1 5<210>114<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>114Asp Ser Ala Gly Asn Asp Gly Gly Pro1 5<210>115<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>115Ser Asp Ser Ala Gly Asn Asp Gly Gly1 5<210>116<211>9<212>PRT
<213>Epstein Barr Virus<400>116Ser pro Ser Asp Ser Ala Gly Asn Asp1 5<210>117<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>117His Ser Pro Ser Asp Ser Ala Gly Asn1 5<210>118<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>118Pro His Ser Pro Ser Asp Ser Ala Gly1 5<210>119<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>119Ser Asp Ser Asn Ser Asn Glu Gly Arg1 5<210>120<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>120His Glu Ser Asp Ser Asn Ser Asn Glu1 5<210>121
<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>121Gly His Glu Ser Asp Ser Asn Ser Asn1 5<210>122<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>122Ser Gly His Glu Ser Asp Ser Asn Ser1 5<210>123<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>123Asp Ser Gly His Glu Ser Asp Ser Asn1 5<210>124<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>124Asp Asp Ser Gly His Glu Ser Asp Ser1 5<210>125<211>9<212>PRT<213>Epstein Barr Virus<400>125
Thr Asp Asp Ser Gly His Glu Ser Asp1 权利要求
1.一种分离的EBV CTL肽表位，其包含LMP1蛋白中的至少9个连续的氨基酸残基，其中所述EBV CTL肽不是YLQQNWWTL(SEQ ID NO1)；ESDSNSNEG(SEQ ID NO2)或YLLEMLWRL(SEQ ID NO3)。
2.权利要求1的分离的EBV CTL肽表位，其包含一段选自下列所构成的组的氨基酸序列(i)QRH(SEQ ID NO4)；(ii)AGNDG(SEQ ID NO5)；(i)QNW(SEQ ID NO6)，特别排除序列YLQQNWWTL(SEQ ID NO1)；(iv)VLYS(SEQ ID NO7)；和(v)DSNSNE(SEQ ID NO8)，特别排除氨基酸序列ESDSNSNEG(SEQ ID NO2)。
3.权利要求2的分离的EBV CTL肽表位，基本上由选自由以下所构成的组的氨基酸序列所组成(i)QRHSDEHHH(SEQ ID NO9)；(ii)GQRHSDEHH(SEQ ID NO10)；(iii)YYHGQRHSD(SEQ ID NO11)；和(iv)WMYYHGQRH(SEQ ID NO12)。
4.权利要求3的分离的EBV CTL肽表位，基本上由选自由以下所构成的组的氨基酸序列所组成(i)YYHGQRHSDEHH(SEQ ID NO13)；(ii)IWMYYHGQRHSD(SEQ ID NO14)；和(iii)LIWMYYHGQRHSDEHHH(SEQ ID NO15)。
5.权利要求2的分离的EBV CTL表位，基本上由选自由以下所构成的组的氨基酸序列所组成(i)AGNDGGPPQ(SEQ ID NO16)；和(ii)PSDSAGNDG(SEQ ID NO17)。
6.权利要求5的分离的EBV CTL表位，基本上由选自由以下所构成的组的氨基酸序列所组成(i)SDSAGNDGGPPQ(SEQ ID NO18)；(ii)DSAGNDGGPPQL(SEQ ID NO19)；和(iii)PHSPSDSAGNDGGPPQL(SEQ ID NO20)。
