二果糖二酐Ⅲ晶体的制备方法

专利名称：：二果糖二酐Ⅲ晶体的制备方法
技术领域：
：本发明涉及高效制备二果糖二酐III(DifructosedianhydrideIII)(以下称为DFAIII)晶体的方法。本发明即使在循环式DFAIII的制备中也无需使其结晶率降低，作为DFAIII的工业化制备方法非常优异。
背景技术：
：DFAIII是促进以钙为代表的矿物质吸收或具有利尿效果、通便改善效果的功能性低聚糖，是两个果糖的还原末端互相与其中一个还原末端以外的羟基结合而成的环状二糖类(二-D-呋喃果糖-2’，12，3’-二酐)，对水的溶解度高，显示为蔗糖的90～95％，但其甜味度为蔗糖的52％左右。还是耐热或酸的物质。关于DFAIII的制备方法，有人提出了下述DFAIII的制备方法使属于产脲节杆菌(Arthrobacterureafaciens)的细菌或其生成的酶与菊粉和/或含菊粉的植物萃取液作用，生成DFAIII含有液，将该DFAIII含有液过活性碳柱，吸附DFAIII，然后用乙醇洗脱，回收DFAIII较多的组分，蒸发干燥固化(例如参照专利文献1)。还有人提出了下述DFAIII的制备方法将菊粉和/或含有菊粉的植物萃取液过填充了固定于固定材料上的的菊粉果糖转移酶的柱子，生成DFAIII含有液，经过离子交换树脂、活性碳等纯化步骤，将该含有液生成含DFAIII的糖浆或蒸发干燥固化物(例如参照专利文献2)。还有如下记载使菊粉酶II与菊粉作用，可工业化生产高纯度的DFAIII(例如参照专利文献3)。但是，这些文献中对于获得结晶DFAIII则完全没有记载，关于高效工业化生产DFAIII晶体等的报告例子也完全未知。专利文献1日本特公昭56-26400号公报专利文献2日本特开平1-285195号公报专利文献3日本特开平11-43438号公报发明所要解决的课题近年来，伴随着对DFAIII有效用途的开发，人们对DFAIII的需求日益增加。在用于医药用途时，当然在饮料食品用途中使用时也一样，人们希望有除去了DFAIII以外的糖和各种杂质的高纯度DFAIII晶体，特别是希望能够建立由含有DFAIII的液体中更有效地获得DFAIII晶体的方法，以及结晶DFAIII的工业化制备方法。解决课题的方法本发明针对上述技术的现状，其目的在于开发制备DFAIII晶体的方法，特别是工业化高效的制备方法。因此本发明人等开发了晶体DFAIII的下述制备方法将含有DFAIII的溶液进行清洗、过滤，然后将其浓缩，进行粗结晶，分离粗晶糖浆，将所得粗晶溶解，将其清洗、过滤，然后浓缩，结晶，分离晶体糖浆，制备成品晶体。为了更进一步提高效率以及工业化，在上述中，将分离的粗晶糖浆和/或晶体糖浆再次返回结晶步骤，构建循环体系，连续地实施DFAIII晶体的制备，此时，DFAIII的结晶率随着时间的延长而降低，难以制备DFAIII晶体，特别是工业化生产上实际上无法进行，这是首次遭遇了这样重大的问题。本发明人等为了解决上述新发现的重大缺陷，对于DFAIII结晶率降低的原因从各方面进行了彻底的研究。含有DFAIII的溶液中包含DFAIII以外的物质。它们是在由菊苣等植物中萃取菊粉时来自菊苣的物质，或者来自在由砂糖通过酶合成生成菊粉时所合成的物质，或者是在由菊粉生成DFAIII的酶反应时菊粉的酶分解产物等。另外，含有DFAIII的溶液在制备晶体DFAIII的过程中，溶液滞留时间长，另外溶液的浓缩过程中长时间暴露在高温等严酷的条件下，因此在这些条件下，DFAIII含有液的组成可能由于变性而产生其它新的物质。上述各种物质都会对DFAIII的结晶产生影响。另外，在DFAIII的纯化、结晶步骤中，存在DFAIII含有液的循环，因此上述生成的DFAIII以外的新型物质得以蓄积。作为DFAIII原料之一的菊粉是1个葡萄糖上连接了多个果糖而成的多糖类，使分解转移酶与该菊粉作用时，生成DFAIII作为主要成分，还生成四糖类(G-F-F-F)或五糖类(G-F-F-F-F)的低聚果糖作为其它副产物。上述四糖类、五糖类不耐热等，在浓缩等需要高温的步骤中发生变化，分解为分子量更小的糖或最终分解为有机酸等。结果，DFAIII含有液的pH下降，特别是将制备步骤制成循环体系时，了解到该分解在DFAIII清洗、结晶步骤中进一步加速。另外，由菊粉生成DFAIII的酶反应步骤是在60℃左右的较温和的条件下进行的，但是酶反应初期的pH是中性区域(6～7)，但反应结束时的pH降低至4左右。因此，由酶反应法得到的DFAIII酶合成液的pH通常为5以下，到达后面的DFAIII结晶步骤时，这成为四糖类、五糖类分解的原因之一。即，在向DFAIII结晶步骤进展时，DFAIII以外的物质大多是来自糖类，混杂存在单醣的葡萄糖、果糖，二糖的蔗糖，三糖、四糖以上(低聚果糖)的物质，有机酸等。