专利名称：：用于治疗细菌感染的表达载体的制作方法用于治疗细菌感染的表达载体本申请是美国序号09/883，34360/054(2001年6月19日提交)的部分继续申请，后者是美国序号08/924,629(现在美国专利6,403,082)的继续申请；和美国序号10/916,641(2004年8月9日提交)的部分继续申请。I.发明领域本发明涉及表达载体，其可以用于将至少一种异源基因转移到革兰氏阴性细菌、优选乳酸细菌(LAB)中并在其中表达。本发明还涉及所转化的宿主、异源基因产物、含有所述宿主的发酵物和/或基因产物或者其组合的抗细菌用途。II.
背景技术：
：许多细菌产生抗细菌肽或者蛋白质(例如，细菌素)，其通常对其他细菌、通常密切相关的细菌具有活性。细菌和它们的细菌素的示例性列表在表1中显示。典型的细菌素是大肠杆菌(Escherichiacoli)产生的大肠杆菌素。多数大肠杆菌素是相对大的蛋白质化合物，其不从细菌细胞主动地分泌。大肠杆菌产生的微生物素是通过专门的输出途径从细胞分泌的肽或者多肽并且被翻译后修饰(I类微生物素)或者不是翻译后修饰的(II类微生物素)。翻译后修饰需要产生修饰核糖体翻译的肽的酶。LAB产生的细菌素通常对其他革兰氏阳性细菌、特别是密切相关的LAB具有活性。同样地，革兰氏阴性细菌产生的细菌素对革兰氏阴性耙菌株有活性。例如，大肠杆菌产生的一种细菌素大肠杆菌素V对多种其他大肠杆菌具有活性。大肠杆菌素V是从大肠杆菌发现的第一种大肠杆菌素。它是II类微生物素，其作为105个氨基酸的前肽(前导序列+细菌素)合成，其被切页割而释放88个氨基酸的成熟肽。大肠杆菌素V操纵子包括结构基因、免疫性基因和两个专门的转运基因。许多LAB产生细菌素，包括羊毛硫抗菌肽(I类)；非羊毛硫抗菌肽(II类)；和蛋白质(III类)。乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcuslactissubsp.lactis)产生的羊毛硫抗菌肽如乳酸链球菌肽被翻译后修饰并且具有由11种基因组成的遗传操纵子，用于它们的合成、免疫性、修饰和从细胞输出。非羊毛硫抗生素(II类)细菌素在遗传复杂性方面类似于大肠杆菌素V。这些细菌素以前肽产生，其被切割形成成熟的肽并且以与大肠杆菌素V相同的方式从细胞输出，例如，carno细菌素sA和B2、leucocinA和片球菌素PA-1。广布肉杆菌(Carnobacteriumdivergens)UAL9产生的非羊毛硫抗生素divergicinA的产生和从细胞分泌仅需要两种基因。分泌处于细胞的一般分泌(sec)途径的控制下。PredivergicinA由信号肽和divergicinA组成。一种基因或者核苷酸编码细菌素。另一种基因编码免疫蛋白。迄今还没有发现LAB产生的细菌素对革兰氏阴性细菌如大肠杆菌有活性。由于下文将变得更显而易见到原因，希望选择产生对一种或多种革兰氏阴性细菌有活性的细菌素的革兰氏阳性宿主。例如，如果将LAB遗传修饰(GM0)以产生细菌素(如大肠杆菌素V)或者对另一种靶细菌有活性的细菌素，那么LAB可以耙定大肠杆菌。此外，使用表达有效针对革兰氏阴性细菌的细菌素的革兰氏阳性细菌，能够靶定革兰氏阴性细菌如大肠杆菌，提示可能存在还针对革兰氏阴性细菌导致的任一疾病或者状况的备选或者补充的疗法或者预防性治疗方案。这种状况的实例是断奶后腹泻(PWD)，也称作新生动物泄泻症，其由猪中的大肠杆菌引起。大肠杆菌PWD或者新生动物泄泻症的爆发是猪生产中出现的问题。PWD或者新生动物泄泻症通常导致受感染的动物的显著的体重减轻。需要在感染期间促进体重增加或者至少导致体重不进一步减轻的治疗。II.发明概述本发明提供了依赖于LAB的使用的技术，所述LAB被遗传修饰(GM0)以产生特异靶定疾病的病原体的异源多肽，如细菌素。本发明的组合物和方法的一种或许多特定用途包括治疗刚断奶的猪中肠毒性大肠杆菌引起的断奶后腹泻(PWD)。该技术可以应用于革兰氏阳性LAB在特定环境中生长而不导致害处的无论何处。这些环境包括动物饲料，如青贮饲料；发酵的食品和缺氧或者真空包装的食品，如生的和加工的食物、蔬菜和生面团产品；和动物(和人)胃肠道(GI)或者生殖泌尿道。此外，一些LAB菌株可以是益生的(即，促进健康)，但是它们可以不"靶定"特定病原体。根据本发明，一些LAB可以通过遗传修饰而针对特定病原体，如大肠杆菌。此外，本发明的组合物和/或方法可以是预防大而不是治愈性的。在本发明的这些实施方案中，组合物和方法可以有效作为喂饲亚治疗水平的抗生素如针对GI疾病的预防剂的替代。附图显示了本发明的阐明性实施方案，这些和其他的目的、新颖特征和优点将从这些实施方案显而易见。IV.附图简述图l是pCaT的图示。图2是pCV22的图示，并且图解了用大肠杆菌素V(colV)基因替换pCaT运动基因(mob)。图3是pCB12的图示，并且图解了用肉杆菌属(Carnobacterium)免疫性基因(cbiA)替换pCaT链霉素抗性基因和R印lb基因。图4是pCB15对图示，并且图解了用brochocinC免疫性基因(brcl)替换cbiA基因地pCB12。pCB15包括大肠杆菌素V(图解到)、并且pCB15s包括大肠杆菌素VM(未图解)。图5提供了大肠杆菌素V和大肠杆菌素VM的核苷酸和氨基酸序列。图5A和5C分别显示了大肠杆菌素V大核苷酸和氨基酸序列；图5B和5D分别显示了大肠杆菌素VM的核苷酸和氨基酸序列。图6是pCB21的图示，并且图解了从pCB15除去EcoRV限制性位点。图7是pCB22的图示，并且图解了从pCB21除去cat基因。图8是pCB23m和一种饲料级载体的图示；并且图解了pCB22中大肠杆菌素V基因向pCB23m中大肠杆菌素VM基因(colVM)的改变。图9是pCB19的图示，并且图解了包括含有多个克隆位点的多接头。图10是p15启动子的核苷酸序列。图11是用于产生含有p15启动子和大肠杆菌素V基因的DNA片段的重组PCR技术。标记限制性位点(EcoRI和Kpnl)和使用的引物。pGKV210-p15和pCB15用作第一轮PCR的模板。SP二信号肽divergicinA;colV二大肠杆菌素V基因；pl5-pl5启动子。图12是pCB101的图示。图13是pCB103的图示。图14是pCB104的图示。图15是pCB110的图示。图16图解了本发明的表达载体pMvB。V.发明详述本发明涉及用于在革兰氏阳性宿主如乳酸细菌中表达革兰氏(一)多肽，如细菌素的组合物和方法。