制备特征为双粒病毒组持续抗性的转基因植物的方法

专利名称：制备特征为双粒病毒组持续抗性的转基因植物的方法
技术领域：
本发明涉及制备持续抗双粒病毒组的转基因植物的方法。
更具体说，本发明涉及制备持续抗双粒病毒组的转基因植物的方法，其中转基因由获自病原体的多核苷酸序列构成，该序列经过合适修饰以产生双粒病毒组诱导的转录后基因沉默的无效靶。
已知双粒病毒组是广泛存在的和多种类型的植物病毒，它们感染数种农作物，造成严重的收成损失。这些病毒的特征为由两个成对二十面体颗粒组成病毒粒子。它们的基因组由一条或两条环形单链DNA分子(ssDNA)组成，通过双链中间体在感染细胞的核中复制(Hanley-Bowdoin等，1999)。
双粒病毒组科分为四个属，根据昆虫载体、宿主谱和基因组结构命名为玉米线条病毒属(Mastrevirus)、菜豆金黄花叶病毒属(Begomovirus)、甜菜曲顶病毒属(Curtovirus)和Topocuvirus(Briddon等，1985；Fauquet等，2003)。
一种通过粉虱烟草粉虱传播的番茄植物的严重疾病，在中东、东南亚和非洲长期被称为“番茄黄缩叶病”(Czosnek等，1997)。该疾病可造成100％的收成损失(Pico等，1996；Czosnek等，1997)，它接连传播到整个西地中海区域、抵达撒丁岛、西西里岛和西班牙(Czosnek等，1997)，以及美洲(Pofston等，1997)。
近年来，鉴定并分离到了该疾病的病原，是属于双粒病毒组科、菜豆金黄花叶病毒属的病毒。系统发生研究突出了不同病毒种的存在，它们涉及菜豆金黄花叶病毒属的不同地理来源亚洲、非洲和美洲(Czosnek等，1997)。
番茄黄缩叶病撒丁岛病毒(TYLCSV)种的基因组是单裂的(Kheyr-Pour等，1991)。该DNA双向转录，含有六个开放阅读框(ORF)，两个在病毒链(V)V1和V2上，四个在互补链(C)C1、C2、C3和C4上，如

图1所示。C1和V2 ORF之间有一个称为基因间(IR)区的非编码区，与所有双粒病毒组科的基因组中存在的类似。TYLCSV的基因组组织在结构上类似于双裂菜豆金黄花叶病毒属如番茄金嵌合病毒(TGMV)和非洲木薯病毒(ACMV)的组件A。在双裂菜豆金黄花叶病毒属中，互补链组件A上的ORF的命名为AL1或AC1、AL2或AC2、AL3或AC3、AL4或AC4，而在病毒链上为AR1或AV1、AR2或AV2；在组件B的互补链上为BL1或BC1，在病毒链上为BR1或BV1。
直到现在，用于控制双粒病毒组通过烟草粉虱(Bemisia tabaci)传播感染的策略是基于使用昂贵的细筛网(用于栽培新鲜上市的番茄)，并尤其基于重复的杀虫剂处理(用于栽培新鲜上市的和加工的番茄)。这些策略导致生产费用的升高，并对农业操作者和消费者构成严重威胁。而且，有报道称烟草粉虱种群开始对杀虫剂吡虫啉产生抗性(Cahill等，1996；Williams等，1996)。
抗性栽培种的开发代表了控制病毒感染最实际和最经济的方式。引入造成番茄黄缩叶病的双粒病毒组抗性的经典育种计划是基于将抗性基因从野生种Lycopersicon转移到栽培番茄种中。因此，获得并商业化了具有不同抗TYLCSV水平的品系，最佳的品系显示出症状减轻和病毒复制低。然而，具有低和平均水平抗性的植物是进一步感染的潜在对象。
需要考虑的另一重要方面是所获品系的农业特征不总是最优化的，但这反映了用于育种计划的栽培番茄的基因型特征。
对引起番茄黄缩叶病的病毒具有免疫能力的番茄品系，也就是没有出现症状也没有出现病毒DNA复制的品系还未推广。
随着遗传工程的出现，开始使用新方法引入抗植物病毒的抗性特征。大多数策略基于在感兴趣植物中引入和表达病原体衍生序列，病原体衍生抗性(PDR)(Sanford& Johnson，1985；Abel等，1986；Tavazza和Lucioli，1993)。
虽然这些策略已经成功应用于引入对具有RNA基因组的植物病毒的抗性特征(Beachy，1997)，但是在具有DNA基因组的双粒病毒组情况下，病原体衍生序列的表达产生了没有持续抗性和/或耐性的植物。
引入通过病原体衍生序列表达获得的病毒抗性的机制可分为两大类a)病原体蛋白的表达，例如显性失活突变体的表达介导的抗性；b)转录后基因沉默介导的抗性(Baulcombe，1996；Beachy，1997；Zaitlin和Palukaitis，2000)。
转录后基因沉默是真核生物中广泛存在的过程，包括形成与靶RNA序列同源的双链RNA(dsRNA)分子后，特定RNA的降解。
虽然可能有不同方式能够诱导产生与转基因同源的dsRNA(在足够长的反向和重复序列的转基因RNA存在下转录异常转基因RNA，将转基因以反向和重复多拷贝整合到植物基因组中)，但一旦产生了dsRNA，后者将被识别并降解成约21-26个核苷酸的dsRNA小分子，称为siRNA。
然后将siRNA整合到称为RISC的多蛋白复合物中，该复合物能够降解与siRNA序列同源的所有RNA。因此，后者代表了RNA沉默特异性的决定因素，它们相关于确定序列的存在决定序列的单义性，即该RNA序列是转录后沉默的。
因此，转录后沉默获自病毒RNA基因组的序列的转基因植物抗同源病毒和具有与转基因密切相关的核苷酸序列的病毒。
病毒感染也可诱导转基因沉默。
实际上，如果转基因的核苷酸序列与感染病毒基因组的一部分同源，那么病毒复制能够诱导一开始并不沉默的转基因沉默。沉默机制的激活包括与诱导物RNA序列同源的RNA分子的特异性降解。
作为直接结果，由病毒激活的沉默与与病毒序列同源的转基因mRNA和病毒基因组的降解相关。这导致宿主在起始的感染步骤后恢复，而新的营养部分被证明不含病毒。恢复现象随后发生的植物组织的一个独特特征是它们对相同病毒的后续感染具有高度抗性。
转录后沉默介导的抗性，由于基于核苷酸水平上的识别，仅产生抗与产生转基因的病毒基因组高度同源的病毒分离物的抗性。相反，基于病原体蛋白表达的策略通常也产生抗从核苷酸角度来看并不密切相关的病毒株或分离物的植物。
也证明，转基因沉默受温度影响，在温度低于15℃时失活(Szittya等，2003)。因此，暴露于温度范围低于15℃的野外条件的植物可丢失沉默介导的抗性。
必须记住的是，虽然几年前就已经通过基于转基因沉默获得了抗RNA基因组病毒的转基因植物，但是迄今为止，未见这些策略可成功应用于双粒病毒组(DNA基因组病毒)的报道。
明确的是，为获得抗广谱双粒病毒组的植物的最佳策略是其中干扰产物是蛋白质的策略。明确的是，抗性谱的宽度增加了所产生植物的农业和商业价值。
因此，在转基因植物中表达双粒病毒组的功能障碍变体的复制型Rep蛋白已用于获得具有抵抗双粒病毒组的较高水平抗性或免疫能力的植物。
文献中已知表达TYLCSV的截短复制型Rep蛋白(Rep-210)能够产生抗病毒感染的抗性，虽然这些抗性并不持久，因为该病毒能够随时间而克服它。
表1和2中分别显示了TYLCSV-土壤接种的Rep-210表达转基因植物一番茄47x野生型(Brunetti等1997)和本萨明那烟草(N.benthamiana)品系102.22(Noris等1996)的抗性分析结果。
表1
表2
从表1和2中所述的结果中可以清楚地推断出，由病原体衍生序列的转基因表达介导的抗TYLCSV抗性，随时间被克服。
类似地，由双裂双粒病毒组“非洲木薯嵌合病毒”的Rep显性失活突变体的转基因表达诱导的抗性也随时间被克服(Sangare等，1999)。
另一个例子是番茄种间杂交体(Lycopersicon esculentum X L. pennellii)中TYLCV壳体蛋白的转基因表达，它产生抗病毒感染的部分抗性(Kunik等，1994)。即使在这种情况下，壳体蛋白的表达介导的抗性也不是长时间持续的，所以从农业观点来看它很少有用。
根据上述内容大家明白，需要有新方法，成功使用获自双粒病毒组的多核苷酸序列以获得持续长时间抗双粒病毒组的植物。
现在，本发明作者已经制备了编码病原体衍生病毒蛋白的多核苷酸序列并能够将病毒抗性赋予宿主，合适地修饰使其成为病毒诱导的转录后基因沉默的无效靶以获得具有持续水平抗双粒病毒组抗性的转基因植物。
实际上，在实验期间，作者证明克服抗性，并因此难于获得持续抗双粒病毒组抗性是由于双粒病毒组转录后沉默转基因并在植物中传播的意外能力，所述植物中与感染病毒具有同源序列的转基因被转录后沉默。
分别如图2和3所示，无论在本萨明那烟草品系102.22转基因植物中还是在番茄47x野生型植物中，病毒克服抗性的能力来源于相同病毒进行的转基因沉默，和来源于病毒在沉默植物中传播的意外能力。
图4所列的内容进一步详述了TYLCSV在转基因Rep-210被转录后沉默的植物中传播的能力。结果显示，土壤接种前被转录后沉默的转基因番茄植物47×10D(Brunetti等，1997)，如不存在Rep-210蛋白和同时存在转基因-同源siRNA时所示，与对照同样易于感染TYLCSV。
从上述得出结论，与RNA病毒相反，双粒病毒组不被病毒基因序列的活性沉默阻断。上述内容不限制所用转基因植物的种类或应该通过土壤感染或烟草粉虱来接种病毒的方式。实际上，如表3所示，每株植物使用降低数量的带病毒粉虱，以使90％和100％之间的对照植物感染，约40％转基因被转录后沉默的转基因植物(品系201)没有或迟感染，然而在较高的接种物浓度下，用带病毒昆虫挑战的所有植物的感染情况都与用土壤接种进行的实验类似。
表3
a每株植物七只带病毒昆虫2天b每株植物三十五只带病毒昆虫5天c接种后周数因此，考虑在相当于高或很高病毒压力条件下用于测试抗性和评价随时间的持续性的病毒土壤接种条件(如图2、3和4以及表1和2中所示)是重要的。该实验方法允许鉴定具有很高抗病毒感染的抗性或免疫能力的转基因植物，因此具有很高的商业价值。
因此，通过病原体衍生序列的表达引入抗双粒病毒组的抗性特征受限于of the双粒病毒组在转录后沉默转基因和在沉默植物中传播的意外能力。
而且，作者显示了在正常感染野生植物期间，对TYLCSV的正义链(V1和V2)和反义链(C1，C2，C3和C4)的转录物进行病毒转录后沉默，如图5所示。这导致通过表达获自相同病原体的序列不可能获得长期抗性，除非合适地修饰使它们不成为病毒诱导转录后基因沉默的靶或成为其无效靶。相反，通过在植物基因组中引入合适突变的或根据本发明选择的序列，可能获得长时间持续抗双粒病毒组的抗性，不像用已知方法获得的那样。
因此，编码获自双粒病毒组的氨基酸序列的多核苷酸序列是本发明目的，所述多核苷酸序列的特征为，它不是病毒转录后沉默的靶或是其无效靶，并具有a)与相应需要对其有抗性的双粒病毒组基因序列的核苷酸同源性低于或等于90％，优选低于或等于80％，更优选低于或等于70％；b)在RNA转录物中与相应需要对其有抗性的双粒病毒组基因序列的连续同源性低于或等于17个核苷酸，优选低于或等于8个核苷酸，更优选低于或等于5个核苷酸；c)包含相应的双粒病毒组基因序列单取代的序列最大长度不多于30个核苷酸，优选不多于20个核苷酸，更优选等于或少于9个核苷酸；所述多核苷酸序列一旦转化后能够产生完整的植物、组织或植物细胞，抗双粒病毒组的持续抗性。