另外，如上所述，DFAIII是难以发生热或酸解的物质。鉴于上述情况，本发明人等针对含有DFAIII的溶液中的各种物质对制备DFAIII晶体时的影响情况进行了深入调查研究。结果令人吃惊地发现含有DFAIII的溶液的pH、以及混杂其中的糖类、特别是果糖或蔗糖对于DFAIII的结晶有很大影响，这是首次发现。因此，本发明人等针对本发明人等首次发现的上述对DFAIII结晶有特别影响的因素从各方面进行了深入研究。即，本发明人等着眼于DFAIII以外的上述物质进行各种研究，结果最新发现在DFAIII清洗、浓缩、结晶步骤中，含有DFAIII的全部溶液的pH(玻璃电极法)保持和/或调节为5以上、优选pH5～8、进一步优选pH6～8，则可以抑制在DFAIII结晶的一系列步骤中易分解物质的分解，可以将向其它物质的变化阻止在最小限度。另外，通过在(粗)晶体母液的pH为5以上、优选pH6～8下使DFAIII结晶，不会使结晶率降低，可保持升高。糖的结晶率根据结晶母液的pH变化，这不仅在DFAIII中，对于其它糖类来说也是未知的，是一个全新的认识。在DFAIII制备中，各步骤中的溶液的pH保持并调节为上述范围的方法是尽可能地在70℃以下对步骤中的溶液进行管理，这样较有效果，另外，还可以添加碱剂来主动地调节pH。所使用的碱剂例如有氢氧化钠(苛性钠)或氢氧化钾(苛性钾)、碳酸钠(碱石灰)等。另外，通过色谱，同时除去各步骤溶液中的有机酸等酸性物质和DFAIII以外的糖类，由此可以同时实现步骤溶液的DFAIII纯度的提高和防止pH降低。除上述以外的方法还可以是将含有酸性物质的DFAIII含有液过阴离子交换树脂，酸性物质通过离子交换被吸附，可以除去酸性物质。最先发现含有DFAIII的结晶母液中所含的果糖、蔗糖是特别阻碍DFAIII结晶的因素。果糖的含量为结晶母液固体成分的5％以下、优选1％以下，则可在DFAIII结晶时提高结晶率。并且，结晶母液pH为5～7时，如果相对于结晶终点温度下的溶解度的过饱和度(本发明中称为过饱和度S)在4.4以上，则在任意纯度的含DFAIII结晶母液中都可见糖膏的流动性显著降低，难以进行分蜜操作。而过饱和度S为4.1以下的条件下，糖膏具有适度的流动性，可使分蜜操作无阻碍地实施。由此可知，结晶母液pH为5以上的DFAIII工业化结晶制备条件是以结晶终点温度为基准的过饱和度S在4.1以下。过饱和度S低于1.3，则结晶率为20％以下，从结晶率的角度考虑，优选过饱和度为1.3以上、4.1以下，进一步优选1.5以上、4.1以下，更进一步优选2.3以上、4.1以下。本发明中使用的“固体成分浓度”是由通过干燥法除去溶液中的水分后残留的固体成分的重量计算的溶液中的固体成分比例(％w/w)，在实际的制备步骤管理中，可以以简便方法的R-Bx(折射白利糖度)的数值代替。本发明基于这些有用的全新认识进行进一步研究、探讨，结果终于得以完成。附图简述图1表示DFAIII晶体的制备流程的一个例子，该流程包含含有DFAIII溶液的纯化、结晶步骤。图2表示通过色谱处理进行纯化的流程的一个例子。图3表示粗结晶步骤中母液的组成和结晶率。图中，-■-表示DFAIII固体成分纯度(％)、-●-表示DFAIII结晶率(％)、-□-表示低聚果糖的固体成分纯度(％)、-◇-表示蔗糖的固体成分纯度(％)、-△-表示果糖的固体成分纯度(％)，-○-表示pH。图4、5、6中，上述符号均表示相同含义。图4表示结晶步骤中母液的组成和结晶率。图5表示通过添加苛性钠使纯化、结晶步骤的pH保持5以上时的粗结晶母液的组成和结晶率。图6表示通过添加苛性钠使纯化、结晶步骤的pH保持5以上时的结晶母液的组成和结晶率。图7表示向DFAIII溶液中添加蔗糖、果糖溶液时DFAIII结晶率的变化。图8表示含有DFAIII的溶液中存在的低聚果糖、蔗糖、果糖对于DFAIII结晶率的影响(1)。图中，FOS表示低聚果糖，Suc表示蔗糖，Fru表示果糖，Blank表示对照。图9表示含有DFAIII的溶液中存在的蔗糖(Suc)、果糖(Fru)、蔗糖和果糖的总量(Suc+Fru)对于DFAIII结晶率的影响(2)。图10表示含有DFAIII的溶液中存在的有机酸盐(乙酸钠+甲酸钠)对于DFAIII结晶率的影响。图11表示含有DFAIII的溶液的pH对于DFAIII结晶率的影响(1)。图12表示含有DFAIII的溶液的pH对于DFAIII结晶率的影响(2)。图13表示粗结晶母液的pH对于DFAIII结晶率的影响。图14表示DFAIII的溶解度和溶解度的近似曲线。图中，○表示DFAIII的溶解度(实测值)，-表示DFAIII溶解度的近似曲线。以下详述本发明。