本发明还包括根据本发明的遗传修饰的革兰氏阳性宿主、该遗传修饰的宿主产生的多肽、包括GMO细菌和/或多肽的组合物和其组合在治疗敏感细菌中的用途。本发明还包括适于转化革兰氏阳性宿主和分泌有效针对革兰氏阴性细菌的表达载体。在本发明的这些实施方案中，技术人员将容易认识到表达载体可以根据宿主的选择、使用的启动子和多肽而不同地构造。在本发明的优选实施方案中，表达载体包括信号肽，优选divergicinA信号肽，和至少一个细菌素免疫性基因。在本发明的最优选的实施方案中，表达载体适于用于LAB宿主。本发明还包括用于治疗敏感细菌和敏感细菌引起的疾病或者状况的组合物和方法。在本发明的优选实施方案中，本发明的一些组合物和方法用于治疗大肠杆菌。在本发明的最优选的实施方案中，组合物和方法用于治疗新生动物泄泻症。本发明的一个实施方案包括用于表达突变得大肠杆菌素V细菌素(称作大肠杆菌素VM)的表达载体。在本发明的该实施方案中，表达载体包含编码大肠杆菌素VM的核苷酸序列。示例性核苷酸序列包括但不限于Seq.I.D.No.l和Seq.I.D.No.3中显示了那些。示例性氨基酸序列包括但不限于Seq.I.D.No.2和Seq.I.D.No.4中显示的那些。本领域技术人员将认识到多种启动子信号肽、选择标记、和功能表达载体的其他常规的元件可以用于表达大肠杆菌素VM。本发明的示例性实施方案包括pCB载体，其包含P15或者P32启动子；divergicinA信号肽；编码大肠杆菌素VM的核苷酸序列；选择标记，包括但不限于细菌素免疫性基因(如brochocinC);和一个或多个合适的复制区。在图4中显示的表达载体中，表达载体包括P32启动子、divergicinA信号肽、编码大肠杆菌素VM的核苷酸序列、编码brochocinC免疫性基因的核苷酸序列，和来自pCaT动复制区R印lA和R印B(见Jewell,等人；CurrentMicrobiology:19:343-346(1989))。在本发明的优选实施方案中，表达载体和表达载体转化的宿主是食品或者词料级。在本发明的最优选的实施方案中，宿主和表达载体不含有编码或者赋予抗生素抗性的基因或者核苷酸序列。本发明的另一实施方案包括本发明的表达载体转化的宿主细胞。在本发明的优选实施方案中，组合物和方法包括CB4、用含有编码大肠杆菌素VM细菌素的核苷酸序列的表达载体转化的路氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)宿主CB4。CB4在2004年12月8日保藏在美国典型培养物保藏中心(10801UniversityBoulevard,Manassas,VirginiaUSA20118)。保藏号为PTA-6426。在本发明的这些实施方案中，宿主乳酸细菌能够表达或分泌一种或多种多肽，包括一种或多种细菌素，并且包括如本文描述的允许分泌一种或多种细菌素的表达载体。可以通过接合、转化、原生质体融合或者其他基因或者核苷酸转移方法向宿主细菌中引入表达载体。本发明的另一实施方案包括表达载体和其使用方法，其中载体包括选自但不限于brochocinC和carno细菌素A的细菌素免疫性基因。本发明的另一实施方案包括动物饲料，其包含用本发明的表达载体转化的宿主细菌、本发明的转化的宿主产生的细菌或者其组合。本发明的另一实施方案包括益生组合物，其包含用本发明的表达载体转化的宿主细菌、本发明的转化的宿主产生的细菌或者其组合。本发明的另一实施方案包括使用组合物治疗动物或者人中的细菌感染的方法，所述组合物包含用本发明的表达载体转化的宿主细菌、本发明的转化的宿主产生的细菌或者其组合。本发明的另一实施方案包括包括用于治疗对根据本发明表达的细菌素敏感到任何大肠杆菌的组合物和方法。本发明的优选的组合物包括治疗大肠杆菌和/或大肠杆菌引起的疾病和状况。本发明的最优选的实施方案包括治疗猪中断奶后腹泻或者新生动物泄泻症，和/或促进体重增加或者预防体重减轻。本发明的表达载体可以来自LAB，尤其乳杆菌属的LAB。本发明的质粒可以有利地稳定转移到属于肉杆菌属(Carnobacterium)、明串珠菌属(Leuconostoc)、乳杆菌属、片球菌属(Pediococcus)或者肠球菌属(Enterococcus)等等等乳酸细菌中。本发明还涉及质粒或者用前面定义的质粒转化的宿主，所述质粒包含核苷酸序列SEQIDNo.l或Seq.LD.No.3，或者通过插入、缺失或者突变一个到几个碱基对而与该序列不同并且仍然保留复制的能力的序列。本发明还涉及质粒或者用前面定义的质粒转化的宿主，所述质粒表达包含Seq.IDNo.2或Seq.LD.No.4的氨基酸序列或者通过插入、缺失或者突变一个到几个氨基酸与该序列不同并且保留复制的能力的序列。本发明还涉及如图2—4、6—9和12—15中显示的表达载体，该载体包含如所示的核苷酸序列或者通过插入、缺失或者突变一个到几个对而与该序列不同并保持质粒在合适的细菌宿主如LAB中稳定复制能力的序列。本发明还涉及包含根据本发明的表达载体的细菌宿主细胞。本发明的示例性表达载体包括但不限于pJKM37、pCV22、pCB12、pCB15、pCB15s、pCB21、pCB22、pCB23M、pCB19、pGKV210、pGKV210—P15、pCB101、pCB103、pCB104、pCB110和pCBlll。通过这些表达载体的至少一种转化的示例性宿主包括但不限于CarnobacteriummaltaromaticumUAL26、路氏乳杆菌CB4、路氏乳杆菌的两种其他菌株和约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii)的一种菌株。因为可以用于转化目的的宿主细胞的宽范围，根据本发明的质粒组成了用于在宿主LAB中克隆和表达异源核苷酸序列的杰出工具。具体地，本发明的质粒可以用于表达异源蛋白质，如细菌素和抗这些细菌素的蛋白质，也称作免疫蛋白。现在将更详细地描述这些成分的每一种。根据本发明，可以使用任何合适的宿主细菌。在本发明的优选实施方案中，宿主细菌是革兰氏阳性细菌。在本发明的最优选的实施方案中，宿主细菌是乳酸细菌(LAB)。示例性合适的宿主包括但不限于，表l和实施例中所示的那些。合适的宿主的选择在本本发明的技术人员能力范围之内。在本发明的优选实施方案中，宿主是路氏乳杆菌。在本发明的最优选的实施方案中，宿主是路氏乳杆菌菌株CB4。根据本发明，可以适于用于表达细菌素基因的任何启动子。例如，可以使用与宿主菌株相容的任一启动子，其中使用本发明的分泌系统。