7.权利要求2的分离的EBV CTL表位，基本上由选自由以下所构成的组的氨基酸序列所组成(i)IALYLQQNW(SEQ ID NO21)；(ii)ALYLQQNWW(SEQ ID NO22)；(iii)QNWWTLLVD(SEQ ID NO23)；和(iv)LYLQQNWWT(SEQ ID NO24)。
8.权利要求7的EBV CTL表位，基本上由选自由以下所构成的组的氨基酸序列所组成(i)IALYLQQNWWTL(SEQ ID NO25)；(ii)YLQQNWWTLLVD(SEQ ID NO26)；和(iii)LIIALYLQQNWWTLLVD(SEQ ID NO27)。
9.权利要求2的EBV CTL肽表位，基本上由选自由以下所构成的组的氨基酸序列所组成(i)ALLVLYSFAL(SEQ ID NO28)；(ii)LLVLYSFAL(SEQ ID NO29)；(iii)ALLVLYSFA(SEQ ID NO30)；和(iv)VLYSFALML(SEQ ID NO31)。
10.权利要求9的EBV CTL肽表位，基本上由选自由以下所构成的组的氨基酸序列所组成(i)ALLVLYSFALML(SEQ ID NO32)；(ii)GALLVLYSFALM(SEQ ID NO33)；(iii)DWTGGALLVLYS(SEQ ID NO34)；(iv)GGALLVLYSFAL(SEQ ID NO35)；和(v)DWTGGALLVLYSFALML(SEQ ID NO36)。
11.权利要求2的EBV CTL肽表位，基本上由选自由以下所构成的组的氨基酸序列所组成(i)DSNSNEGRH(SEQ ID NO37)；(ii)SGHESDSNSNEG(SEQ ID NO38)；和(iii)TDDSGHESDSNSNEGRH(SEQ ID NO39)。
12.一种分离的EBV CTL肽表位基本上由选自由以下所构成的组的氨基酸序列所组成SEQ ID NO9；SEQ ID NO10；SEQ ID NO11；SEQ ID NO12；SEQ ID NO16；SEQ ID NO17；SEQ ID NO21；SEQ ID NO22；SEQ ID NO23；SEQ ID NO24；SEQ ID NO28；SEQ ID NO29；SEQ ID NO30；SEQ ID NO31；以及SEQ IDNO37。
13.一种分离的EBV肽表位的变异体，具有SEQ ID NO40-50中任一的氨基酸序列。
14.一种分离的蛋白质，它包含至少一种根据权利要求1-12中任一项的EBV CTL表位。
15.权利要求14的分离的蛋白质，其为一种多表位蛋白质，包含由以下所构成的组的氨基酸序列ALLVLYSFA(SEQ ID NO30)和IALYQQNW(SEQ ID NO21)。
16.权利要求14的分离的多表位蛋白质，其包含13种EBV CTL表位，这些表位分别具有氨基酸序列YLLEMLWRL(SEQ ID NO3)；YLQQNWWTL(SEQ ID NO1)；ALLVLYSFA(SEQ ID NO30)；IAYLQQNW(SEQ ID NO21)；SSCSSCPLSKI(SEQ ID NO51)；PYLFWLAAI(SEQ ID NO52)；TYGPVFMCL(SEQ ID NO53)；RRRWRRLTV(SEQ ID NO54)；LLSAWILTA(SEQ ID NO55)；LTAGFLIFL(SEQ ID NO56)；VMSNTLLSAW(SEQ IDNO57)；IEDPPFNSL(SEQ ID NO58)；CLGGLLTMV(SEQID NO59)。
17.权利要求15的分离的多表位蛋白质，其包含如SEQ IDNO81所列的氨基酸序列。
18.一种分离的核酸，其编码权利要求1-12中任一项的分离的EBV CTL表位。
19.一种分离的核酸，其编码权利要求14-17中任一项的分离的蛋白质。
20.一种分离的核酸，其编码权利要求13的变异体EBV肽表位。
21.权利要求20的分离的核酸，包含如SEQ ID NO63-65，67-69，71-76或78-80所示的任一核苷酸序列。
22.权利要求19的分离的核酸，其包含如SEQ ID NO80所示的核苷酸序列。
23.一种表达结构，其包含权利要求18-22项中任一项的分离的核酸，其可操作地连接到表达载体中的调控核苷酸序列上。
24.权利要求23的表达结构，其是基于腺病毒。
25.权利要求24的表达结构，其编码如SEQ ID NO81所示的氨基酸序列。
26.包含权利要求23的表达结构的宿主细胞或生物。
27.一种药物组合物，其包含至少一种根据权利要求1-12中任一项的分离的EBV CTL肽表位，以及药学上可接受的载体，稀释剂或赋形剂。