本发明是将含有DFAIII的液体纯化，无需降低结晶率即可高效率、工业化生产高纯度的DFAIII晶体，这种情况下，首次着眼于含有DFAIII的液体的pH的重要性，进行进一步研究，结果首先了解到必须是pH为5以上，根据这些有用的新认识进一步进行研究、探讨，终于完成了本发明。即，本发明的重要特征是在纯化含有DFAIII的液体、制备DFAIII晶体时，使含有DFAIII的液体的pH为5以上。以往，对于DFAIII从未进行工业化结晶，因此完全未着眼于pH的研究，在对DFAIII工业化结晶的相关研究过程中，本发明人等首次着眼于pH对DFAIII结晶的影响，因此是全新的认识。换言之，本发明是在DFAIII结晶的工业化研究中首次将问题集中于该处，可以说技术课题本身是全新的，如此看来当然其解决方法也是新型的。即，本发明包含以下内容。1.二果糖二酐III(DFAIII)晶体的制备方法，其特征在于含有二果糖二酐III(DFAIII)的溶液的pH为5以上。2.上述1的DFAIII晶体的制备方法，其特征在于通过碱剂添加法、色谱法、阴离子交换树脂法等至少一种方法调节并保持含有DFAIII的溶液的pH。3.上述1和2的DFAIII晶体的制备方法，其特征在于含有DFAIII的溶液是使果糖基转移酶与菊粉作用，将所得液体进行清洗、过滤而得到的溶液。4.上述3的DFAIII晶体的制备方法，其特征在于菊粉的果糖聚合度为10～60，多糖的固体成分纯度为70％以上。5.上述1～4中任一项的DFAIII晶体的制备方法，其特征在于在由DFAIII粗液经过粗结晶至产品结晶的将含有DFAIII的溶液清洗、过滤，然后浓缩、结晶的步骤(纯化、结晶步骤)中，至少一种含有DFAIII的溶液的pH为5以上。6.上述5的DFAIII晶体的制备方法，其特征在于将纯化、结晶步骤在循环体系中进行。7.上述1～6中任一项的DFAIII晶体的制备方法，其特征在于相对于在结晶母液或粗结晶母液冷却结晶的终点温度下的溶解度，过饱和度为1.3～4.1。8.DFAIII晶体的制备方法，其特征在于含有DFAIII的结晶母液或粗结晶母液中的果糖含量按照固体成分重量计算为5％以下。9.上述8中的DFAIII晶体的制备方法，其特征在于作为使果糖含量按照固体成分重量计算为5％以下的方法，是使用色谱法、酵母处理法的任意一种以上的方法，除去低聚果糖和/或果糖。10.DFAIII晶体，该DFAIII晶体通过上述1～9中任一项的方法制备。本发明是将含有DFAIII的溶液纯化、高效率地工业化生产高纯度的DFAIII晶体，此时的重要特征之一是对于含有DFAIII的溶液，至少一种、优选全部该溶液的pH为5以上。实施本发明时，在DFAIII晶体的制备步骤(其一个例子是如图1所示)中，对含有DFAIII的溶液的至少一种或全部溶液可以实施结晶，使pH为5以上。DFAIII晶体的制备方法可参照图示了其一个例子的图1进行说明。含有DFAIII的溶液的原料是使果糖基转移酶与菊粉或菊粉含有液作用而得到的DFAIII合成液，除此之外也包括DFAIII化学合成液的全部。作为原料之一的菊粉是一个葡萄糖上连接多个果糖而得到的果糖聚合物。以该菊粉作为原料，使其与生成DFAIII的酶、广义上是指果糖基转移酶，优选菊粉果糖转移酶(IFT)作用。生成IFT的微生物如下所示。其并非用于限定的例子如下所示节杆菌(Arthrobactersp.)、产脲节杆菌IFO12140(ArthrobacterureafaciensIFO12140)、球形节杆菌IFO12137(ArthrobacterglobiformisIFO12137)、滋养节杆菌IFO12139(ArthrobacterpascensIFO12139)、芽孢杆菌(Bacillussp.)、马克斯克鲁维氏酵母变种马克斯(Kluyveromycesmarxianusvar.marxianus)、链霉菌(Streptomycessp.)、肠杆菌(Enterobactersp.)。使用来自这些微生物的酶时，除分离纯化的酶之外，也可以使用粗纯化酶、微生物培养物、该微生物的处理物(培养上清、分离菌体、菌体破碎物等)。将DFAIII晶体用于食品用途时，可以使用果糖基转移酶、特别是IFT作为酶，除上述来自微生物的酶之外，以FERMBP-8296国际保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心的节杆菌AHU1753(Arthrobactersp.AHU1753)菌株，其IFT生产能力优异，因此该菌株的酶可优选采用。