本发明的多核苷酸序列可以是野生型或合成的，或由诱变产生的，它们编码的双粒病毒组衍生的氨基酸序列是干扰病毒感染的野生型或突变序列。
因此本发明包括合适改变的或野生型双粒病毒组多核苷酸序列，如，以在核苷酸水平不同于相应的双粒病毒组基因组序列，且需要根据上面a)、b)和c)中限定和说明的原理引入抗双粒病毒组的抗性。
本发明的其它目的是编码双粒病毒组衍生的氨基酸序列的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列的特征是，它不是转录后沉默的靶或是其无效靶，与需要对其有抗性的双粒病毒组序列的同源性甚至等于100％，截短使其在siRNA群体中与原始序列相比不被充分代表，即使保持相似的干扰能力。
从其构建本发明的多核苷酸序列的基因序列可获自双粒病毒组，如玉米线条病毒、甜菜曲顶病毒、菜豆金黄花叶病毒、Topocuvirus，尤其可获自表4中所示的种及其分离物，更尤其获自表5中所示的番茄黄缩叶病种及其分离物。
表4
表5
菜豆金黄花叶病毒属的种优选为TYLCCNV、TYLCGV、TYLCMaIV、TYLCSV、TYLCTHV、TYLCV、ACMV、BGMV、CaLCuV、ToCMoV、TGMV、ToGMoV、ToMHV、ToMoTV、ToMoV、ToRMV、ToSLCV、ToSRV，棉花缩叶病(CLCrV、CLCuAV、CICuGV、CLCuKV、CLCuMV、CLCuRV)，东非木薯花叶病(EACMCV、EACMMV、EACMV、EACMZV)，马铃薯黄色花叶病(PYMPV、PYMTV、PYMV)，南瓜缩叶病(SLCCNV、SLCV、SLCYV)，甘薯缩叶病(SPLCGV、SPLCV)，烟草缩叶病(TbLCJV、TbLCKoV、TbLCYNV、TbLCZV)，番茄缩叶病(ToLCBV、ToLCBDV、ToLCGV、ToLCKV、ToLCLV、ToLCMV、ToLCNDV、ToLCSLV、ToLCTWW、ToLCVV、ToLCV)，及其分离物。
属于其它的玉米线条病毒属、甜菜曲顶病毒属、Topocuvirus的优选双粒病毒组其它种是WDV、MSV、SSV、BYDV、TYDV、BCTV及其分离物。
属于双粒病毒组基因组的基因序列可以是序列C1/AL1/AC1、C2/AL2/AC2、C3/AL3/AC3、C4/AL4/AC4、V1/AR1/AV1、V2/AR2/AV2、BC1/BL1和BV1/BR1，尤其是前述双粒病毒组及其分离物的序列C1/AL1/AC1。
本发明目的之多核苷酸序列编码的氨基酸序列是能够将抗双粒病毒组抗性赋予表达它的植物的病原体衍生蛋白。因为本发明所述的干扰蛋白是稳定表达的，所以产生独立于蛋白产物通过其诱导抗性的分子机制的持续抗性。
病原体衍生蛋白可以是壳体蛋白、复制相关病毒蛋白(Rep)、基因C2/AL2/AC2、C3/AL3/AC3、C4/AL4/AC4、V2/AR2/AV2、BC1/BL1和BV1/BR1编码的蛋白。
图16A和16B中列出了可能满足上述报道要求的多核苷酸序列的例子，这两幅图显示了编码TYLCSV的Rep-210蛋白的野生型核苷酸序列和合成核苷酸序列的比对，合成核苷酸序列经过修饰使其不成为感染病毒诱导的转录后降解的靶，这两种核苷酸序列编码相同的病毒蛋白。
可用此多核苷酸序列转化的植物、组织或植物细胞可以是番茄、胡椒、烟草、甘薯、棉花、瓜、南瓜、树薯、马铃薯、蚕豆、大豆、绿豆、甜菜、甘蔗、玉米、小麦。
在5’-3’方向上包含异源性多核苷酸序列的构建物是本发明的另一目的a)在所述植物或组织或转化细胞中用作启动子的多核苷酸序列；b)位于编码区5’端的非翻译多核苷酸序列，属于或不属于双粒病毒组基因间区；c)本发明的多核苷酸序列或其片段或变体；d)用作转录终止子的序列，位于所述多核苷酸的3’端。
本发明的另一目的是包含前述构建物的表达载体。
基因组中包含本发明多核苷酸序列的植物、组织或转基因植物细胞、它们的后代以及种子也是本发明目的。
最后，制备长时间抗双粒病毒组的转基因植物、组织或其植物细胞的方法是本发明目的，该方法包括下述步骤
a)“鉴定”或“选择”编码能够产生抗双粒病毒组抗性的氨基酸序列的病毒基因序列；b)诱变或“选择”病毒基因序列，使其成为感染双粒病毒组诱导的转录后沉默的无效靶；c)在植物、组织或其植物细胞中插入双粒病毒组，该病毒突变或选择了步骤b)中通过上述构建物获得的基因序列。
关于本发明方法步骤a)，术语“鉴定”指实验性识别所述能够产生抗双粒病毒组抗性的病毒基因序列，然而术语“选择”指识别已经可用的能够产生不持续抗双粒病毒组抗性的病毒基因序列。因此，本发明方法还提供了对发生在使用已知序列期间的抗双粒病毒组抗性损失问题的解决方案。
具体说，进行步骤b)中预测的诱变维持了与相应需要对其有抗性的双粒病毒组基因序列的核苷酸同源性低于或等于90％，优选低于或等于80％，更优选低于或等于70％，这样分布因而转录RNA与相应双粒病毒组序列的连续同源性低于或等于17个核苷酸，优选低于或等于8个核苷酸，更优选低于或等于5个核苷酸，含天然基因序列单取代的序列最大长度不多于30个核苷酸，优选不多于20个核苷酸，更优选低于或等于9个核苷酸。
根据本发明，在步骤a)中鉴定或选择的多核苷酸序列编码的氨基酸序列可以是与病毒野生型蛋白具有100％同源性的蛋白。
此诱变包括不降低蛋白产生抗双粒病毒组抗性的能力的核苷酸序列上所有突变。可能的突变是沉默点突变和那些导致用具有相似生化性质的氨基酸取代的突变，或缺失和/或插入和/或取代。
或者，本发明方法步骤b)中的诱变由与所述序列类似的多核苷酸序列最大限度的缺失组成，然而维持类似的干扰能力，它在干扰病毒产生的siRNA的天然群体中与原始序列相比未被充分代表。
另外，本发明方法步骤b)中的“选择”可由识别在核苷酸水平与需要对其有抗性的双粒病毒组不同的双粒病毒组野生型序列构成，以致不成为转录后沉默的靶或成为其无效靶。
具体说，本发明方法步骤b)中的诱变过程由步骤a)的病毒基因序列的3’或5’区缺失构成，直到在siRNA群体中鉴定到与编码野生型蛋白的序列相比未被充分代表的所述基因序列的最小区，所述截短蛋白维持产生抗双粒病毒组抗性的能力。
而且，本发明方法步骤a)中的病毒基因序列可以是TYLCSV C11AL1/AC1基因的序列，氨基酸序列可以是相对于病毒野生型蛋白如Rep-130截短的蛋白。
在本发明的合成多核苷酸序列的各种农业应用中，尤其感兴趣的是它们在获得抗TYLCSV的番茄植物上的用途。
在此
具体实施例方式
中，通过3’缺失修饰编码截短病毒Rep蛋白(Rep-210)的转基因多核苷酸序列，产生TYLCSV-诱导的转录后基因沉默的无效靶，而维持了产生抗性的能力。
具体说，用放射性RNA探针的严谨杂交鉴定到TYLCSV基因组的转录区，这个转录区在TYLCSV对野生植物感染期间产生的病毒-来源的siRNA群体中未被充分代表，如图6和7所示。该区与编码TYLCSV Rep的基因的最初390个核苷酸相对应。它的转录物是病毒-诱导的转录后基因沉默的无效靶，它编码产生稳定表达的Rep-130蛋白，产生持续抗性。
因此，在本发明的具体实施方式
中，本发明多核苷酸序列编码的双粒病毒组如TYLCSV的氨基酸序列可以是截短的Rep-130蛋白(SEQ ID No 9)。在这种情况下，使成为转录后沉默的无效靶或不成为其靶的病毒基因序列是SEQ ID No 8。
上述方法也是本发明目的，其中步骤b)中的诱变由步骤a)的病毒基因序列的沉默点突变构成，该序列维持编码氨基酸序列产生抗双粒病毒组抗性并成为转录后沉默的无效靶或不成为其靶的能力。
具体说，步骤a)的病毒基因序列可以是V1/AR1/AV1(CP)基因，例如TYLCSV的V1/AR1/AV1(CP)基因(SEQ ID No 12)，在具体实施方式
中，使成为转录后沉默的无效靶或不成为其靶的病毒基因序列SEQ ID No 6。
此外，步骤a)的病毒基因序列可以是TYLCSV C1/AL1/AC1基因，在这种情况下，使成为转录后沉默的无效靶或不成为其靶的病毒基因序列可以是SEQ ID No 2或SEQID No 4。
下面将根据本发明的优选实施方式，具体参考附图对本发明进行示例性而非限制性描述图1显示番茄黄色缩叶病撒丁岛种病毒(TYLCSV)的基因组。DNA是双向转录的，它包含六个部分或完全重叠的开放阅读框(ORF)，两个在病毒链(V)V1和V2上，四个在互补链(C)C1、C2、C3和C4上；图2显示Rep-210蛋白在TYLCSV-土壤接种的转基因本萨明那烟草植物(品系102.22)中的表达。符号(-)、(+)和NI分别指健康的、感染的和未接种植物。在用TYLCSV(0wpi)土壤接种前以及接种后四周和八周进行分析(分别是4和8wpi)；
图3显示在用TYLCSV(0wpi)土壤接种前以及接种后二十二周(22wpi)时，Rep-210蛋白和转基因mRNA在番茄植物(品系47X野生型)中的表达。符号(+)和(-)分别指特定时间下感染的和健康的植物；图4显示在TYLCSV土壤接种前，Rep-210蛋白和对应于相关转录物siRNA在转基因番茄植物(47×10D品系)中的表达分析。图片上方的符号(+)和(-)分别指存在和不存在正义和反义C1转基因；wt指对照野生型植物；而siRNA图片下方的符号(+)、(-)和NI分别指存在(+)和不存在(-)病毒，未土壤接种(NI)作为对照；图5显示从TYLCSV感染的野生型番茄植物(样品1-4)和未感染对照(样品C)中抽提的小RNA的Northern印迹；M指分子量标记；图6显示针对TYLCSV基因组的小干扰RNA的分布分析。最上方是TYLCSV基因组的线性图；箭头(V1和V2与病毒基因组极性相同和C1，C2，C3和C4具互补极性)指出转录物；位于病毒基因组图下方的1-9开放框代表九条PCR片段(各自长度约三百个核苷酸)，其中基因组被分开，用溴化乙锭染色，显示了与从TYLCSV-感染的番茄植物中抽提的siRNA的杂交。IR代表第十个PCR片段，对应于TYLCSV基因组的非转录基因间区。图片下方的数字指对应于各PCR片段的杂交信号百分数；图7显示接种四星期后，未土壤接种(样品C)或TYLCSV-土壤接种的(样品1和2)野生型番茄植物中siRNA的存在分析；具体分析了对应于Rep-210(探针A)和对应于Rep-130(探针B)转录物的siRNA；在左边图片上的柱100和50分别对应100和50皮克的与A和B探针同源的寡核苷酸；图8显示pTOM130质粒编码的Rep-130(SEQ ID No 9)的核苷酸序列(SEQ ID No8)。大写的是不属于TYLCSV但获自克隆的核苷酸；下划线序列对应于用于克隆的BamHI和EcoRI限制性位点。粗体显示启动和终止密码子，而斜体和粗体字符是引入用于清除C4蛋白表达的突变；图9显示用TYLCSV感染性克隆(pTOM6)以及如柱上所示表达突变Rep蛋白的质粒共转染的野生型本萨明那烟草原生质体总核酸抽提物的Southern印迹；图10显示在用pTOM6质粒以及表达突变Rep蛋白的质粒共转染的野生型本萨明那烟草原生质体中TYLCSV复制的定量分析；图11显示用于获得表达Rep-130的转基因植物的pTOM130质粒的结构图。LB和RB分别指左右边界；pE35S代表复制的花椰菜花叶病毒35S启动子；Rep-130(SEQID No 8)是编码Rep-130蛋白(SEQ ID No 9)的序列；t35S是花椰菜花叶病毒35S终止子；tNOS是编码胭脂氨酸(nopalin)合成酶基因的终止子；nptll是编码新霉素磷酸转移酶的序列；pNOS是胭脂氨酸合成酶基因的启动子；Kan是卡那霉素抗性基因；图12显示在用pTOM130转化的转基因本萨明那烟草植物中(品系300-309)Rep-130蛋白(SEQ ID No 9)的表达分析；图13显示在表达Rep-130蛋白(SEQ ID No 9)(品系300、301、303)或Rep-210蛋白(102.22)的野生型(wt)和转基因本萨明那烟草原生质体中TYLCSV复制的分析。