合适的启动子和具体启动子的选择是本领域技术人员显而易见的。合适的示例性启动子包括但不限于P15和P32。见例如引入本文作为参考的美国专利5,939,317。在本发明的优选实施方案中，表达载体包括P15启动子，其有效结合目的细菌素基因。根据本发明，可以使用具有对应于Seq.IDNo.5的核苷酸序列的启动子(见图10)。根据本发明，可以使用适于用于表达细菌素基因的任一种信号肽。合适的信号肽包括但不限于，divergicinA的信号肽。在本发明的优选实施方案中，表达载体包括divergicinA信号肽，其有效结合目的细菌素基因。根据本发明，可以使用具有对应于美国专利6，403,082(Stiles等人)中公开的那些核苷酸序列的信号肽，将该专利引入本文作为参考。根据本发明，可以使用任一种细菌素基因。见例如表1。合适的细菌素基因包括但不限于大肠杆菌素V、大肠杆菌素YlOl、大肠杆菌素VM、leucocinA和brochocin-C。在本发明的优选实施方案中，表达载体包括编码上面的细菌素的一种或多种的核苷酸或者基因。在本发明的最优选的实施方案中，表达载体包括编码大肠杆菌素VM的核苷酸序列或者基因。细菌素的示例性核苷酸序列是本领域技术人员公知的。见例如美国专利6,403,082(Stiles，等人)。根据本发明，组合物和方法包括宿主和/或表达载体，其包含编码突变的大肠杆菌素V的核苷酸序列或者基因，该核苷酸序列或者基因含有下面的核苷酸序列gtggctggaggtgtggctggaggt(Seq.I.D.No.1)。见图5B。在本发明的最优选的实施方案中，组合物和方法包括宿主和/或表达载体，其包含编码突变的大肠杆菌素V的核苷酸序列或者基因，核苷酸序列或者基因含有图5B中所示的核苷酸序列(Seq.I.D.No.3)。根据本发明，组合物和方法包括宿主和/或表达载体，其编码下面的大肠杆菌素VM氨基酸序列VAGGVAGG(Seq.LD.No.2)。在本发明的最优选的实施方案中，组合物和方法包括宿主和/或表达载体，其编码对应于Seq.I.D.No.4的大肠杆菌素VM氨基酸序列。见图5。根据本发明，可以使用适于用于表达细菌素基因的任一种选择标记。合适的选择标记包括但不限于carno细菌素A、piscicolin126和brochocin-C的细菌素基因；和抗生素抗性基因，如氯霉素、红霉素和链霉素抗性基因。在本发明的优选实施方案中，表达载体包括细菌素免疫性基因，优选brochocinC免疫性基因，其有效结合目的细菌素基因。免疫性基因的示例性核苷酸序列是本领域技术人员公知的。见例如，美国专利6,403,082(Stiles，等人)，将其引入本文作为参考。如上面提到的，可以非常希望产生和使用词料级载体和宿主；此类载体和宿主缺少功能抗生素抗性基因，并且根据本发明，包括编码细菌素免疫性的核苷酸序列或者基因。本发明还包括通过用下面的组合物使用或者接触细菌或者动物来治疗细菌感染的方法或者治疗动物(包括人)的方法包含通过本发明的表达载体转化的一种或多种宿主的组合物；包含通过转化的宿主产生的一种或多种细菌素的组合物；天然产生或者GMO产生的一种或多种细菌素(见例如表l);或者其组合。在本发明的优选实施方案中，本发明的任一种组合物可以用于治疗大肠杆菌疾病或者状况，包括但不限于新生动物泄泻症。在本发明的一些实施方案中，本发明的任一种组合物可以用于促进受试者动物中的体重增加。在本发明的一些实施方案中，本发明的任一种组合物可以用于治疗或者影响受治疗的受试者中的固有的微生物区系。本发明的一个实施方案包括表达载体pMvB，其包含合适的启动子，例如，P15;编码信号肽，例如，divergicinA信号肽的DNA;编码多肽，例如，编码细菌素，包括但不限于大肠杆菌素V的的基因；选择标记，包括但不限于细菌素免疫性基因，例如，brochocinC;和合适的复制区，如pCat(通过商业途径可获得的质粒)。在本发明的优选实施方案中，将来自pCaT质粒的不需要和/或必要的序列(如抗生素标记和运动基因)缺失以得到可以用作复制子的pCaT的片段。根据本发明，向PCaT复制子进行一些添加，包括但不限于任何希望的基因(如细菌素和免疫性基因)、启动子(如P15)和表达信号。根据本发明，可以使用适于用于乳酸细菌宿主的复制序列。合适的复制序列包括但不限于pCaT的复制区。在本发明的优选实施方案中，复制序列包括来自植物乳杆菌(Lplantarum)。定义如本文使用的术语"基因"指認A序列，包括但不限于可以转录成mRNA并翻译成多肽链、转录成rRNA或者tRNA或者作为参与DNA复制、转录和调节的酶和其他蛋白质的识别位点的DNA序列。这些基因包括但不限于结构基因、免疫性基因和分泌(转运)基因。本文使用的术语"载体"指能够将遗传物质转移到细菌宿主生物的任一种DNA材料。载体在拓扑学上可以是线性或者环状的并且包括但不限于质粒、食品级质粒或者噬菌体。载体可以包括扩增基因、增强子或者选择标记并且可以整合或不整合到宿主生物的基因组中。术语"分泌载体"或者"表达载体"指设计用来提供多肽如蛋白质从宿主生物分泌的载体。本文使用的术语"信号肽"指氨基末端氨基酸残基，其当附着到靶多肽时允许该靶多肽从细胞输出和切割信号肽。信号肽进入一般的蛋白质分泌途径。信号肽的一个实例是引入本文作为参考的美国专利6，403，082中描述的DivergicinA信号肽。可以使用其他信号肽并且其是本领域技术人员己知的。本文使用的术语"饲料或者食品级"指DNA材料的来源和它的组成。食品级指出管理机构将考虑所述物质来自食物来源并且因此适于包括在食物或者食品中，通常用于人或者动物消费的食物和食品中。食品级的生物，如乳酸细菌和起始生物的其他建立的属可以直接加入到食品中而不考虑致病性。本文使用的食品或者饲料级指物质的质量，特别是它是否没有可能不希望的成分等等。本发明的食品或者饲料级表达载体或者食品或者饲料级细菌没有或者缺少抗生素抗性基因，或者没有或者缺少可表达的或者功能抗生素抗性基因。在优选实施方案中，本发明的食品或者词料级组合物可以用于或者包括在青贮饲料、食品、饲料、奶制品、肉类、蔬菜或者生面团中。本文使用的术语"细菌素"指细菌产生的抑制一种或多种细菌物种的多肽等等。它包括但不限于来自细菌的特定菌株的多肽、来自其他类型的生物的蛋白质，或者通过基因工程产生的蛋白质。细菌素可以是抑制细菌的或者杀细菌的。本文使用的术语"免疫性基因"指产生一种蛋白质的基因，所述蛋白质保护宿主生物抵抗它产生的细菌素。免疫性基因也可以用作选择标记。