例如，将来自上述节杆菌AHU1753菌株(FERMBP-8296)的菊粉果糖转移酶(解聚)(IFT)的粗制酶、纯化酶、酶含有物等以酶5000单位/kg菊粉在60℃下搅拌24小时、作用，使之水化、转移，生成含有DFAIII的酶反应溶液。使酶失活，可以得到DFAIII合成液。另外，通过化学合成也可以得到DFAIII化学合成液。上述所得的DFAIII酶合成或化学合成液可以分别单独或者与含有DFAIII的其它溶液等混合，制成DFAIII粗液。接下来进行DFAIII粗液的清洗过滤。清洗过滤是指DFAIII粗液的活性碳处理和固液分离处理。活性碳处理是向DFAIII粗液中少量添加粉末活性碳，可以根据需要进行加热和/或搅拌，使DFAIII以外的杂质吸附于活性碳上的处理。粉末活性碳的平均粒径为15～50μm，优选25～45μm，进一步优选约35μm；最大粒径为200μm以下，优选170μm以下，进一步优选150μm以下，例如可使用147μm以下的粉末活性碳。其添加量相对于固体成分为5％以下，优选0.1～3％，可进一步优选0.5～1.5％，这可以根据DFAIII粗液的组成适当确定。固液分离处理可适当利用Hi-FloSupercell(和光纯药制备)或硅藻土过滤等使用过滤助剂的过滤(例如通过陶瓷过滤机进行的过滤可使用日本ポ-ル(株)制备的PR-12型)、膜滤器(MF)过滤、连续离心法、分子筛法、反渗透膜法、以及根据情况的超滤(UF)膜的至少其中一种。固液分离可以通过常压、加压或减压的至少一种方式实施。具体来说，例如向IFT酶失活液中以固体成分的1％的比例添加太合活性碳S(TaikoActiveCharcoalS)(二村化学工业制备平均粒径约为35μm、147μm以下)，在60℃搅拌10分钟。将该搅拌结束的液体用硅藻土(昭和化学工业制备的ラジォライト700)进行过滤。即，在陶瓷制的筒(日本ポ-ル(株)制备的PR-12型陶瓷管)的外面预涂上述硅藻土，使含有活性碳的反应液加压通过筒外，进行加压过滤，由筒内回收滤液。经过DFAIII含有液(粗液)的清洗过滤处理得到的滤液可按照常规方法浓缩。例如可通过砂糖等的制备中使用中央循环管蒸发器进行浓缩(例如在60～80℃、120mmHg以下)，得到浓缩液。浓缩液可以浓缩至固体成分浓度为60～85％，例如77％左右。本发明中，由上述DFAIII酶合成液或化学合成液得到的DFAIII粗液在经过清洗、过滤，再到浓缩的步骤期间，优选保持pH为5以上。例如可添加氢氧化钠，调节至pH5以上。将上述所得的浓缩液-母液、即粗结晶母液(约60℃)转移到结晶机中，通过冷却或煮糖方式生成DFAIII晶体，得到粗晶。此时，将DFAIII晶体用乳钵等粉碎，将其分散于醇等中，以此作为晶种，将该晶种以适当量、适当的时机添加到母液中，进行育晶。晶种法有フルシ-デイング和シヨツクシ-ディング两种方法。フルシ-デイング方法中，通过使晶种量相对于结晶母液中或粗结晶母液中DFAIII量为1％以上，可以使DFAIII晶体的粒度分布向小的一方偏移。而冷却结晶方法中，上述两种方法的晶种温度越低则DFAIII结晶粒度越小。冷却结晶时的温度梯度最初小、然后增大，这可以使结晶粒度的偏差减小。结晶机优选使用带循环方式和/或搅拌方式的机器。析出晶体后的粗结晶母液通过分离机(3000rpm、1200G)分离成DFAIII粗晶和粗晶糖浆。DFAIII粗晶再用热水溶解，制成DFAIII纯化液，经过清洗、过滤步骤进行浓缩，通过与粗晶同样的方法进行结晶，得到成品晶体。所得晶体无臭、是位于中性区域的无色透明的八面体晶体，熔点163.7℃，旋光度[α]D134.5。如本发明所述，在将各步骤的液体的pH保持并调节至5以上时，在上述流程中分离的粗晶糖浆和/或晶体糖浆根据需要返回到晶体制造体系中，通过这样的循环体系，可实现DFAIII回收率的进一步提高。而如果制成不进行各步骤溶液的pH保持、调节的循环体系，则步骤溶液中单糖(特别是果糖)或蔗糖等DFAIII结晶抑制物质显著增加并蓄积，另外结晶母液的pH显著降低，因此DFA结晶步骤的结晶率降低，最差的情况是陷入不能结晶的状况。本发明发现通过将各步骤溶液的pH保持并调节至5以上，可以抑制作为DFAIII结晶抑制因素的单糖或蔗糖、或者酸性物质(有机酸等)的生成。并且，除了添加碱剂的方法之外，还可通过将含有上述抑制物质的步骤溶液进行色谱分离法或酵母处理来除去上述抑制物质，纯化DFAIII，使其结晶。即，将在DFAIII纯化结晶的全部步骤(图1)中生成的各种生成物作为色谱处理原液(固体成分浓度40～75％)，将其进行色谱处理，可以纯化含有DFAIII的溶液，使其结晶。该通过色谱处理进行的纯化流程的一个例子如图2所示。色谱处理原液(固体成分浓度40～75％)进行色谱处理，分离DFAIII组分。