图14显示在用pTOM130转化的转基因L.esculenfum植物(品系402、403、406、411、413、416、417)中Rep-130蛋白(SEQ ID No 9)的表达分析。将从表达Rep-130的转基因N.benfhamiana(品系303)中抽提的蛋白用作阳性对照；图15显示用表达Rep-130的pTOM130转化的番茄转基因植物(品系406)和未转化野生型植物之间的比较；图16A和B显示编码Rep-210的合成序列的两个例子(SEQ ID No 2、SEQ ID No4)。显示了编码TYLCSV Rep-210蛋白的野生型核苷酸序列(顶部Seq_cod_Rep210_野生型；SEQ ID No 1)和修饰以成为病毒-诱导转录后沉默的无效靶的合成核苷酸序列(底部Seq_cod_Rep210_沉默消减；SEQ ID No 2、SEQ ID No 4)之间的比对。在合成序列中，用阴影表示与野生型序列相比突变的核苷酸；图17显示通过将质粒野生型基因pTOM102(C4-)和合成基因Rep-210沉默消减B(SEQ ID No 4)(质粒pTOM102 Syn)编码的Rep-210蛋白土壤渗入本萨明那烟草叶中进行的瞬时表达的分析；图18显示通过土壤共渗入含有TYLCSV感染性克隆的根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)株以及含有a)表达Rep-210 SEQ ID No 1(Brunetti等，2001)的野生型基因的pTOM102(C4-)质粒，品系1-3；b)表达编码Rep-210的合成基因(Rep-210沉默消减B；SEQ ID No 4)的pTOM102Syn质粒，品系4-6；c)空克隆质粒pBIN19，品系7-9的根癌土壤杆菌株抑制病毒复制的瞬时测定。
图19显示用含有Rep-210合成基因、Rep-210-沉默消减B的pTOM102Syn质粒，SEQ ID No 4转化的转基因本萨明那烟草植物(品系506、508A和508B)中Rep-210蛋白的表达分析。将表达Rep-210的转基因番茄植物的蛋白抽提物用作阳性对照；图20显示TYLCSV土壤接种后用pTOM 102(品系102.22，Noris等，1996)或用pTOM 102Syn转化的转基因本萨明那烟草植物(品系506)中Rep-210蛋白的表达分析。在TYLCSV土壤接种之前(0wpi)五周后(5wpi)进行分析；图21显示在本萨明那烟草野生型(WT)或用pTOM 102(品系102.22，Noris等，1996)或pTOM 102Syn转化的转基因植物(品系506)上，通过在2、3、4、5wpi(其中wpi指土壤接种后的周数)时进行“斑点印迹”测定的感染分析；图22显示编码CP的合成序列的一个例子。显示了编码TYLCSV CP的野生型核苷酸序列(顶部TYLCSV CP；SEQ ID No 12)和修饰以成为病毒-诱导的转录后降解的极无效靶或不是其靶的合成核苷酸序列(底部TYLCSV CP沉默消减；SEQ ID No 6)之间的比对。在合成序列中，用阴影表示与野生型序列相比突变的核苷酸。
实施例1鉴定在siRNA群体中未被充分代表的TYLCSV基因组的区。
在TYLCSV天然感染野生型植物中，由TYLCSV基因组两条链转录的病毒序列是转录后基因沉默的靶子，如存在与基因组不同部分同源的siRNA时指出的(图5)。图5显示了从TYLCSV感染的野生型番茄植物(样品1-4)和未感染对照(样品C)中抽提的总RNA的Northern印迹。各图片旁边都说明了所用的探针和限制性位点。也列出了siRNA的估计大小。
为了评价TYLCSV基因组的某些区是否比其它区构成转录后基因沉默的靶子更无效，对siRNA在病毒基因组中的位置分布进行了系统研究。因此将TYLCSV基因组分成九条连续片段，各自约三百个碱基对(如图6所示)，用特异性寡核苷酸进行PCR获得。琼脂糖凝胶电泳后将相同量的这些片段转移到尼龙滤膜上。通过软件Aida对装载到琼脂糖凝胶中的PCR片段进行定量。从总RNA中纯化TYLCSV-感染的番茄植物生产的siRNA，在含有TYLCSV基因组几个区的滤膜上将其末端标记并用作探针(Szittya等，2002)。通过TYPHOON装置，参考相同量的加载片段(Amersham-Pharmacia)评价杂交信号的不同强度。从而检测到siRNA在病毒基因组几个区中的不同分布(图6)。
实施例2鉴定在siRNA群体中未被充分代表的TYLCSV C1基因的区域。
为了鉴定在siRNA群体中未被充分代表的TYLCSV C1基因的区域，从健康的和TYLCSV-感染的番茄植物中抽提总RNA(Brunetti等，1997)。
将三十微克上述RNA进行8％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过借助毛细作用转移到尼龙滤膜上用于Northern印迹。产生两张相同膜，用对应于C1基因5’区不同部分的探针对各膜进行杂交如图7所示。用获自含有42nt非翻译先导序列的C1基因5’部分和C1基因的最初630个核苷酸(约占C1基因的3/5)的探针(探针A)杂交一张滤膜，用获自含有42nt非翻译先导序列的C1基因5’部分和C1基因的最初390个核苷酸的探针(探针B)杂交另一张滤膜。
为了定量地比较通过两种不同探针(获自两种独立的标记过程)获得的结果，将梯度量的与两种探针互补的相同40mer寡核苷酸加载到两张膜上。柱100和50分别对应于100和50皮克的寡核苷酸。将显示寡核苷酸迁移的图片放置在分别含有siRNA的图片旁边，但它们在图中的位置并不对应于凝胶上的位置，因为寡核苷酸和siRNA分子量不同。
体外转录后，对两个探针进行碱水解(Cox等，1984)，以从中获得平均长度为75个核苷酸的片段。
在Dalmay等，2000描述的缓冲液中，39℃下进行16小时杂交。杂交后，在2XSSC，0.2％SDS中40℃洗涤滤膜10分钟两次，45℃洗涤10分钟两次，和45℃洗涤10分钟一次。
值得注意的是，C1基因的近端5’区是怎样在siRNA群体中未被充分代表的。具体说，通过TYPHOON装置(Amersham-Pharmacia)进行的结果的定量分析揭示，与对应于延伸至编码210个氨基酸的核苷酸(探针A)的区域的siRNA相比，对应于此5’区的siRNA约是它的25％(探针B)。所述5’区因此构成了病毒-诱导的转录后基因沉默的无效靶。
用实施例1中描述的方法确证了这些结果，即，这里用从TYLCSV感染的番茄植物中抽提的siRNA群体杂交对应于C1基因这两个不同区的PCR片段。
实施例3构建编码截短Rep的C1基因5’部分的多核苷酸序列。
如此前所指出的(Brunetti等，1997)，Rep-210转基因植物显示出不长久持续的抗性和改变的表型。
如图1所示，C4基因位于截短的C1基因内部的不同阅读框中。
已显示，双粒病毒组C4基因的转基因表达能诱导表型改变(Krake等，1998)。
因此，设计了几个截短的C1构建物，使它们不能表达C4 ORF。
为获得C4(-)突变体，通过引入两个点突变将终止密码子引入C4序列。具体说，参考图8列出的pTOM130序列(SEQ ID No 8)，由C转换成G构成在核苷酸233位突变，将编码C4的阅读框中的TCA密码子(编码丝氨酸)转变为TGA(乳白)。此外，核苷酸231位的突变由C转变成T构成，这在编码C1的阅读框中恢复了亮氨酸密码子(CTC变成TTG，在植物中更具代表性)。
因此，C4蛋白的翻译在仅10氨基酸后被中断，然而C1蛋白的氨基酸序列保持不变。这两个引入的突变是根据在C4阅读框中产生“强大”终止密码子的标准在很多可能突变中选择的，在C1阅读框中保持了与植物使用的密码子相容的亮氨酸密码子。
用下面的突变寡核苷酸进行PCR以进行诱变。
C4正引物(SEQ ID No 10)5’-CT CAT CTC CAT ATTTTGATC CAA TTC GAA G-3’C4负引物(SEQ ID No 11)5’-C TTC GAA TTG GATCAAAAT ATG GAG ATG AG-3’(Kheyr-Pour等，TYLCV 2419-2448，1991)在pGEM102用作模板的两个单独PCR反应中，将这两个突变引物各自与外部引物一起使用(Brunetti等，2001)。
具体说，该外部寡核苷酸是Rev和Univ(M13/pUC测序引物n.1233和1224)。从使用Univ/C4正进行的反应中获得了537bp的片段，而从用Rev/C4负的反应中获得了351bp的片段。
将获得的产物用作用两个外部引物进行的后续扩增反应的模板。
用EcoRI和BamHI限制性酶消化获得的PCR产物，克隆到pJIT60的相应位点中，由此获得pJITR210。在两种情况下都进行了测序，以验证克隆。
实施例4当在植物细胞中表达时能够抑制病毒复制的TYLCSV C1基因最小5’区的鉴定。
为了确定能够产生抗TYLCSV抗性的C1基因最小5’末端区，将C1基因的一系列3’末端缺失突变体克隆到pJIT60表达载体中，产生pJTR系列。
用在末端含有限制性位点的特异性引物以Pfu DNA聚合酶(Stratagene)进行PCR，扩增病毒序列。
将以前描述的编码Rep-210并包含内部C4蛋白终止密码子的pJITR210质粒用作模板。用BamHI和EcoRI酶消化扩增反应获得的片段，并克隆到pJIT60的相应位点中，产生pJTR系列。
测序所有最终克隆，以确认扩增忠实度和载体-插入物连接。表6中列出了每个扩增序列的长度和精确位置。
通过用TYLCSV感染性克隆(pTOM6)与各突变体共转染本萨明那烟草野生型原生质体的测定评价了各Rep缺失突变体产生抗TYLCSV抗性的能力，然后通过Southern印迹分析病毒基因组的复制水平。图9和10中列出了获得的结果。
表6

(1)TYLCSV基因组的核苷酸编号是根据Kheyr-Pour等1991。
根据已经描述过的方法进行原生质体共转染、总核酸抽提和Southern分析(Brunetti等2001)。