28.权利要求27的药物组合物，其包含有一段选自由下列所构成的组的氨基酸序列ALLVLYSFA(SEQ ID NO30)与IALYQQNW(SEQ ID NO21)。
29.权利要求27的药物组合物，其包含一多表位蛋白质，所述多表位蛋白质包含如SEQ ID NO81所示的氨基酸序列。
30.一种药物组合物，其包含权利要求23的表达结构以及药学上可接受的载体，稀释剂或赋形剂。
31.权利要求30的药物组合物，其包含一表达结构，该结构编码选自以下所构成的组的氨基酸序列ALLVLYSFA(SEQ IDNO30)和IALYQQNW(SEQ ID NO21)。
32.权利要求29的药物组合物，其包含一表达结构，该结构编码具有如SEQ ID NO81所示的氨基酸序列的多表位蛋白质。
33.权利要求32的药物组合物，其包含如SEQ ID NO82所示的核苷酸序列。
34.权利要求27-33中的任一项的药物组合物，该组合物是一种免疫疗法组合物。
35.权利要求34中的药物组合物，该组合物是疫苗。
36.一种对与EBV相关的疾病的治疗和/或预防方法，该方法包括对动物施用至少一种根据权利要求1-12中任一项的分离的EBVCTL表位。
37.权利要求36的方法，其中至少有一种表位包含选自由以下所构成的组的氨基酸序列ALLVLYSFA(SEQ ID NO30)以及IALYQQNW(SEQ ID NO21)。
38.权利要求36的方法，其中至少有一种肽表位是包含如SEQID NO81所示的氨基酸序列的多表位蛋白质。
39.治疗和/或预防与EBV相关的疾病的方法，包括对动物使用权利要求23的表达结构的步骤。
40.权利要求39的方法，其中的表达结构编码一多表位蛋白，该蛋白包含选自由以下所构成的组的氨基酸序列ALLVLYSFA(SEQ ID NO30)与IALYQQNW(SEQ ID NO21)。
41.权利要求40的方法，其中的表达结构包含如SEQ ID NO82所示的核苷酸序列。
42.权利要求36-41中任何一项的方法，其中与EBV相关的疾病选自B细胞及T细胞非何杰金氏淋巴瘤，何杰金氏病，以及淋巴上皮瘤状癌。
43.权利要42的方法，其中与EBV相关的疾病是鼻咽癌(NPC)。
44.权利要求36-43中任一项的方法，其中的动物是哺乳动物。
45.权利要求44的方法，其中的哺乳动物是人。
46.权利要求45的方法，其中至少一种EBV肽表位的一个或多个是根据要接受治疗的人的HLA类型而选择的。
47.一种抗体，它结合根据权利要求1-12中任一项的EBV CTL表位或权利要求13的变异体。
48.一种测定某一动物是否携带或曾接触过Epstein Barr病毒的检测方法，所述方法包括将分离自所述个体的一种或多种T细胞与根据权利要求1-12中任一项的至少一种EBV肽表位相接触的步骤，所述一种或多种T细胞对至少一种EBV肽表位的应答可以指示该动物是否携带EBV或是曾接触过EBV。
49.权利要求48的方法，其中的动物是哺乳动物。
50.权利要求49的方法，其中的动物是人。
51.一种鉴定EBV CTL表位的方法，该方法包括以下步骤(i)产生大量衍生自EBV LMP1蛋白的不同的肽；(ii)将所述一种或多种上述肽与获自EBV血清阳性的个体的一种或多种T淋巴细胞相结合；(iii)测量在对所述一种或多种肽的应答中所述一种或多种T淋巴细胞的IFN-γ产量，其中IFN-γ产量高于参考量即表示所述一个或多个肽具有至少一个EBV CTL表位。
52.权利要求51的方法，进一步包括步骤(iv)测定是否步骤(ii)所产生的所述一种或多种T淋巴细胞能水解一种或多种被EBV感染的靶细胞。
53.通过权利要求52的方法获得的分离的EBV CTL表位。
54.权利要求53的分离的CTL表位，其具有选自由以下所构成的组的氨基酸序列SEQ ID NO9；SEQ ID NO10SEQ ID NO11；SEQ ID NO12；SEQ ID NO16；SEQ ID NO17；SEQ ID NO21；SEQ ID NO22；SEQ ID NO23；SEQ ID NO24；SEQ ID NO28；SEQ ID NO29；SEQ ID NO30；SEQ ID NO31和SEQ ID NO37。
全文摘要
本发明提供了Epstein Barr病毒LMP1蛋白的免疫原性细胞毒性T细胞表位肽，它具有9到17个氨基酸，其最小共有序列选自QRH，AGNDG，QNW，VLYS和DSNSNE。这些肽不论是单独存在或存在于多表位结构中，在药物组合物、疫苗和治疗与Epstein Barr病毒相关的疾病例如包括但不限于有何杰金氏病和/或鼻咽癌的方法中均是有用的。优选多表位输送方式为基于腺病毒的系统。
文档编号C07K7/06GK1711279SQ200380102880
公开日2005年12月21日 申请日期2003年11月3日 优先权日2002年11月7日
发明者拉吉夫·康纳, 贾库马尔·杜赖斯瓦米 申请人:昆士兰医学研究所理事会