具有与上述再溶解液(DFAIII液)同样的纯化度的富含DFAIII的组分可以作为DFAIII纯化液，通过将其清洗、过滤、浓缩、结晶制备成品晶体(途径A)，或者可以将其直接结晶(途径B)。还可以与富含DFAIII的组分不同，对于DFAIII含量低的非富含DFAIII的组分，将其返回至制备流程(图1所示的由DFAIII含有液至DFAIII成品的全部纯化步骤)的适当位置(途径C)。并且，含有低聚果糖、果糖等单糖、以及酸性物质等、只含有极少量DFAIII的非DFAIII组分可以用作饲料的原料或废弃。色谱分离法中，其分离可采用固定床方式(单一途径方式)、连续方式(模拟移动床方式)、半连续方式(固定床方式与连续方式的组合)。该装置的填充离子交换树脂可使用色谱用的Na型、K型、Ca型等强酸性离子交换树脂。该树脂可使用均匀粒径的苯乙烯二乙烯基苯系树脂等。由离子交换树脂的制造商销售各种色谱用树脂，只要是可应用于糖液的均可使用。色谱处理适合用于晶体母液的DFAIII纯度低时提高其纯度。酵母处理可以使DFAIII含有液与酵母接触，也可以将两者混合，可以根据需要搅拌进行温育，还可以一边通入气体一边进行培养。酵母可以适当采用面包酵母、清酒酵母、啤酒酵母、葡萄酒酵母等各种酵母，也可以充分使用干酵母、压榨酵母等各种市售商品。根据酵母的不同，低聚果糖、蔗糖、单糖类被分解，或者被摄入到菌体内，因此酵母处理主要是用于将低聚果糖、蔗糖和/或单糖类排除到体系外。本发明还可对DFAIII纯度低于60％的DFAIII含有液(结晶母液)进行工业化结晶。本发明中，为了提高DFAIII纯度低于60％的DFAIII含有液的纯化度，将DFAIII含有液通过用酵母处理、清洗过滤处理或色谱处理的至少一种方法处理，可以使DFAIII含有液的DFAIII纯度大幅提高。本发明中的主要术语可参照图1所示的DFAIII晶体的制备流程如下定义。(菊粉)菊粉是指来自植物或来自酶合成物的菊粉以及菊粉含有液，例如是指菊芋、牛蒡、菊苣等的植物萃取液、以及使菊粉合成酶与蔗糖作用而得到的含有合成菊粉的液体、或者将这些液体进行清洗、过滤所得的液体，还指将上述各液体进行干燥固化或者结晶得到的含菊粉的粉末。作为含有DFAIII的溶液的原料之一的菊粉，通过使用果糖聚合度为10～60、多糖换算成固体成分的纯度为70％以上、优选80％以上的菊粉，可以高效地生成DFAIII。使用该DFAIII含有液制备DFAIII晶体，可以高效地制备。(DFAIII酶合成或化学合成液)DFAIII酶合成或化学合成液是指使酶与上述菊粉反应，生成含有DFAIII的溶液，并根据需要使酶失活所得的溶液或DFAIII的化学合成液。(DFAIII粗液)DFAIII粗液是指含有上述DFAIII酶合成或化学合成液本身、将通过结晶步骤(粗结晶、结晶)结晶的母液固液分离所得到的粗晶糖浆、晶体糖浆、色谱分离处理液DFAIII组分的至少一种或多种的液体，也指在DFAIII酶合成或化学合成液中混合粗晶糖浆、晶体糖浆、色谱分离处理液、色谱分离得到的DFAIII组分的至少一种而得到的液体。(粗结晶母液)粗结晶母液是指将上述DFAIII粗液根据需要用活性碳、离子交换树脂、色谱、酵母等进行清洗处理，然后通过过滤等固液分离(即清洗、过滤)得到稀薄液体。将该稀薄液体或上述DFAIII粗液用效用蒸发器(効用缶)等浓缩装置浓缩成适当浓度所得。(DFAIII纯化液)DFAIII纯化液是指含有将粗结晶得到的粗晶用水(热水)溶解成适当浓度所得的溶解液或通过色谱分离得到的DFAIII组分的至少一种的溶液。(结晶母液)结晶母液是指将上述DFAIII纯化液根据需要进行活性碳、离子交换树脂、酵母等的清洗处理，然后通过过滤等固液分离(即清洗、过滤)得到稀薄液体。该稀薄液体、或上述DFAIII纯化液、晶体糖浆、DFAIII组分的至少一种通过效用蒸发器等浓缩装置浓缩成适当浓度。如上所述，含有DFAIII的粗结晶母液、结晶母液是为了进行DFAIII结晶而专门供给冷却方式和/或蒸发方式等结晶机等的含DFAIII的溶液。(DFAIII的纯化、结晶步骤)DFAIII的纯化、结晶步骤是将由DFAIII粗液经过粗结晶至产品结晶的全部的含有DFAIII的溶液进行清洗、过滤、然后浓缩、结晶的步骤。(含有DFAIII的溶液)含有DFAIII的溶液是指在DFAIII晶体制备流程中生成的含有DFAIII的溶液的全部，例如包含DFAIII粗液、粗结晶母液、结晶母液、粗晶糖浆、晶体糖浆、DFAIII纯化液、色谱分离处理液、色谱分离得到的DFAIII组分(DFAIII色谱组分)的至少一种。为了实施本发明，必须使含有DFAIII的溶液的pH为5以上。随着进行DFAIII的结晶，pH降低，结晶率降低，这是本发明人等首次发现的。