通过用洋地黄毒苷-标记的RNA探针进行的Southern印迹分析来自各原生质体样品的总核酸抽提物，该探针对应于编码Rep-210的序列，pGEM-P质粒用作对照。具体说，图9代表总核酸的Southern印迹，其中scDNA和ssDNA分别指TYLCSV的超螺旋和单链DNA。
对于准确地定量分析Rep的几种截短形式的表达对TYLCSV基因组的复制的效果来说，用32P标记的DNA探针进行Southern分析，该探针对应于编码Rep的最初54个N-末端氨基酸的区域，通过用Istant摄像装置(Canberra，Packard)分析来评价在滤膜上检测的各条带相应放射性水平。
在三个独立试验中，重复测定各突变构建物，图10中所列数值代表三个独立实验中的两次或三次共转染的平均值。
在用pTOM6与pGEM-P对照质粒进行的共转染实验中，认为TYLCSV复制水平等于100％。
具体说，图10显示定量分析，柱状图中白色和黑色条分别代表超螺旋和单链DNA的量；误差条表明平均标准差。
通过观察图9和10可指出，Rep蛋白的最初130个N-末端氨基酸足够抑制几乎全部的病毒复制，而最初120个N-末端氨基酸的表达则对其无影响。
实施例5生产表达Rep-130的本萨明那烟草转基因植物。
通过在原生质体中的瞬时表达评价的Rep突变体抑制TYLCSV复制的能力分析揭示出如前述实施例所述的仍有效编码Rep-130(SEQ ID No 9)的最短突变体。
以前也在其它实施例中揭示出，与编码Rep-210的序列相比，编码Rep-130的最接近的C1基因5’部分是转录后基因沉默的较无效靶。
从而获得表达Rep-130的本萨明那烟草转基因植物。为了这个目的，通过将pJTR130的Kpnl-BgIII片段克隆到pBIN19Kpnl-BamHI位点中获得图11中代表的pTOM130质粒。
用含pTOM130质粒的根癌土壤杆菌pGV2260 C58株转化本萨明那烟草，如(Noris等1996)所述，再生了抗卡那霉素的植物。
通过PCR分析了初步转化体中转基因的存在，通过Western印迹分析了初步转化体中Rep-130蛋白的表达，如图12所示。
如(Noris等，1996)所述，用抗-TYLCSV Rep的兔多克隆第一抗体进行Western印迹，分析获自转基因(300-309)或野生型对照(wt)植物的蛋白抽提物。
实施例6用pTOM130构建物稳定转化并表达Rep-130的植物细胞抑制TYLCSV复制。
为了早期评价Rep-130产生的抗性，用TYLCSV感染性克隆(pTOM6)转染原生质体，该原生质体是从表达几个主要转基因Rep-130的本萨明那烟草植物中分离的。
选择高表达Rep-130的转基因品系，如Western印迹分析所揭示(图12)。
将TYLCSV在这些转基因原生质体中的复制水平与在野生型和表达Rep-210的转基因原生质体(品系102.22)中观察到的复制水平相比。
具体说，图13显示了在野生型(wt)和表达Rep-130(SEQ ID No 9)(品系300，301，303)或Rep-210(品系102.22)转基因本萨明那烟草原生质体中的TYLCSV复制分析。用洋地黄毒苷-标记的RNA探针进行Southern印迹，分析来自几个原生质体样品的总核酸抽提物，该探针对应于Rep-210转录物。
为了将TYLCSV在Rep-130转基因原生质体中的复制水平与野生型原生质体中观察到的复制水平相比较，也将从野生型原生质体中抽提的总核酸以1∶10和1∶50稀释后上样，如图13所示。
实施例7生产表达Rep-130番茄转基因植物通过在原生质体中的瞬时表达评价的Rep突变体抑制TYLCSV复制的能力分析揭示出如前述实施例所述的最短突变体仍有效编码Rep-130。
如前所示，与编码Rep-210的序列相比，编码Rep-130的C1基因近端5’部分是转录后基因沉默的无效靶。
从而进行表达Rep-130的转基因番茄植物(Lycopersicon esculentum经济效益良好的栽培品种)的生产。
如(Brunetti等1997)所述，用含pTOM130质粒的根癌土壤杆菌pGV2260 C58株转化该番茄，再生了抗卡那霉素的植物。
通过PCR分析了初步转化体中转基因的存在，通过Western印迹分析了初步转化体中Rep-130蛋白的表达(图14)。
如(Noris等，1996)所述，用抗-TYLCSV Rep的兔多克隆第一抗体进行Western印迹，分析获自转基因(品系400)或野生型对照(wt)植物的蛋白抽提物。
从表型上不可能从野生型植物中分辨出任何表达Rep-130蛋白的转基因番茄植物(图15)。
实施例8在表达Rep-130的pTOM130构建物转基因植物中证明抗TYLCSV的长时间持续抗性为了评价Rep-130表达产生的抗TYLCSV持续抗性，用含TYLCSV感染性克隆的根癌土壤杆菌LBA4404株土壤接种表达Rep-130的本萨明那烟草R1转基因植物。
如以前所报道的，用于测定抗性和评价随时间稳定性的通过土壤接种的病毒递送，对应于高或很高的病毒压力条件。
以周为间隔，通过使用特异性针对外被蛋白基因的洋地黄毒苷标记探针的“组织印迹”测定来评价植物感染。
表7中的结果显示，不像表2中所述关于表达Rep-210的转基因植物的结果，当用TYLCSV土壤接种时，表达Rep-130蛋白的转基因本萨明那烟草植物显示出长时间持续抗性。这可通过在接种后2和6周时对抗性植物的比较推知。
表7

此外，在转基因R2番茄植物中评价了Rep-130表达产生的抗TYLCSV抗性的稳定性。
用含TYLCSV感染性克隆的根癌土壤杆菌C58C1+pCH32株土壤接种该植物。用于测定抗性和评价其随时间稳定性的接种条件对应于高或很高的病毒压力条件。
以一星期或两星期的间隔，通过使用特异性针对外被蛋白基因的放射性标记探针的斑点印迹测定评价感染。
表8中的结果指出，当用TYLCSV感染性克隆土壤接种时，表达Rep-130的番茄转基因植物显示出长时间持续抗性。这可通过在接种后3和12周时对抗性植物的比较推知。
表8

因此，抗性与Rep-130蛋白(SEQ ID No 9)的存在和接种TYLCSV的转基因植物稳定表达Rep-130的能力相关，因为编码它的序列是病毒诱导的转录后基因沉默的无效靶，而Rep即使进一步突变，也能保持其产生病毒抗性的能力。
实施例9构建编码TYLCSV Rep-210蛋白的合成多核苷酸序列，该序列经过修饰使其不成为感染性病毒诱导的转录后基因沉默的靶或成为其极无效的靶。
为了在转基因植物中获得TYLCSV Rep-210蛋白的长时间持续表达，用本发明方法生产了能够编码Rep-210蛋白的合成多核苷酸序列，它不是感染性病毒诱导的转录后基因沉默的靶或使其无效靶。
此外，应该按照下列标准-如在Rep-130(SEQ ID No 8；SEQ ID No 9)中所述，合成多核苷酸序列不能编码C4蛋白，在231和233位置上具有相同突变，如图8所示。
-引入的突变都是沉默的，即合成多核苷酸序列编码的蛋白产物与病毒野生型序列编码的蛋白产物相匹配；-根据番茄基因中密码子的使用频率引入突变；具体是，只要有可能就选择番茄中更频繁使用的密码子；-检查所有引入的突变，以排除具有具体功能，如聚腺苷酸化或剪切信号以及隐藏功能的序列形成的可能。
按照上述标准，设计了两个编码Rep-210的合成序列(图16 A和B，SEQ ID No2、SEQ ID No 3、SEQ ID No 4、SEQ ID No 5)。
将5’的非翻译先导序列和3’的终止密码子加入到合成Rep-210沉默消减B基因(SEQ ID No 4)的序列中。
具体说，用具有“校读”校正活性的热稳定性DNA聚合酶(Pfu DNA聚合酶，Stratagene和/或Pfx DNA聚合酶，Invitrogen)从寡核苷酸开始PCR(Prodromou和Laurence，1992；Stemmer等，1995)，以组装在5’-3’顺序上含有非翻译先导序列、编码Rep-210的合成序列(图16B；SEQ ID No 4，SEQ ID No 5)和终止密码子的多核苷酸序列。
然后在花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子和CaMV 35S的转录终止序列的转录控制下，将合成基因克隆到pJIT60质粒中，产生pJT60Syn。然后，用KpnI-BgIII限制性酶切从pJT60Syn质粒上去除在5’-3’顺序上含有35S启动子、Rep-210合成基因、35S终止子的盒子，然后克隆到双元质粒pBIN19的KpnI-BamHI位点中，产生pTOM102Syn。
实施例10对Rep-210合成基因抑制病毒复制的评价。
通过将转化有pTOM102Syn的根癌土壤杆菌C58C1/pCH32土壤渗入本萨明那烟草叶检测合成基因编码的Rep-210蛋白的正确表达。将pTOM102(C4-)转化的C58C1/pCH32株用作阳性对照，而将双元质粒pBIN19转化的C58C1/pCH32株用作阴性对照。Western印迹分析(图17)显示了合成基因编码的Rep-210蛋白的表达。
为了评价pTOM102Syn编码的Rep-210蛋白抑制TYLCSV复制的能力，进行瞬时土壤共渗入测定。将含有TYLCSV感染性克隆(pTOM6)的根癌土壤杆菌C58C1/pCH32株与含有a)pTOM102Syn质粒；b)pTOM102(C4-)质粒；c)pBIN19双元质粒的根癌土壤杆菌C58C1/pCH32株土壤共渗入本萨明那烟草叶。通过对渗入后72小时土壤共渗入组织中抽提的总核酸的Southern分析来评价TYLCSV复制。该分析指出，合成基因(pTOM102Syn)和pTOM102(C4-)野生型基因表达的Rep-210蛋白以类似方式抑制TYLCSV复制(图18)。
实施例11表达Rep-210合成基因的转基因本萨明那烟草植物的生产为了获得表达Rep-210合成基因的转基因本萨明那烟草植物，如(Noris等1996)所述地用含有pTOM 102Syn质粒的根癌土壤杆菌LBA 4404株转化本萨明那烟草叶盘，再生卡那霉素抗性植物。
通过Western印迹分析了主要转化体中Rep-210蛋白的表达。选择累积了中等水平Rep-210的四个主要转化体506、508、517和537品系用于进一步研究。图19显示从506、508A和508B植物中抽提的蛋白的Western分析。
实施例12Rep-210合成基因在本萨明那烟草转基因植物中抗性的稳定性。
作者以前已经证明(Noris等1996；Brunetti等1997)，转基因植物生产的Rep-210蛋白量和抗TYLCSV抗性之间有直接联系。用pTOM102构建物转化的累积中等水平Rep-210蛋白的转基因植物易受病毒感染的影响，就像未转化植物一样(Noris等1996和未发表数据)。这些植物中低水平的Rep-210蛋白不足以完全抑制病毒复制，因此允许产生早期病毒-诱导的转录后沉默，导致Rep-210蛋白累积的显著降低，这造成抗性损失。