本文使用的术语"敏感细菌"指细菌的种或者菌株，其被它的环境中存在的一种或多种细菌素所抑制。尽管已经按照特别优选的实施方案描述了本发明，但是本发明不限于这些实施方案。本领域技术人员尤其参考前面的教导可以做出本发明仍然包括的备选实施方案、实施例和修饰。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>6.大肠杆菌_I小菌素24_提供下面的实施例作为本领域技术人员实施本发明的指导。一般材料和方法将大肠杆菌DH5a在37X:细胞生长的LuriaBroth(LB)培养基(DifcoLaboratoriesInc.)中。CarnobacteriummaltaromaticumUAL26在25。C生长在APT(AllPurposeTween)培养基(Difco)中；路氏乳杆菌CB4在37。C生长在乳杆菌MRS培养基(MRS;Difco)中。如以前描述(vanBelkum和Stiles，1995)的测试细菌素产生。使用生长在补充用于固体平板接种的1.5%wt/vol)琼脂的APT培养基上生长的大肠杆菌(DH5a)作为指示生物测试大肠杆菌素V的产生。用于培养含有重组质粒的UAL26和CB4的氯霉素的选择浓度分别为5和10ug/ml。如Sambrook等人(1989)描述的进行克隆和DNA操作。用于分子克隆的酶从Invitrogen得到并且如生产商指示的使用。如vanBelkum和Stiles(1995)所述进行质粒分离。核苷酸测序基于Sanger等人(1977)的方法并且在Perkin-ElmerABI-PrismDNA测序仪用荧光链终止剂进行。为了转化UAL26和CB4细胞，将细胞分别在补充2%(wt/vol)甘氨酸的APT或者MRS培养基中生长。收获指数生长的细胞并用冰预冷的水洗涤两次并用冰预冷的电穿孔缓冲液(0.5M蔗糖，10%甘油，lmMMgC12，5mM磷酸钾缓冲液[pH6]并在相同缓冲液中浓缩100倍)洗涤两次。将细胞分成50y1份并在一70。C保存。如vanBelkum和Stiles(1995)的进行电穿孔，对于CB4使用下面的修改将细胞在44。C培养20分钟并在加入DNA前在冰上冷却额外的10分钟。在Gene-Pulser仪器(Bio-Rad)上进行电穿孔。25uF，200Q，2.5kV的一次脉冲用于UAL26，25uF，800Q，1.0kV的一次脉冲用于CB4。实施例1使用质粒pCaT和其衍生物作为LAB中的克隆载体图1显示了来自植物乳杆菌caTC2R(JewellandCollins-Thompson,1989)的质粒pCaT的图示。据报导pCaT质粒含有氯霉素抗性的遗传信息(cat基因)。发明人已经对该质粒完全测序并部分表征。己经将该质粒转化到多种肉杆菌、植物乳杆菌NC8和L.caseiATCC393，在这些菌株中表明氯霉素抗性(Ahn等人，1992)。pCaT质粒含有8951个碱基对。定位了一些推定的基因，包括参与复制(r印B、r印Ia和r印Ib)、运动(mob)、对氯霉素(cat)和链霉素(str)的抗生素抗性的基因，和可以编码转座酶(Tase)的截短的可读框(见图l)。发明人己经使用pCaT作为与革兰氏阳性细菌产生的蛋白质如但不限于细菌素有关的基因的克隆载体。从乳酸乳球菌乳酸亚种分离了P32启动子(vanderVossen等人，1987)并且该启动子己经用于在pJKM37中表达大肠杆菌素V基因(McCormick等人，1999)。质粒pJ認37含有P32启动子、divergicinA信号肽和大肠杆菌素V基因(colV)。在PCR反应中使用pJKM37作为模板，并使用28聚体寡核苷酸(5'-CCCGCATGCTGAATTCGGTCCTCGGGAT-3')(Seq.I.D.No.6)和28聚体寡核苷酸(5'_CCCGCATGCGGTACCACTATTTATAAAC-3')(Seq.LD.No,7)，Seq.I.D.No.6含有Sphl限制性位点(加下划线)，其加入与pJKM37中含有P32启动子的核苷酸序列的5'末端同源的序列中，Seq.I.D.No.7含有Sphl限制性位点(加下划线)，其加入与pJKM37中含有大肠杆菌素V的结构基因的核苷酸序列的3'末端同源的序列中。将含有融合divergicinA信号肽的P32启动子和大肠杆菌素V基因(coN)的PCR产物通过用pCaT的含有运动基因的2.1kbSphl片段替换克隆到PCaT中。将所得质粒pCV22(图2)转化到无质粒的宿主CarnobacteriummaltaromaticumUAL26中。这些转化的细胞抑制大肠杆菌素V敏感的指示菌株大肠杆菌DH5a的生长。实施例2将细菌素免疫性基因作为选择标记导入转化到LAB中的产生大肠杆菌素V的pCaT衍生物中将细菌素的免疫性基因作为遗传选择标记导入pCV22中。为该步骤选择编码细菌素免疫蛋白的两种不同的功能多核苷酸序列carnobacteriocinA免疫性基因禾口brochocin-C免疫性基因(Fr認等人，2000;McCormick等人，1998)。在质粒pCF08中，将编码carnobacteriocinA免疫性的中间序列克隆到P32启动子(功能的)后面(Franz等人，2000)。将28聚体寡核苷酸(5'-TATATGATCAGGTCCTCGGGATATGATA-3，)(Seq.LD.No.8)和28聚体寡核苷酸(5'-TATACTGCAGGGTACCGTCTACAGTCTG-3')(Seq.I.D.No.9)用于扩增处于P32控制下的编码carnobacteriocinA免疫性基因的序列，Seq.I.D.No.8含有Bcl1限制性位点(加下划线)，其加入与pCF08(Franz等人，2000)中含有P32启动子的核苷酸序列的5'同源的序列中，Seq.I.D.No.9含有Pstl限制性位点(加下划线)，其加入pCF08中编码carnobacteriocinA免疫蛋白的核苷酸序列的3'末端。使用Bell和Pstl限制性位点，将该PCR产物克隆到pCV22中。所得质粒pCB12(图3)的carnobacteriocinA免疫性基因随后通过细菌素brochocin-C的免疫性基因替换。