pH为5以上即可，优选区域是5～8，进一步优选6～8。当然也可以是更高的pH，但是用于进行pH调节的苛性钠、苛性钾等碱的量增多，造成浪费，成本增高，在操作安全性方面也会出现问题。含有DFAIII的溶液必须是上述定义的溶液的至少一种、优选其全部都是pH为5以上。另外，在包含DFAIII纯化、结晶步骤的DFAIII晶体制备步骤中，进一步优选传送管道内的pH也为5以上。如上所述，本发明中，为了提高DFAIII结晶率，必须使含有DFAIII的溶液的pH为5以上，进一步研究的结果首次发现蔗糖和果糖的存在使DFAIII的结晶率降低，这是完全未意想到的新发现，还发现通过使结晶母液的果糖含有换算成固体成分为5％以下、优选1％以下，可以使DFAIII的结晶率提高。并且首次确认了上述糖的抑制也可以通过使pH为5以上来实现。同时满足含有DFAIII的溶液的pH为5以上、且粗结晶母液、结晶母液的果糖换算成固体成分的含量为5％以下的条件，则可以判断DFAIII结晶最大并协同性地提高。发明效果含有DFAIII的溶液的pH为5以上、粗结晶母液、结晶母液的果糖含有5％重量以下，则可以使DFAIII工业化、高效地结晶，进行制备。以下通过实施例进一步详细说明本发明。但本发明并不只受实施例的限定。实施例1使用试验车间，按照图1所示的流程的一部分，通过循环方式进行DFAIII晶体的制备试验。本试验中使用的含有DFAIII的溶液的糖类的值采用高效液相色谱的组成分析值。(1)酶反应步骤一天的处理量是向100kg市售的菊粉(ォラフティ-公司、商品名ラフイテリンHP)的溶解液中添加节杆菌AHU1753(Arthrobactersp.AHU1753)菌株培养酶液(酶效价约50万U)，在60℃下反应12小时，得到DFAIII酶合成液。(2)脱色、清洗步骤。作为脱色处理，向DFAIII酶合成液中添加换算成固体成分为0.5％的活性碳(二村化学、商品名太合活性碳KW50)，在80℃下温育30分钟，然后进行硅藻土过滤。(3)粗结晶步骤将DFAIII酶合成液的脱色液浓缩至固体成分浓度为76％，将其作为粗结晶母液，在50℃向其中添加晶种，用12小时冷却至10℃，生成DFAIII粗晶。该粗晶母液(也称为粗晶糖膏)进行离心，分离成粗晶和粗晶糖浆。(4)纯化结晶步骤将粗晶重新溶解，浓缩至固体成分浓度为75％，将其作为结晶母液，在50℃下向其中添加晶种，用12小时冷却至10℃，生成晶体。将该晶体糖膏进行离心，分离成晶体和晶体糖浆。(5)循环步骤为了提高DFAIII的回收率，将粗晶糖浆的五成与酶反应结束后的液体混合，其余用作饲料用原料。另外，晶体糖浆的五成返回至粗结晶步骤的浓缩罐中，其余的五成返回至结晶步骤的浓缩罐中。(6)结晶率的计算本实施例的粗晶和晶体的结晶率计算按下式进行。结晶率(％)＝(P/Q)×100式中，各符号表示以下内容。PM-NQ(100-N)M/100M(粗)结晶母液的DFAIII纯度N(粗)晶体糖浆的DFAIII纯度(7)制备试验按照上述(1)～(5)的步骤进行制备操作，由开始试验的第4天开始进行粗结晶步骤，由试验的第7天开始结晶步骤。粗结晶步骤的概要(母液组成和结晶率)如图3所示。粗结晶率由试验第10天开始降低，第13天为30％以下，因此粗晶糖浆的返回由五成减至三成。但是，结晶率在这之后继续下降，第17天下降至10％。粗结晶母液的DFAIII纯度在试验期间中大致接近80％，没有大的变动。而杂质组成中，随着试验的进展，低聚果糖减少，可能是其分解产物的果糖增加。另外，粗结晶母液的pH由开始时的5.1缓慢下降，降低至4左右。纯化结晶步骤的概要如图4所示。期间，糖的组成未见大的变化，但结晶率在试验期间逐渐降低。结晶母液的pH在开始时为4.8，缓慢降低至4左右。实施例2由实施例1可知，通过循环方式制备DFAIII，则结晶率缓慢降低。此时结晶母液的pH降低，低聚果糖的分解也加速，由此显示可能与结晶率的降低有关。因此，本实施例的制备试验中，向酶反应结束后的液体、粗结晶母液(浓缩前的液体)以及粗晶再溶解液中添加苛性钠，以防止各步骤溶液的pH的降低。除此之外按照与实施例1同样的方法进行。粗结晶步骤、结晶步骤的概要如图5、6所示。通过添加苛性钠，各结晶母液的pH分别在5.1～5.6、5.4～5.7的范围内变动，低聚果糖的分解也得到抑制。各结晶率也可保持高水准。实施例3DFAIII本身是比其它糖类更耐热、酸的物质。在图1所示的DFAIII工业化制备方法中，制备步骤中的溶液的pH低，则DFAIII以外的杂质分解，产生其它物质，另外，结晶中使用的DFAIII含有液要循环使用，因此不仅pH逐渐降低，DFAIII以外的其它物质也蓄积。实际上，在实施例1的试验制备中，步骤溶液的pH缓慢降低，低聚果糖的比例降低，果糖蓄积。