为了评价合成基因编码的Rep-210蛋白是否不是病毒诱导的转录后基因沉默的靶或是其无效靶，从而随时间控制病毒感染，将TYLCSV土壤接种到表达类似量Rep-210的品系102.22转基因植物(R3)和品系506转基因植物(RO)(图20，0wpi)中，以周为间隔通过斑点印迹分析其TYLCSV的累积情况。正如所料(Noris等，1996)，累积中等水平Rep-210的转基因R3品系102.22植物(图21，5-8)与未转化植物一样易感(图21，1-4)。如斑点印迹分析(图21，9-12)所示，转基因了合成构建物的植物(RO品系506)对病毒感染具有抗性，仅累积有限量的病毒。引人兴趣的是，由于病毒不能有效地转录后沉默合成基因，Rep-210在接种后5周仍在累积(图20，5wpi)，并随时间抑制TYLCSV复制(图21，9-12)。
这些实施例中描述的结果指出，可能通过在植物中表达由病原体衍生多核苷酸序列构成的转基因，而获得长时间持续抗双粒病毒组的抗性，只要多核苷酸是合适选择的或修饰以使它不成为感染性病毒转录后基因沉默的靶或成为其无效靶。
实施例13修饰使它不成为感染性病毒诱导的转录后降解的靶或成为其极无效靶的合成多核苷酸序列的构建，该序列编码TYLCSV壳体蛋白。
如上所述，在番茄种间杂合体(Lycopersicon esculentum X L.pennellil)中TYLCV壳体蛋白的转基因表达产生抗病毒感染的部分抗性(Kunik等，1994)。在这种情况下，壳体蛋白表达介导的抗性也不是长时间持续的。
为了达到转基因植物稳定表达TYLCSV壳体蛋白(CP)，生产了能够编码CP的合成多核苷酸序列，它产生病毒诱导的转录后基因沉默的无效靶。
用本发明方法设计合成多核苷酸序列，使其满足不成为病毒诱导的转录后基因沉默的靶或成为其极无效靶的要求。
此外，遵循了下述标准-引入突变全部是沉默的，即合成多核苷酸序列编码的蛋白产物与病毒野生型序列编码的蛋白产物准确匹配；-引入突变考虑番茄基因中密码子的使用频率；具体说，只要有可能就选择番茄中更频繁使用的密码子；-检查了所有引入突变，以排除具有具体功能，如聚腺苷酸化信号或剪切信号以及隐藏功能的的序列形成的可能。
按照上述标准，设计了编码CP的合成序列(SEQ ID No 12)(图22，TYLCSV CP沉默消减，SEQ ID No 6、SEQ ID No7)。
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序列表<110>ENEA-意大利国家新技术能源及环境局(ENEA-Ente per le Nuove Tecnologie e l’AmbienteConsiglio Nazionale delle Ricerche)<120>制备特征为双粒病毒组持续抗性的转基因植物的方法<130>PCT25622<140>RM2003A000242<141>2003-05-19<150>RM2003A000242<151>2003-05-19<160>12<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>630<212>DNA<213>双粒病毒组TYLCSV<400>1atgccaagat caggtcgttt tagtatcaag gctaaaaatt atttccttac atatcccaaa 60tgtgatttaa caaaagaaaa tgcactttcc caaataacaa acctacaaac acccacaaac120aaattattca tcaaaatttg cagagaacta catgaaaatg gggaacctca tctccatatt180ctcatccaat tcgaaggaaa atacaattgt accaatcaac gattcttcga cctggtatcc240ccaaccaggt cagcacattt ccatccgaac attcagggag ctaaatcgag ctccgacgtc300aagtcctata tcgacaagga cggagatgtt cttgaatggg gtactttcca gatcgacgga360cgatctgcta ggggaggaca acagacagcc aacgacgctt acgcaaaggc aattaacgca420ggaagtaagt cgcaggctct tgatgtaatt aaagaattag cgcctagaga ttacgttcta480cattttcata atataaatag taatttagat aaggttttcc aggtgcctcc ggcaccttat540gtttctcctt ttttatcttc ttctttcgat caagttcctg atgaacttga acactgggtt600tccgagaacg tcatggatgc cgctgcgcgg 630<210>2<211>630<212>DNA<213>人工<220>
<223>TYLCSV Rep-210修饰序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(630)<400>2atg cct aga tcc gga agg ttt agc atc aaa gct aag aat tac ttc ttg 48Met Pro Arg Ser Gly Arg Phe Ser Ile Lys Ala Lys Asn Tyr Phe Leu1 5 10 15aca tac ccc aag tgt gac tta act aag gag aat gca ttg tcc cag ata 96Thr Tyr Pro Lys Cys Asp Leu Thr Lys Glu Asn Ala Leu Ser Gln Ile20 25 30act aac ttg caa act ccc act aac aag ttg ttc att aag att tgt agg 144Thr Asn Leu Gln Thr Pro Thr Asn Lys Leu Phe Ile Lys Ile Cys Arg35 40 45gaa ctt cat gag aat gga gaa cca cat ctt cat atc ttg ata cag ttc 192Glu Leu His Glu Asn Gly Glu Pro His Leu His Ile Leu Ile Gln Phe50 55 60gaa ggc aag tat aac tgc acc aac caa cgt ttc ttt gac ctt gtg tcc 240Glu Gly Lys Tyr Asn Cys Thr Asn Gln Arg Phe Phe Asp Leu Val Ser65 70 75 80cct acc aga rca gcc cat ttt cat cca aac atc cag ggt gct aag tcg 288Pro Thr Arg Ser Ala His Phe His Pro Asn Ile Gln Gly Ala Lys Ser85 90 95agt tca gac gtg aag tca tac att gac aaa gac ggc gat gtg ctc gag 336Ser Ser Asp Val Lys Ser Tyr Ile Asp Lys Asp Gly Asp Val Leu Glu100 105 110tgg gga act ttt cag ata gac ggt cga tcg gct aga gga ggt cag caa 384Trp Gly Thr Phe Gln Ile Asp Gly Arg Ser Ala Arg Gly Gly Gln Gln115 120 125aca gct aac gat gca tac gct aag gct atc aac gct gga tcc aag tca 432Thr Ala Asn Asp Ala Tyr Ala Lys Ala Ile Asn Ala Gly Ser Lys Ser130 135 140cag gca ctt gac gta atc aaa gag tta gct cct agg gat tat gtt ctt 480Gln Ala Leu Asp Val Ile Lys Glu Leu Ala Pro Arg Asp Tyr Val Leu145 150 155 160cat ttc cat aac atc aac agc aat ttg gac aaa gtg ttc caa gtg cca 528His Phe His Asn Ile Asn Ser Asn Leu Asp Lys Val Phe Gln Val Pro165 170 175ccg gct cct tac gtt tca cct ttc tta agt tct tca ttt gat cag gtt 576Pro Ala Pro Tyr Val Ser Pro Phe Leu Ser Ser Ser Phe Asp Gln Val180 185 190cca gat gag ctt gag cat tgg gtg tcc gaa aac gtt atg gac gcc gca 624
Pro Asp Glu Leu Glu His Trp Val Ser Glu Asn Val Met Asp Ala Ala195 200 205gcg cgt 630Ala Arg210<210>3<211>210<212>PRT<213>人工<220>
<223>合成构建物<400>3Met Pro Arg Ser Gly Arg Phe Ser Ile Lys Ala Lys Asn Tyr Phe Leu1 5 10 15Thr Tyr Pro Lys Cys Asp Leu Thr Lys Glu Asn Ala Leu Ser Gln Ile20 25 30Thr Asn Leu Gln Thr Pro Thr Asn Lys Leu Phe Ile Lys Ile Cys Arg35 40 45Glu Leu His Glu Asn Gly Glu Pro His Leu His Ile Leu Ile Gln Phe50 55 60Glu Gly Lys Tyr Asn Cys Thr Asn Gln Arg Phe Phe Asp Leu Val Ser65 70 75 80Pro Thr Arg Ser Ala His Phe His Pro Asn Ile Gln Gly Ala Lys Ser85 90 95Ser Ser Asp Val Lys Ser Tyr Ile Asp Lys Asp Gly Asp Val Leu Glu100 105 110Trp Gly Thr Phe Gln Ile Asp Gly Arg Ser Ala Arg Gly Gly Gln Gln115 120 125Thr Ala Asn Asp Ala Tyr Ala Lys Ala Ile Asn Ala Gly Ser Lys Ser130 135 140Gln Ala Leu Asp Val Ile Lys Glu Leu Ala Pro Arg Asp Tyr Val Leu145 150 155 160His Phe His Asn Ile Asn Ser Asn Leu Asp Lys Val Phe Gln Val Pro165 170 175Pro Ala Pro Tyr Val Ser Pro Phe Leu Ser Ser Ser Phe Asp Gln Val180 185 190Pro Asp Glu Leu Glu His Trp Val Ser Glu Asn Val Met Asp Ala Ala195 200 205Ala Arg210