将40聚体寡核苷酸(5'-ATATATCGATAGGAAGTATGATCAATGGTAAAAACTATAC—3')(Seq.I.D.No.10)和35聚体寡核苷酸(5'-ATATCTGCAGATATCTAGTTAGAGAATATAATCCA-3')(Seq.I.D.No.ll)用于扩增brochocin-C的免疫性基因，Seq.I.D.No.10含有加入pJKM61(McCormick等人，1998)中brochocin-C免疫性基因的5，末端的Clal限制性位点(加下划线)，Seq.I.D.No.11含有加入pJKM61中brochocin-C免疫性基因的3'末端的PstI限制性位点(加下划线)。将该PCR产物克隆到pCB12的Clal和Pstl限制性位点中，得到质粒pCB15(图4)。将质粒pCB15转化到C.maltaromaticumUAL26中。转化的菌株抑制大肠杆菌素V敏感的指示生物如大肠杆菌DH5a的生长并且显示出对brochocin-C的免疫性[来自APT培养基中BrochothrixcampestrisATCC43754的培养物的20%热处理(10(TC5分钟)的耗尽上清液]。实施例3分离和选择路氏乳杆菌CB4用作宿主以开发定向益生生物的宿主从小型的地方检查的肉类包装厂在屠宰时得到两头健康猪的胃肠道(GIT)。将GIT切除，在前端和后端封闭，并运送到UniversityofAlbertaResearchStation的动物禾斗学实验室(AnimalSciencelaboratory)(Edmonton,Canada)。将GIT用自来水冲洗以除去肠内容物并从parses叩hagea、回肠、空肠、盲肠和结肠切段。将切割的节段的内表面用无菌显微镜载玻片刮擦以除去上皮层的表面。将刮擦的碎屑洗涤到稀释瓶中，平板接种在DifC0乳杆菌MRS琼脂(MRS)中并在37。C厌氧培养18到24小时。随机选择总共18个形态上不同的菌落并检査革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、棒状特征并接种在MRS肉汤中用于保存。检査这些菌株的细菌学纯度并用pCB15测试转化能力。仅仅选择可以被转化的乳杆菌用于进一步研究。分离物CB4能够被转化，并且通过16SrDNA分析证实为路氏乳杆菌(Willson等人，1990)。基于转化的质粒的稳定性选择路氏乳杆菌CB4作为目的菌株。实施例4在路氏乳杆菌CB4中产生突变的大肠杆菌素V细菌素大肠杆菌素VM将从C.maltaromaticumUAL26分离的pCB15电穿孔到路氏乳杆菌CB4中，得到低转化率。分离了路氏乳杆菌CB4转化体，其含有称作pCB15s的质粒，该质粒在宿主菌株中稳定并且产生抑制大肠杆菌素V敏感指示生物如大肠杆菌DH5ci的生长的细菌素。从该转化体分离来自路氏乳杆菌CB4的质粒pCB15s并电穿孔返回到无质粒的C,maltaromaticumUAL26。当将再次从这些C.maltaromaticumUAL26转化体分离的pCB15s电穿孔返回到路氏乳杆菌CB4时，得到明显更高的转化频率。插入的大肠杆菌素基因的核苷酸测序揭示在大肠杆菌素V基因中存在突变，其由核苷酸序列5'GTGGCTGGAGGT3'(Seq.I.D.No.12)的重复组成。这导致大肠杆菌素V的氨基酸29到32的重复，得到Val-Ala-Gly-Gly-Val-Ala-Gly-Gly(Seq.I.D.No.13)。所以，将突变的大肠杆菌素V命名为大肠杆菌素VM。大肠杆菌素VM由92个氨基酸而不是组成大肠杆菌素V的88个氮基酸组成(图5)。含有pCB15s的C.maltaromaticumUAL26和路氏乳杆菌CB4转化体都抑制了大肠杆菌DH5a，表明大肠杆菌素VM保留了针对大肠杆菌的抗细菌活性。实施例5使用产生重组大肠杆菌素VM的遗传修饰的细菌作为治疗猪的断奶后腹泻(PWD)的预防性治疗用于该技术的宿主菌株将是无害或者有益(益生的)的微生物，其通常伴随着靶标动物的胃肠道。导致猪的发病或者死亡的断奶后腹泻(PWD)是可以使用该技术预防的胃肠道疾病的一个实例。确定了产生大肠杆菌素VM(colVM)、含有pCB15s的转化的宿主菌株路氏乳杆菌CB4靶定导致猪中断奶后腹泻(PWD)的肠毒性大肠杆菌(ETEC)的功效。在建立的猪感染模型中测试该生物。通过PWD的减轻和正断奶的猪中正常体重增加来测量该预防治疗的功效。将20只17日龄的断奶的小猪分成两组，每组10只猪。组1不处理并且组2在实验的第1天到第9天以饮用水施用含有pCB15s的约1X109个路氏乳杆菌CB4。在第7天，两个组都用约5X108个ETEC-F4菌株(已知导致PWD)攻击，其通过食管直接内窥管施用。在该模型中选择存在F4受体阳性的动物(对ETEC-F4菌株的建群特别敏感的动物)用于单独分析。监测实验动物的健康状况并在第10天对这些猪实施安乐死用于尸检。通过分析尸检时体重增加、腹泻得分、肠内容物的一致性和攻击菌株的回肠建群测量测试生物的效果。结果从攻击当天到尸检当天，组2的每日体重增加(持续生长)高于组l的(不生长)。在组2中，施用含有pCB15s的路氏乳杆菌CB4导致提高的肠一致性，尤其空肠和回肠中的一致性，和降低的腹泻得分。在组2中，用ETEC-F4攻击菌株在回肠的建群与组1相比减小1log。通过攻击后持续的体重增加和减少的腹泻发生率和程度，阐明了对断奶的小猪施用含有pCB15s的路氏乳杆菌CB4的益处。在多种试验中，与对照小猪相比，大肠杆菌攻击后显著数目的小猪体重增加；并且与对照小猪相比，显著数目的小鼠显示出应答大肠杆菌攻击腹泻的减少和程度的降低。通过额外的攻击研究的结果证实这些数据。实施例6用饲料级载体产生突变的大肠杆菌素V细菌素大肠杆菌素VM在这些实验中，饲料级载体是缺少或者含有截短的抗生素抗性基因并且使用备选的选择系统，如细菌素免疫性基因，用于动物饲料应用。为了失活cat基因，制备称作pCB21(图6)的pCB15衍生物，其在cat基因中具有唯一的EcoRV和BstEII限制性位点。为了确保cat基因EcoRV位点是唯一的，通过下面的步骤除去位于pCB15的brochocin-C免疫性基因的立即下游的EcoRV限制性位点将实施例2中描述的40聚体(5'-ATATATCGATAGGAAGTATGATCAATGGTAAAAACTATAC—3')(Seq.I.D.No.14)和含有融合到与pJKM61中brochocin-C免疫性基因的3，末端同源的PstI限制性位点(加下划线)的27聚体寡核苷酸(5'-ATATCTGCAGTCTAGTTAGAGAATATA-3，)(Seq.I.D.No.15)用于扩增brochocin-C的免疫性基因。将该PCR产物克隆到pCB15的Clal和Pstl限制性位点中以替换含有下游EcoRV限制酶位点的brochocin-C免疫性基因并转化到C.maltaromaticumUAL26中。