因此，本发明人等为了验证pH(3～7)和热(70、80℃)下实施例1中制备的酶反应结束后的液体的糖组成如何变化，实施了模拟试验(tabletest)。结果，在70℃、pH5以上的条件下，经过24小时后几乎未见所含糖类的组成变化，制成pH4，则经过8小时时，可见四糖类以上的糖类分解和果糖的增加，在pH3下，该倾向进一步增强。另外，在70℃下观察的各pH条件下上述糖组成的变化如果换成80℃下，则进一步加速。80℃、pH5以上的条件下，前12小时均与70℃同样，几乎没有变化，但经过24小时时，可见四糖类以上的糖类分解和果糖的增加倾向。本发明人等为了研究在实施例1中pH降低至4时粗结晶母液中的酸性物质，了解到有机酸(乳酸或乙酸、甲酸等)以30～40mg/100g试样的浓度含有。并且在模拟试验中，果糖水溶液在80℃环境下长时间放置，则有机酸缓慢增加，pH降低。因此，基于实施例1～3的分析值的结果，变动大的低聚果糖、有机酸、果糖、蔗糖、pH对结晶率有怎样的影响，进一步在实施例4～7中进行了模拟试验。实施例4～7中采用的结晶率的计算按下式进行。结晶率(％)＝A/B×100式中的各符号如下表示。A由结晶得到的DFAIII晶体重量(g)B结晶母液中DFAIII含量(g)实施例4(纯度99.9％DFAIII水溶液中添加蔗糖、果糖溶液时的结晶率)向300g制备成71％固体成分浓度的DFAIII溶液中分别添加3g、15g、30g(换算成固体成分的蔗糖(果糖)量为1.0、4.8、9.1％)固体成分浓度为71％的蔗糖溶液或固体成分浓度为71％的果糖溶液，与未添加的一起进行结晶。此时的育晶温度最高为10℃。添加30g蔗糖(果糖)溶液的试验中，在50℃接种晶种时，接种的晶体溶解，因此在45℃下再次进行接种。该试验结果如图7所示。将结晶所使用的母液的固体成分浓度和DFAIII的量统一，增加蔗糖、果糖的添加量，测定生成的晶体量，结果两者均是伴随着添加量的增加，DFAIII的晶体生成量减少。实施例5(混杂于DFAIII含有液中的杂质对晶体生成的影响)(1)将母液的固体成分浓度和DFAIII的量统一，进行试验，结果，伴随着蔗糖、果糖添加量的增加，DFAIII的晶体生成量减少，但该结果也可能是单纯地由于DFAIII纯度降低而引起的，因此，下面对于所混杂的杂质的不同对晶体生成的影响进行试验。向300g制备成固体成分浓度为71％的DFAIII溶液中分别添加30g固体成分浓度为71％的低聚果糖(明治制果制备メイォリゴP四糖类、三糖类、二糖类、果糖含量分别换算成固体成分为65.2％、32.8％、1.2％、0.8％的混合物)溶液、蔗糖溶液、果糖溶液(换算成固体成分为9.1％)，与未添加的同时进行结晶。此时的育晶温度最高为10℃，接种温度为45℃。该试验结果如图8所示。由图8可见，与只存在低聚果糖作为杂质的情况相比，将低聚果糖置换成蔗糖、果糖的情况下，生成的DFAIII晶体的量减少，即使是相同的DFAIII纯度，低聚果糖分解生成蔗糖、果糖，则DFAIII的结晶受到抑制。(2)混杂于DFAIII溶液中的杂质组成对晶体生成的影响接着，对单独存在蔗糖、果糖的情况和混杂两者时的影响进行调查。向300g制备成固体成分浓度为71％的DFAIII溶液中分别添加30g固体成分浓度为71％的蔗糖溶液、果糖溶液(换算成固体成分为9.1％)，以及同时添加15g蔗糖溶液和15g果糖溶液(蔗糖和果糖的合计换算成固体成分为9.1％)，与未添加的同时进行结晶。此时的育晶温度最高为10℃，接种温度为45℃。其试验结果如图9所示。由图9可知，即使DFAIII纯度相同，与分别添加一半的蔗糖和果相比，单独添加时的抑制程度高。因此，DFAIII结晶是受到作为杂质存在的蔗糖、果糖内含量多的一方的影响。但是，实际制备现场中生成的蔗糖的量不会高过果糖的量，因此可以认为结晶生成量受果糖的量的影响。由以上可以认为，与只存在低聚果糖作为杂质的情形相比，存在蔗糖、果糖时生成的DFAIII晶体的量少，其程度受存在的蔗糖、果糖内含量较多的一方的影响。但是，即使是杂质的纯度相同，向DFAIII溶液中以固体物的形式向添加蔗糖、果糖时，晶体的生成量比未添加的多，因此即使存在蔗糖、果糖，如果提高母液的浓度，也可以象两者均不存在时一样地回收晶体。(3)混杂于DFAIII溶液中的杂质组成对晶体生成的影响对在步骤溶液(工程汁)分析中已确认其存在的有机酸的影响进行了调查。存在于步骤溶液中的经确认的有机酸是乳酸、乙酸、甲酸、其它(多种未知峰)，其中对在果糖热分解中生成的乙酸、甲酸进行了试验。步骤溶液的分析结果显示，在DFAIII粗液经清洗、过滤后的液体浓缩液中检测出的各有机酸含量为30～40mg/100g样品左右，因此有机酸盐的添加量分别为0～100mg/100gDFAIII溶液。