<210>4<211>630<212>DNA<213>人工<220>
<223>TYLCSV Rep-210修饰序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(630)<400>4atg cct aga tcc gga agg ttt agc atc aaa gct aag aat tac ttc ttg 48Met Pro Arg Ser Gly Arg Phe Ser Ile Lys Ala Lys Asn Tyr Phe Leu1 5 10 15aca tac ccc aag tgt gac tta act aag gag aat gca ttg tcc cag ata 96Thr Tyr Pro Lys Cys Asp Leu Thr Lys Glu Asn Ala Leu Ser Gln Ile20 25 30act aac ttg caa act ccc act aac aag ttg ttc att aag att tgt agg 144Thr Asn Leu Gln Thr Pro Thr Asn Lys Leu Phe Ile Lys Ile Cys Arg35 40 45gaa ctt cac gag aat gga gaa cca cat ctt cat atc ttg ata cag ttc 192Glu Leu His Glu Asn Gly Glu Pro His Leu His Ile Leu Ile Gln Phe50 55 60gaa ggc aag tat aac tgc acc aac caa cgt ttc ttt gac ctt gtg tcc 240Giu Gly Lys Tyr Asn Cys Thr Asn Gln Arg Phe Phe Asp Leu Val Ser65 70 75 80cct acc aga tca gcc cat ttt cat cca aac atc cag ggt gct aag tcg 288Pro Thr Arg Ser Ala His Phe His Pro Asn Ile Gln Gly Ala Lys Ser85 90 95agt tca gac gtg aag tca tac att gac aaa gac ggg gat gtg ctc gag 336Ser Ser Asp Val Lys Ser Tyr Ile Asp Lys Asp Gly Asp Val Leu Glu100 105 110tgg gga act ttt cag ata gac ggt cga tcg gct aga gga ggt cag caa 384Trp Gly Thr Phe Gln Ile Asp Gly Arg Ser Ala Arg Gly Gly Gln Gln115 120 125aca gca aac gat gca tac gct aag gct atc aac gct gga tcc aag tca 432Thr Ala Asn Asp Ala Tyr Ala Lys Ala Ile Asn Ala Gly Ser Lys Ser130 135 140cag gca ctt gac gta atc aaa gag tta gct cct agg gat tat gtt ctt 480Gln Ala Leu Asp Val Ile Lys Glu Leu Ala Pro Arg Asp Tyr Val Leu145 150 155 160
cat ttc cat aac atc aac agc aat ttg gac aaa gtg ttc caa gtg cca 528His Phe His Asn Ile Asn Ser Asn Leu Asp Lys Val Phe Gln Val Pro165 170 175ccg gct cct tac gtt tca cct ttc tta agt tct tca ttt gat cag gtt 576Pro Ala Pro Tyr Val Ser Pro Phe Leu Ser Ser Ser Phe Asp Gln Val180 185 190cca gat gag ctt gag cat tgg gtg tct gaa aac gtt atg gac gcc gca 624Pro Asp Glu Leu Glu His Trp Val Ser Glu Asn Val Met Asp Ala Ala195 200 205gcc cgt 630Ala Arg210<210>5<211>210<212>PRT<213>人工<220>
<223>合成构建物<400>5Met Pro Arg Ser Gly Arg Phe Ser Ile Lys Ala Lys Asn Tyr Phe Leu1 5 10 15Thr Tyr Pro Lys Cys Asp Leu Thr Lys Glu Asn Ala Leu Set Gln Ile20 25 30Thr Asn Leu Gln Thr Pro Thr Asn Lys Leu Phe Ile Lys Ile Cys Arg35 40 45Glu Leu His Glu Asn Gly Glu Pro His Leu His Ile Leu Ile Gln Phe50 55 60Glu Gly Lys Tyr Asn Cys Thr Asn Gln Arg Phe Phe Asp Leu Val Ser65 70 75 80Pro Thr Arg Ser Ala His Phe His Pro Asn Ile Gln Gly Ala Lys Ser85 90 95Ser Ser Asp Val Lys Ser Tyr Ile Asp Lys Asp Gly Asp Val Leu Glu100 105 110Trp Gly Thr Phe Gln Ile Asp Gly Arg Ser Ala Arg Gly Gly Gln Gln115 120 125Thr Ala Asn Asp Ala Tyr Ala Lys Ala Ile Asn Ala Gly Ser Lys Ser130 135 140Gln Ala Leu Asp Val Ile Lys Glu Leu Ala Pro Arg Asp Tyr Val Leu145 150 155 160His Phe His Asn Ile Asn Ser Asn Leu Asp Lys Val Phe Gln Val Pro165 170 175
Pro Ala Pro Tyr Val Ser Pro Phe Leu Ser Ser Ser Phe Asp Gln Val180 185 190Pro Asp Glu Leu Glu His Trp Val Ser Glu Asn Val Met Asp Ala Ala195 200 205Ala Arg210<210>6<211>774<212>DNA<213>人工<220>
<223>TYLCSV外被蛋白修饰序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(774)<400>6atg cca aag aga act ggt gat att cta atc tca act ccc gtg tct aag 48Met Pro Lys Arg Thr Gly Asp Ile Leu Ile Ser Thr Pro Val Ser Lys1 5 10 15gtg cgt agg aga ctt aac ttt gac tct ccg tac acc tct cgt gca gct 96Val Arg Arg Arg Leu Asn Phe Asp Ser Pro Tyr Thr Ser Arg Ala Ala20 25 30gct ccc aca gtc cag ggc att aag agg cga tct tgg aca tac aga cct 144Ala Pro Thr Val Gln Gly Ile Lys Arg Arg Ser Trp Thr Tyr Arg Pro35 40 45atg tac agg aaa ccg agg atg tat agg atg tat cgt agc cca gat gtg 192Met Tyr Arg Lys Pro Arg Met Tyr Arg Met Tyr Arg Ser Pro Asp Val50 55 60cct cct ggt tgc gaa gga ccc tgc aag gtg caa tcg tat gag caa cgt 240Pro Pro Gly Cys Glu Gly Pro Cys Lys Val Gln Ser Tyr Glu Gln Arg65 70 75 80gac gat gtg aag cac acc gga gtt gtt cgt tgc gtt tct gat gtg act 288Asp Asp Val Lys His Thr Gly Val Val Arg Cys Val Ser Asp Val Thr85 90 95aga ggt tca ggt atc act cac agg gtg gga aag cgt ttc tgt att aag 336Arg Gly Ser Gly Ile Thr His Arg Val Gly Lys Arg Phe Cys Ile Lys100 105 110tct att tac ata ttg ggt aag atc tgg atg gac gag aat atc aag aaa 384Ser Ile Tyr Ile Leu Gly Lys Ile Trp Met Asp Glu Asn Ile Lys Lys115 120 125