从转化体得到的质粒pCB21(图6)用EcoRV和BstEII消化，通过DNA聚合酶I和dNTP补平，自身连接并转化到C.maltaromaticumUAL26中。通过在含有来自在APT培养基中生长的BrochothrixcampestrisATCC43754的20%热处理(100。C5分钟)的耗尽的上清液的APT平板上接种，选择UAL26转化体。所得的UAL26转化体含有质粒pCB22(图7)并且对氯霉素和产生的大肠杆菌素V敏感。为了实现用不能产生天然大肠杆菌素V的乳杆菌菌株中的饲料级载体产生大肠杆菌素VM，进行下面的克隆实验。从含有大肠杆菌素VM基因的质粒pCB15s分离1.5-kbEcoRI-Psfl片段并克隆到质粒pCB22的EcoRI-Psfl限制性位点中。所得的质粒pCB23M(图8)失去了含有天然大肠杆菌素V基因的1.5-kbEcoRI-Psfl片段，因为它被含有大肠杆菌素VM结构基因的1.5-kbEcoRI-PsfI片段替换。含有pCB23M的C.maltaromaticumUAL26抑制大肠杆菌DH5a，对brochocin-C免疫并且对氯霉素敏感。从C.maltaromaticumUAL26分离质粒pCB23M并通过电穿孔转移到路氏乳杆菌CB4，使用4000AU/mlbrochocin-C作为选择剂。含有pCB23M的CB4的转化体对氯霉素敏感，对brochocin-C免疫并且抑制指示生物大肠杆菌DH5a的生长。该结果表明我们使用饲料级质粒得到了抑制大肠杆菌的路氏乳杆菌CB4的菌株。实施例7质粒pCB19用作LAB中的克隆载体通过引入可以用于克隆目的DNA片段的多个克隆位点，构建基于pCaT的克隆载体pCB19。将来自pCaT的pCaT4.6-kbSphI—PstIDNA片段用含有多个克隆位点的多接头(5'-GCATGCGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCCTGCAG-3')(Seq.I.D.No.16)替换(图9)，所述4.6-kbSphI—PstIDNA片段片段含有可以编码参与质粒的水平转移的蛋白质的可读框以及氯霉素抗性基因。所得4.3-kb质粒pCB19(见图8)当转化到乳酸细菌中时可以使用氯霉素抗性基因(cat)选择。该质粒已经转化到乳酸细菌如C.maltaromaticum和路氏乳杆菌中。其他选择标记包括但不限于细菌素免疫性基因，可以克隆到pCB19的多个克隆位点中。发明人已经阐明编码诸如细菌素的蛋白质的基因可以克隆到pCB19的多个克隆位点中，导致乳酸细菌输出重组蛋白。实施例8从C.maltaromaticum菌株筛选启动子为了研究是否可以发现其他合适当启动子用来在LAB中表达细菌素，克隆了C.maltaromaticumLV17的染色体DNA。发明人从C.maltaromaticumLV17分离染色体DNA，用限制酶Mbol完全消化并克隆到启动子筛选载体pGKV210(vanderVossen等人，1985)中。通过电穿孔将连接混合物转移到CmaltaromaticumUAL26中并在含有20ug氯霉素/ml的APT琼脂板上选择转化体。得的称作pGKV210-P15的一种这样的转化体，在APT平板上生长，其氯霉素浓度高达45到50ug/ml。在从C.maltaromaticumLV17分离的pGKV210中的启动子标记为P15。一对引物含有EcoRI限制性位点(加下划线)的MP11正向引物5'GAATTCGAGCTCGCCCGG3，(Seq.I.D.No.17)禾B反向引物5，CTGCAGGTCGACTCTAGAG3，(Seq.I.D.No.18)用于扩增来自pGKV210-P15的P15启动子的插入片段。测定含有P15启动子的片段的序列并且显示含有276个核苷酸(图10)。用重组PCR技术构建表达大肠杆菌素V基因地质粒，使用P15启动子(图ll)。将MP11正向引物(5'GAATTCGAGCTCGCCCGG3')(Seq.I.D.No.19)和与P15启动子的3'末端互补的反向引物A(5'TGTGATACCAAGATGCATTCAACCATATTTGAAG3，)(Seq.I.D.No.20)和编码divergicinA的前导肽的N—末端的DNA用于扩增P15启动子片段。引物B(5'TATGGTTGAATGCATCTTGGTATCACAAACTAA3，)(Seq.工.D.No.21)和C(5〈1〉CCCGGTACCACTATTTATAAACAAACATCAC3,)(Seq.I.D.No.22)(McCormick等人，1999)用于扩增编码大肠杆菌素V和divergicinA的信号肽的DNA，使用质粒pCB15DNA作为模板。引物B与P15启动子片段和编码divergicinA的信号肽的N末端的DNA的3'末端互补。引物C含有Kpn工限制性位点(加下划线)并且用作ColV的反向引物。随后，来自上面的两种PCR产物用作模板并将引物MP11正向和C用于重组PCR以扩增含有来自两种PCR产物的DNA的片段。所得PCR产物含有P15启动子，其后为与divergicinA的信号肽融合的编码大肠杆菌素V的DNA。将上面的PCR片段用EcoRI和Kpnl限制酶消化并插入到pCB19的合适的位点中，得到质粒pCB101(图12)。通过电穿孔将质粒pCBlOl转移到C.maltaro脆ticumUAL26中。含有pCB101的菌株抑制了大肠杆菌素V指示菌株大肠杆菌DH5a的生长。实施例9使用饲料级载体在C.maltaromaticum中使用P15启动子产生大肠杆菌素V含有Xbal位点(加下划线)的引物(5'GTAACTCTAGAAGGAAGTATGATCAATGGTA3')(Seq.I.D.No.23)和含有Xbal位点(加下划线)的引物(5'TATCTGCAGTCTAGTTAGAGAATATAATCCA3')(Seq.I.D.No.24)用于扩增brochocin-C免疫性基因，使用pCB15DNA作为模板。将PCR产物插入到pCBlOl的合适的位点，得到质粒pCB103(图13)。当将pCB103转化到C.maltaromaticumUAL26中时，含有该质粒的菌株抑制了大肠杆菌DH5a的生长并且抗氯霉素。为了构建含有colV的饲料级载体，将质粒pCB103消化位于cat基因内的独特的限制酶位点EcoRV和BstEII，以除去多数cat基因。