cag aat cac act aat cag gtt atg ttc ttt crt gtg cga gat cga aga 432Gln Asn His Thr Asn Gln Val Met Phe Phe Leu Val Arg Asp Arg Arg130 135 140cca tac gga acc agc cca atg gac ttc ggc cag gtg ttt aat atg ttc 480Pro Tyr Gly Thr Ser Pro Met Asp Phe Gly Gln Val Phe Asn Met Phe145 150 155 160gat aac gag cca tct act gca act gtg aaa aat gat ttg cgt gat aga 528Asp Asn Glu Pro Ser Thr Ala Thr Val Lys Asn Asp Leu Arg Asp Arg165 170 175tat cag gtg atg aga aag ttc cat gca acg gtg gtt ggt ggt cct tct 576Tyr Gln Val Met Arg Lys Phe His Ala Thr Val Val Gly Gly Pro Ser180 185 190gga atg aaa gag caa tgt ctt ctg aaa aga ttc ttt aag atc aac act 624Gly Met Lys Glu Gln Cys Leu Leu Lys Arg Phe Phe Lys Ile Asn Thr195 200 205cat gtc gtc tat aac cac cag gag caa gcg aaa tat gag aat cac act 672His Val Val Tyr Asn His Gln Glu Gln Ala Lys Tyr Glu Asn His Thr210 215 220gaa aat gct ttg ttg tta tac atg gcc tgt acc cac gca tct aat cca 720Glu Asn Ala Leu Leu Leu Tyr Met Ala Cys Thr His Ala Ser Asn Pro225 230 235 240gtt tac gca acg ctt aag atc cgt atc tat ttc tat gac gct gtg aca 768Val Tyr Ala Thr Leu Lys Ile Arg Ile Tyr Phe Tyr Asp Ala Val Thr245 250 255aac tag 774Asn<210>7<211>257<212>PRT<213>人工<220>
<223>合成构建物<400>7Met Pro Lys Arg Thr Gly Asp Ile Leu Ile Ser Thr Pro Val Ser Lys1 5 10 15Val Arg Arg Arg Leu Asn Phe Asp Ser Pro Tyr Thr Ser Arg Ala Ala20 25 30Ala Pro Thr Val Gln Gly Ile Lys Arg Arg Ser Trp Thr Tyr Arg Pro35 40 45Met Tyr Arg Lys Pro Arg Met Tyr Arg Met Tyr Arg Ser Pro Asp Val50 55 60
Pro Pro Gly Cys Glu Gly Pro Cys Lys Val Gln Ser Tyr Glu Gln Arg65 70 75 80Asp Asp Val Lys His Thr Gly Val Val Arg Cys Val Ser Asp Val Thr85 90 95Arg Gly Ser Gly Ile Thr His Arg Val Gly Lys Arg Phe Cys Ile Lys100 105 110Ser Ile Tyr Ile Leu Gly Lys Ile Trp Met Asp Glu Asn Ile Lys Lys115 120 125Gln Asn His Thr Asn Gln Val Met Phe Phe Leu Val Arg Asp Arg Arg130 135 140Pro Tyr Gly Thr Ser Pro Met Asp Phe Gly Gln Val Phe Asn Met Phe145 150 155 160Asp Asn Glu Pro Ser Thr Ala Thr Val Lys Asn Asp Leu Arg Asp Arg165 170 175Tyr Gln Val Met Arg Lys Phe His Ala Thr Val Val Gly Gly Pro Ser180 185 190Gly Met Lys Glu Gln Cys Leu Leu Lys Arg Phe Phe Lys Ile Asn Thr195 200 205His Val Val Tyr Asn His Gln Glu Gln Ala Lys Tyr Glu Asn His Thr210 215 220Glu Asn Ala Leu Leu Leu Tyr Met Ala Cys Thr His Ala Ser Asn Pro225 230 235 240Val Tyr Ala Thr Leu Lys Ile Arg Ile Tyr Phe Tyr Asp Ala Val Thr245 250 255Asn<210>8<211>447<212>DNA<213>人工<220>
<223>TYLCSV Rep 130序列<220>
<221>CDS<222>(51)..(443)<220>
<221>misc_feature<222>(231)..(231)<223>从C(Rep-210野生型)到T的点突变<220>
<221>misc_feature<222>(233)..(233)<223>从C(Rep-210野生型)到G的点突变<400>8ggatccccct ggatactttg agtgtccccc gattcagaac gacagcaaaa atg cca56Met Pro1aga tca ggt cgt ttt agt atc aag gct aaa aat tat ttc ctt aca tat 104Arg Ser Gly Arg Phe Ser Ile Lys Ala Lys Asn Tyr Phe Leu Thr Tyr5 10 15ccc aaa tgt gat tta aca aaa gaa aat gca ctt tcc caa ata aca aac 152Pro Lys Cys Asp Leu Thr Lys Glu Asn Ala Leu Ser Gln Ile Thr Asn20 25 30cta caa aca ccc aca aac aaa tta ttc atc aaa att tgc aga gaa cta 200Leu Gln Thr Pro Thr Asn Lys Leu Phe Ile Lys Ile Cys Arg Glu Leu35 40 45 50cat gaa aat ggg gaa cct cat ctc cat att ttg atc caa ttc gaa gga 248His Glu Asn Gly Glu Pro His Leu His Ile Leu Ile Gln Phe Glu Gly55 60 65aaa tac aat tgt acc aat caa cga ttc ttc gac ctg gta tcc cca acc 296Lys Tyr Asn Cys Thr Asn Gln Arg Phe Phe Asp Leu Val Ser Pro Thr70 75 80agg tca gca cat ttc cat ccg aac att cag gga gct aaa tcg agc tcc 344Arg Ser Ala His Phe His Pro Asn Ile Gln Gly Ala Lys Ser Ser Ser85 90 95gac gtc aag tcc tat atc gac aag gac gga gat gtt ctt gaa tgg ggt 392Asp Val Lys Ser Tyr Ile Asp Lys Asp Gly Asp Val Leu Glu Trp Gly100 105 110act ttc cag atc gac gga cga tct gct agg gga gga caa cag aca gcc 440Thr Phe Gln Ile Asp Gly Arg Ser Ala Arg Gly Gly Gln Gln Thr Ala115 120 125 130tga attc 447<210>9<211>130<212>PRT<213>人工<220>
<223>合成构建物<400>9Met Pro Arg Ser Gly Arg Phe Ser Ile Lys Ala Lys Asn Tyr Phe Leu
1 5 10 15Thr Tyr Pro Lys Cys Asp Leu Thr Lys Glu Asn Ala Leu Ser Gln Ile20 25 30Thr Asn Leu Gln Thr Pro Thr Asn Lys Leu Phe Ile Lys Ile Cys Arg35 40 45Glu Leu His Glu Asn Gly Glu Pro His Leu His Ile Leu Ile Gln Phe50 55 60Glu Gly Lys Tyr Asn Cys Thr Asn Gln Arg Phe Phe Asp Leu Val Ser65 70 75 80Pro Thr Arg Ser Ala His Phe His Pro Asn Ile Gln Gly Ala Lys Ser85 90 95Ser Ser Asp Val Lys Ser Tyr Ile Asp Lys Asp Gly Asp Val Leu Glu100 105 110Trp Gly Thr Phe Gln Ile Asp Gly Arg Ser Ala Arg Gly Gly Gln Gln115 120 125Thr Ala130<210>10<211>30<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(30)<223>PCR C4诱变的引物<400>10ctcatctcca tattttgatc caattcgaag 30<210>11<211>30<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(30)<223>PCR C4诱变的引物<400>11cttcgaattg gatcaaaata tggagatgag 30<210>12<211>774<212>DNA<213>双粒病毒组TYLCSV<400>12atgccgaagc gaaccggcga tatactaatt tcaacgcccg tctcgaaggt tcgtcgaaga 60ctgaacttcg acagcccgta taccagccgt gctgctgccc ccactgtcca aggcatcaag120cgtcgatcat