将线性片段通过DNA聚合酶I平端化，自身连接并转化到C.maltaromaticumUAL26中。所得词料级质粒PCB104含有编码融合到大肠杆菌素V的divergicinA的信号肽和brochocin-C免疫性的DNA，其处于P15启动子控制下(图14)。在含有80AUbrochocin-C/ml的APT琼脂板上选择含有pCB104的C.maltaromaticumUAL26。如以前描述的(vanBelkum和Stiles，1995)使用广布肉杆菌LV13(Worobo等人1995)作为指示生长测定brochocin-C的活性单位。这些菌株抑制大肠杆菌DH5a的生长，并且对氯霉素敏感。含有质粒pCB101、pCB103和pCB104的C.maltaromaticumUAL26都以相似的水平产生细菌素，其抑制大肠杆菌DH5a的生长。含有pCB104的C.maltaromaticumUAL26显示出对brochocin-C的抗性，但是对氯霉素的敏感性。实施例10使用启动子P15在词料级载体中表达大肠杆菌素VM的产生为了使用饲料级载体在不能产生大肠杆菌素V的乳杆菌菌株中产生大肠杆菌素VM，进行重组PCR技术和亚克隆。如前通过PCR扩增P15启动子，使用引物Mll正向和引物A(见图11)和模板pGKV210-P15。使用引物B和C和模板pCB23M通过PCR扩增colVM基因。用重组PCR扩增含有P15启动子、divergicinA的信号肽和colVM的片段。使用引物MP11正向禾口C和来自上面的含有P15启动子和colVM基因的PCR产物作为模板扩增该片段。通过EcoRI和K叩I得到该片段并通过替换pCB104中EcoRI/Kpnl片段插入到质粒pCB104合适的位点。所得质粒pCB110是饲料级载体，其含有P15启动子和融合到colVM的divergicinA的信号月太(图15)。备选地，通过用P15启动子置换pCB23M中的P32启动子构建称作pCBlll的饲料级质粒。质粒pCBlll与pCB23M类似，只是它含有P15启动子代替P32启动子。含有pCB110或pCBlll的C.maltatomaticumUAL26显示出对大肠杆菌的活性，对氯霉素的敏感性，和对brochocinC的抗性。将质粒pCB110或和pCBlll转化到路氏乳杆菌CB4中。含有pCB110或pCBlll的路氏乳杆菌CB4抑制大肠杆菌的生长，对氯霉素敏感并且抗brochocinC。参考文献Ahn，C，Collins-Thompson,D.，Duncan,C,andStiles,M.E.1992.MobilizationandlocationofthegeneticdeterminantofchloramphenicolresistancefromLactobacillusplantarumcaTC2R.Plasmid27:16-176.Franz，C.M.A.P.，vanBelkum，MJ.，Worobo，R.W.，Vederas，J.C，andStiles,M.E.2000.CharacterizationofthegeneticlocusresponsibleforproductionandimmunityofcamobacteriocinA:theimmunitygeneconferscross-protectiontoenterocinB.Microbiology146:621-631.Jewell,B.,andCollins-Thompson,D.L1989.CharacterizationofchloramphenicolresistanceinLactobacillusplantarumcaTC2R.Curr.Microbiol.19:343-346.McCormick，丄K.，Poon'A.，Sailer,M.，Gao，Y，Roy,K.L.,McMullen,L.M.，Vederas，J.C，Stiles,M.E.，andvanBelkum,M.丄1998.Geneticcharacterizationandheterologousexpressionofbrochocin-C，anantibotulinal，two-peptidebacteriocinproducedbyBrochothrixcampestrisATCC43754.Appl.Environ.Microbiol.64:4757-4766.McCormick,J.K.，Klaenha腿er，T.R.，andStiles，M.E.1999.ColicinVcanbeproducedbylacticacidbacteria.Lett.Appl.Microbiol.29:37-41.Sambrook，J.，Fritsch，E.R,andManiatis,T.1989.MolecularCloning:ALaboratoryManual,2<nd〉edn.ColdSpringHarbor,NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress.Sanger,R，Nicklen，S.，Coulson，A.R.1977.DNAsequencingwithchain-terminatinginhibitors.Proc.Natl.Acad.Sci.74:5463-5467.Stiles，M.E.，Vederas，J.C.，vanBelkum，M.J.，Worobo,R.W.，Worobo,R.J.，McCormick，J.K.，Greer,G.G.，McMullen，L.M.，Leisner,J.J".，Poon，A.，Franz,C.M.A.P.2002.Bacteriocins，transportandvectorsystemandmethodofusethereof.USPat.6，403'082.vanBelkum,M.J.，andStiles，M.E.1995.MolecularcharacterizationofgenesinvolvedintheproductionofthebacteriocinleucocinAfromLeuconostocgelidum.Appl.Environ.Microbiol.61:3573-3579.VanderVossen，J.M.B.M.，Kok，J.,andVenema，G.1985.Constructionofcloning,promoter—screening,andterminator-screeningshuttlevectorsforBacillussubtilisandLactococcuslactissubsp.lactis.Appl.Environ.Microbiol.50:540-542.vanderVossen，J.M.B.M.，vanderLelie，D.，andVenema,G.1987.IsolationandcharacterizationofStreptococcuscremorisWg2-specificpromoters.Appl.Environ.Microbiol.53:2452-2457.Wilson,K.H.，Blitchington,R.B.,andGreene,R.C.1990.Amplificationofbacterial16SribosomalDNAwithpolymerasechainreaction.J.Clin.Microbiol.28:1942—1946.Worobo，R.W.，vanBelkum，M.J.，Sailer,M.，Roy，K丄，Vederas,J".C，andStiles,M.E.1995.Asignalpeptidesecretion—dependentbacteriocinfromCarnobacteriumdivergens.J.BacterioL177:3143—3149.权利要求1.用于分泌多肽的表达载体，其包含启动子、有效结合所述多肽的信号序列、编码突变的大肠杆菌素V的DNA序列，和终止子。2.权利要求1的表达载体，其中所述突变的大肠杆菌素V包含SeqI.D.No.1。3.权利要求1的表达载体，其中所述突变的大肠杆菌素V包含SeqLD,No.3。4.权利要求1的表达载体，其还包含编码免疫性基因的核苷酸序列。5.权利要求4的表达载体，其中所述免疫性基因是细菌素免疫性基因。6.权利要求5的表达载体，其中细菌素免疫性基因是选自camobacteriocinA禾口brochocin—C的一禾中或多种免疫性基因。7.权利要求l的表达载体，其编码对应于Seq.I.D.No.2的氨基酸序列。8.权利要求l的表达载体，其编码对应于Seq.I.D.No.4的氨基酸序列。9.权利要求l的表达载体，其中所述启动子选自由P32和P15组成的组。10.权利要求9的表达载体，所述启动子包含P15核苷酸序列。11.权利要求1的表达载体，其中所述载体不包括功能抗生素抗性基因。12.权利要求1的表达载体，其中所述信号肽是divergicinA。13.产生大肠杆菌素VM的方法，其包括在合适的宿主中导入表达载体，其中所述表达载体包含编码大肠杆菌素VM的核苷酸序列，并且其中所述宿主是乳酸细菌；和从所述宿主分泌所述大肠杆菌素VM。14.突变的大肠杆菌素V细菌素，其包含对应于SeqI.D.No.l的核苷酸序列编码的蛋白质。15.权利要求14的突变的大肠杆菌素V细菌素，其中所述蛋白质由对应于SeqI.D.No.3的核苷酸序列编码。16.组合物，其包含权利要求1的表达载体。17.乳酸细菌，其包含权利要求1的表达载体。18.治疗大肠杆菌疾病或者状况的方法，其包括施用有效量的乳酸细菌宿主，该宿主中具有分泌大肠杆菌素VM的表达载体；将所述大肠杆菌与所述乳酸细菌接触；和允许所述大肠杆菌素VM针对所述大肠杆菌作用。19.抑制革兰氏阴性细菌的方法，其包括将革兰氏阴性细菌与革兰氏阳性细菌接触，其中所述革兰氏阳性细菌分泌有效针对所述革兰氏阴性细菌的抗细菌物质。20.权利要求19的方法，其中革兰氏阴性细菌是大肠杆菌。21.权利要求19的方法，其中革兰氏阳性细菌是乳酸细菌。22.权利要求19的方法，其中所述抗细菌物质是肽或蛋白质。23.权利要求22的方法，其中所述蛋白质是细菌素。24.权利要求23的方法，其中所述细菌素选自大肠杆菌素V、大肠杆菌素VM和其组合。25.用于通过革兰氏阳性宿主分泌有效抗革兰氏阴性细菌的多肽的表达载体，其包含有效抗革兰氏阴性细菌的至少一种预先选择的多肽的核苷酸序列；有效结合所述核苷酸序列的启动子；有效结合所述核苷酸序列并且在所述革兰氏阳性宿主中有效的信号肽；包含对应于细菌素免疫性基因的核苷酸序列的选择标记；和合适的复制子。26.治疗猪中肠毒性大肠杆菌的方法，其包括施用有效量的乳酸细菌，所述细菌包含产生大肠杆菌素VM的表达载体。27.权利要求26的方法，其中所述表达载体是饲料级载体。28.权利要求27的方法，其中所述饲料级载体包含细菌素免疫性基因。29.权利要求24的方法，其中所述表达载体包含适于在革兰氏阳性宿主中表达革兰氏阴性细菌素的信号肽。30.权利要求27的方法，其中所述信号肽是colV。31.权利要求27的方法，其还包含产生不是大肠杆菌素VM的抗大肠杆菌物质的乳酸细菌。32.权利要求31的方法，其中所述抗大肠杆菌物质包含大肠杆菌素V。33.权利要求33的方法，其中所述表达载体选自pCB110、PCB111、pCB15s、pCB19、pCB22和pCB23m。34.权利要求1的表达载体，其中所述表达载体选自pCB110、PCB111、pCB15s、pCB19、pCB22和pCB23m。35.组合物，其包含表达大肠杆菌素VM的细菌。36.组合物，其包含表达大肠杆菌素VM的表达载体。37.组合物，其包含包含大肠杆菌素VM的细菌素。38.用于通过革兰氏阳性宿主分泌抗革兰氏阴性细菌的多肽的食品或者饲料级表达载体，其包含有效抗革兰氏阴性细菌的至少一种预先选择的多肽的核苷酸序列；有效结合所述核苷酸序列的启动子;有效结合所述核苷酸序列并且在所述革兰氏阳性宿主中有效的信号肽；包含对应于细菌素免疫性基因的核苷酸序列的选择标记；和合适的复制子；其中所述表达载体缺少抗生素抗性基因。39.权利要求38的食品或者词料级表达载体，其中所述表达载体包括具有多个限制位点的多接头。40.权利要求38的食品或者饲料级表达载体，其中所述表达载体是选自pCB23M、pCB110和pCB111的表达载体。全文摘要本发明提供了组合物和用于产生抗细菌多肽的方法，和使用这些组合物和方法用于治疗细菌感染引起的疾病和状况的方法。更具体地，组合物和方法包括用产生有效抵抗革兰氏阴性细菌的多肽的革兰氏阳性宿主治疗革兰氏阴性细菌。文档编号C07K14/245GK101111599SQ200480044852公开日2008年1月23日申请日期2004年12月14日优先权日2004年12月14日发明者王莉茹,迈克尔·E·斯泰尔斯,马里乌斯·雅格布斯·范·别尔卡姆申请人:加拿大生物芯公司