ggacttacag gcccatgtat cgaaagccgc ggatgtacag aatgtacaga180agccctgatg tacctccggg ttgtgaaggt ccctgtaaag tgcagtcgta cgagcagcgt240gatgacgtca agcataccgg tgttgtgcgt tgtgttagtg atgtaactag gggttctggt300attactcata gagttggtaa acgtttttgt atcaagtcaa tttatatatt aggaaagatt360tggatggatg aaaacataaa aaaacaaaat catactaacc aagtgatgtt tttccttgtt420cgagaccgaa ggccttatgg aactagtcct atggattttg gtcaagtttt taacatgttt480gataatgaac ccagtactgc tacggtgaag aacgacttac gggataggta tcaagtaatg540aggaagtttc atgctacggt tgttggaggt ccgtcaggga tgaaggagca gtgtttgctg600aagagatttt ttaaaattaa tacccatgta gtttataatc accaagagca ggcgaagtat660gaaaatcata ctgagaatgc cttgttattg tatatggctt gtactcatgc ttctaaccca720gtgtacgcta cgttgaaaat acgtatttat ttttatgatg ctgtaacaaa ttaa 77权利要求
1.一种编码双粒病毒组衍生氨基酸序列的多核苷酸序列，其特征在于，所述多核苷酸序列不是病毒转录后沉默的靶或是其无效靶，并具有a)与相应需要对其有抗性的双粒病毒组基因序列的核苷酸水平同源性低于或等于90％；b)在转录的RNA中与相应双粒病毒组基因序列的连续同源性低于或等于17个核苷酸；c)包含相应双粒病毒组基因序列单取代的序列的最大长度不多于30个核苷酸；所述多核苷酸序列一旦转化后能够使植物、组织或植物细胞获得抗双粒病毒组的持续抗性。
2.如权利要求1所述的序列，其特征在于，所述与相应双粒病毒组基因序列的核苷酸水平同源性低于或等于80％。
3.如权利要求1所述的序列，其特征在于，所述与相应双粒病毒组基因序列的核苷酸水平同源性低于或等于70％。
4.如前述各权利要求所述的序列，其特征在于，所述在转录的RNA中与双粒病毒组基因序列的连续同源性低于或等于8个核苷酸。
5.如前述各权利要求所述的序列，其特征在于，所述在转录的RNA中与双粒病毒组基因序列的连续同源性低于或等于5个核苷酸。
6.如前述各权利要求所述的序列，其特征在于，所述包含相应双粒病毒组基因序列单取代的序列的最大长度不多于20个核苷酸。
7.如前述各权利要求所述的序列，其特征在于，所述包含相应双粒病毒组基因序列单取代的序列的最大长度不多于9个核苷酸。
8.如前述各权利要求所述的序列，其特征在于，所述多核苷酸序列已被突变或者它是选自双粒病毒组的野生型序列，以使其在核苷酸水平与前述各权利要求所述的相应需要对其有抗性的双粒病毒组基因组序列不同。
9.如前述各权利要求所述的序列，其特征在于，所述双粒病毒组选自玉米线条病毒属、甜菜曲顶病毒属、菜豆金黄花叶病毒属和Topocuvirus的种及其分离物。
10.如权利要求9所述的序列，其特征在于，所述菜豆金黄花叶病毒属的种选自TYLCCNV、TYLCGV、TYLCMaIV、TYLCSV、TYLCTHV、TYLCV、ACMV、BGMV、CaLCuV、ToCMoV、TGMV、ToGMoV、ToMHV、ToMoTV、ToMoV、ToRMV、ToSLCV、ToSRV、棉花缩叶病(CLCrV、CLCuAV、CICuGV、CLCuKV、CLCuMV、CLCuRV)、东非木薯花叶病(EACMCV、EACMMV、EACMV、EACMZV)、马铃薯黄色花叶病(PYMPV、PYMTV、PYMV)、南瓜缩叶病(SLCCNV、SLCV、SLCYV)、甘薯缩叶病(SPLCGV、SPLCV)、烟草缩叶病(TbLCJV、TbLCKoV、TbLCYNV、TbLCZV)、番茄缩叶病(ToLCBV、ToLCBDV、ToLCGV、ToLCKV、ToLCLV、ToLCMV、ToLCNDV、ToLCSLV、ToLCTWV、ToLCVV、ToLCV)及其分离物。
11.如权利要求9所述的序列，其特征在于，所述属于玉米线条病毒属、甜菜曲顶病毒属、Topocuvirus的种选自WDV、MSV、SSV、BYDV、TYDV、BCTV及其分离物。
12.如权利要求1所述的序列，其特征在于，所述属于双粒病毒组的基因序列选自C1/AL1/AC1、C2/AL2/AC2、C3/AL3/AC3、C4/AL4/AC4、V1/AR1/AV1、V2/AR2/AV2、BC1/BL1和BV1/BR1。
13.如权利要求12所述的序列，其特征在于，所述C1/AL1/AC1基因序列来自双粒病毒组，如权利要求10和11的限定。
14.如权利要求1所述的序列，其特征在于，所述双粒病毒组氨基酸序列是能够将抗双粒病毒组抗性赋予表达该蛋白的植物的病原体衍生蛋白。
15.如权利要求14所述的序列，其特征在于，所述蛋白选自壳体蛋白，复制相关病毒蛋白(Rep)、基因C2/AL2/AC2、C3/AL3/AC3、C4/AL4/AC4、V2/AR2/AV2、BC1/BL1和BV1/BR1编码的蛋白。
16.如权利要求1所述的序列，其特征在于，所述植物、其组织或细胞属于番茄、胡椒、烟草、南瓜、树薯、甘薯、棉花、瓜、马铃薯、大豆、葡萄酒(wine)、玉米、小麦、甘蔗、蚕豆、甜菜。
17.一种编码双粒病毒组衍生的氨基酸序列的多核苷酸序列，其特征在于，所述多核苷酸序列不是病毒转录后沉默的靶或是其无效靶，与需要对其有抗性的双粒病毒组序列的同源性甚至等于100％，合适地缩短使其在siRNA群体中与原始序列相比不被充分代表。
18.一种在5’-3’方向上包含异源性多核苷酸序列的构建物，该构建物包含a)在所述植物或组织或转化的细胞中用作启动子的多核苷酸序列；b)位于编码区5’端的非翻译多核苷酸序列；c)权利要求1-17中所述的多核苷酸序列、它的片段或变体；d)用作转录终止子的序列，位于所述多核苷酸序列的3’端。
19.一种包含权利要求18所定义的构建物的表达载体。
20.一种转基因植物、组织或其植物细胞，在它们的基因组中包含权利要求1-17所定义的多核苷酸序列。
21.权利要求20所述的植物和植物组织的后代。
22.一种种子，它的基因组中包含权利要求1-17所定义的多核苷酸序列。
23.一种制备具有长时间持续抗双粒病毒组抗性的转基因植物、植物组织或其细胞的方法，该方法包括下述步骤a)鉴定或选择编码能够产生抗双粒病毒组抗性的氨基酸序列的病毒基因序列；b)诱变或选择病毒基因序列，使其成为感染双粒病毒组诱导的转录后沉默的无效靶；c)在植物、植物组织或其细胞中用权利要求18所定义的构建物插入步骤b)中突变或选择的双粒病毒组基因序列。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，通过诱变使与需要对其有抗性的双粒病毒组基因序列的核苷酸水平同源性维持在低于或等于90％的水平，同源性以下述方式分布转录的RNA与相应的双粒病毒组基因序列的连续同源性少于或等于17个核苷酸，包含相应双粒病毒组基因序列单取代的序列的最大长度不多于30个核苷酸。
25.如权利要求23和24中任一所述的方法，其特征在于，通过诱变使与双粒病毒组基因序列的核苷酸水平同源性维持在低于或等于80％的水平。
26.如权利要求23和24中任一所述的方法，其特征在于，通过诱变使与双粒病毒组基因序列的核苷酸水平同源性维持在低于或等于70％的水平。
27.如权利要求23-26中任一所述的方法，其特征在于，通过诱变使与双粒病毒组基因序列的核苷酸水平连续同源性维持在少于或等于8个核苷酸的水平。
28.如权利要求23-27中任一所述的方法，其特征在于，通过诱变使与双粒病毒组基因序列的核苷酸水平连续同源性维持在少于或等于5个核苷酸的水平。
29.如权利要求23-28中任一所述的方法，其特征在于，所述包含相应双粒病毒组基因序列单取代的序列的最大长度不多于20个核苷酸。
30.如权利要求23-29中任一所述的方法，其特征在于，所述包含相应双粒病毒组基因序列单取代的序列的最大长度不多于9个核苷酸。
31.如权利要求23-30中任一所述的方法，其特征在于，所述诱变包括沉默点突变或缺失和/或插入和/或取代。
32.如权利要求23-31中任一所述的方法，其特征在于，步骤b)中所述的诱变包括步骤a)的病毒基因序列的5’或3’区缺失，直到鉴定到与编码野生型蛋白的序列相比在siRNA群体中未被充分代表的所述基因序列的最小区，且所述截短蛋白维持产生抗双粒病毒组抗性的能力。
33.如权利要求32中所述的方法，其特征在于，所述步骤a)的病毒基因序列是C1/AL1/AC1基因。
34.如权利要求32中所述的方法，其特征在于，所述C1/AL1/AC1基因是TYLCSV基因。
35.如权利要求32中所述的方法，其特征在于，所述氨基酸序列是病毒野生型蛋白的截短蛋白。
36.如权利要求32-35中任一所述的方法，其特征在于，不成为转录后沉默的靶或成为其无效靶的病毒基因序列是SEQ ID No 8。
37.如权利要求32-36中任一所述的方法，其特征在于，所述截短蛋白是Rep-130(SEQ ID No 9)。
38.如权利要求23-31中任一所述的方法，其特征在于，步骤b)中所述的诱变包括步骤a)的病毒基因序列的沉默点突变，以维持相同序列编码的氨基酸序列产生抗双粒病毒组抗性的能力，并使其不成为转录后沉默的靶或成为其无效靶。
39.如权利要求38中所述的方法，其特征在于，所述步骤a)的病毒基因序列是V1/AR1/AV1(CP)基因。
40.如权利要求39中所述的方法，其特征在于，所述V1/AR1/AV1(CP)基因是TYLCSV基因。
41.如权利要求38-40中任一所述的方法，其特征在于，不成为转录后沉默的靶或成为其无效靶的病毒基因序列是SEQ ID No 8。
42.如权利要求38中所述的方法，其特征在于，所述步骤a)的病毒基因序列是TYLCSV的C1/AL1/AC1。
43.如权利要求42中所述的方法，其特征在于，不成为转录后沉默的靶或成为其无效靶的病毒基因序列是SEQ ID No 2或SEQ ID No 4。
全文摘要
本发明涉及生产持续抗双粒病毒组的转基因植物的方法，其中转基因由合适修饰的获自病原体的多核苷酸序列组成。
文档编号C07K14/01GK1791676SQ200480013749
公开日2006年6月21日 申请日期2004年5月19日 优先权日2003年5月19日
发明者M·塔瓦扎, R·塔瓦扎, A·卢乔利, A·布鲁内蒂, A·贝拉尔迪, E·诺里斯, G·P·阿科托 申请人:Enea－意大利国家新技术能源及环境局, 国家研究院