向300g制备成固体成分浓度为71％的DFAIII溶液中分别添加乙酸钠和甲酸钠的溶液，含量分别为10mg+10mg、50mg+50mg、100mg+100mg/100gDFAIII溶液，用纯水调节固体成分浓度，使包括未添加的液体在内其浓度均相同(最终固体成分浓度为70.3％)，然后进行结晶。此时的育晶温度最高为10℃，接种温度为50℃。该试验结果如图10所示。由图10可见，晶体生成量多少有些变动，但是有机酸盐并未抑制DFAIII的结晶。此时，未添加或者分别添加10mg/100g乙酸钠和甲酸钠、固体成分浓度为70.3％，这与以往的试验相比浓度稍微稀薄，刚接种后晶体生成缓慢，而分别添加50mg/100g的以及添加100mg/100g的试验中，可见刚接种后晶体迅速生成的现象。在考察该差异是何原因时，可以认为试验中所使用的乙酸钠和甲酸钠混合液的pH为8.6，较高，因此后者中添加后母液的pH为7左右，这可能是产生差异的原因。因此，制备步骤中生成有机酸、步骤溶液的pH改变，这可能会对DFAIII晶体生成产生一些影响。实施例6(pH对DFAIII结晶的影响)(1)为了确认结晶中使用的母液的pH对DFAIII晶体生成的影响，在存在有机酸盐(乙酸钠和甲酸钠)的状态下改变pH，调查此时其晶体生成量的变化。向300g制备为固体成分浓度为73％的DFAIII溶液中添加乙酸钠和甲酸钠的溶液，制成100mg+100mg/100gDFAIII溶液，用5N盐酸分别将pH调节至7、5、4、3，然后用纯水将固体成分浓度调节至71％，进行结晶。此时的育晶温度最高为25℃，接种温度为50℃。该试验结果如图11所示。由图11可得到以下结果生成的晶体量受pH的影响，pH7时晶体生成量最多，pH4时为最小值，pH3和pH5是相同程度的晶体生成量。(2)由于该现象只与pH相关，因此为了验证即使不存在有机酸盐也会发生上述现象，将DFAIII溶液用盐酸和苛性钠调节pH，观察生成的晶体量是否变化。向300g将固体成分浓度调节至71.5％的DFAIII溶液用1N盐酸和1N苛性钠调节成pH7、5、4、3，然后加入纯水，将固体成分浓度调节至71％，进行结晶。此时的育晶温度最高为25℃，接种温度为50℃。该试验结果如图12所示。试验结果与有机酸盐存在时稍有差异，在pH5下晶体生成量少，但在pH7下晶体生成量最多，pH4下有最小值，这是相同的。为了进一步验证该结果并不根据无机盐的浓度不同而变化，在1％食盐存在下同样调节pH进行结晶，结果，与在有机酸盐的存在下进行pH调节、结晶时有相同的倾向。由此可认为盐类的存在缓和了pH5下的结晶抑制作用。(3)采用实际步骤的粗晶母液，验证上述结论。将在采集的粗晶母液(DFAIII固体成分纯度为75.9％)中析出的晶体完全溶解，然后浓缩至固体成分浓度为76％左右，使用5N盐酸或5N苛性钠，将pH调节至7、5、4、3，然后加入纯水，调节至固体成分浓度为75(或73)％，进行结晶。此时的育晶温度如下固体成分浓度为75％时最高为25℃，固体成分浓度为73％时最高为10℃，接种温度为50℃(固体成分浓度75％)或45℃(固体成分浓度73％)。该试验结果如图13所示。可知各固体成分浓度中，pH4下DFAIII结晶率最低。实施例7((粗)结晶母液pH和过饱和度对DFAIII的影响)为了确定DFAIII结晶母液相对于作为DFAIII结晶抑制因素的pH的最佳浓缩度，进行以下研究。如图14所示，首先调查各温度下DFAIII的溶解度(饱和固体成分浓度％)，由其实测值重新计算下式所示的溶解度曲线近似式(相关系数R2＝0.999)。溶解度(饱和固体成分浓度％)Z＝-0.00058X2+0.39X+48.8X温度(℃)如下式定义纯度为P％的DFAIII结晶母液相对于冷却结晶终点温度X℃下的DFAIII溶解度的过饱和度S，以此作为表示DFAIII结晶母液的结晶所需的浓缩度的数值。过饱和度S＝[Y×P/(100-Y)]/[Z/(100-Z)×100]YDFAIII结晶母液的固体成分浓度(％)PDFAIII结晶母液的DFAIII固体成分纯度(％)Z溶解度(X冷却结晶终点温度℃)关于这里定义的过饱和度S对DFAIII结晶的影响，使用实际的DFAIII步骤溶液，改变作为结晶化抑制因素的结晶母液的pH，进行模拟试验。pH的调节是向DFAIII步骤溶液中添加5NHCl或5NNaOH进行。将它们浓缩至各种浓度，然后将所得各浓缩液作为结晶母液在50℃下进行接种，冷却至10℃进行育晶，过饱和度S按照上式，以冷却结晶终点温度为10℃计算。结晶母液pH和过饱和度S的关系结果如表1所示。结晶母pH5～7时、过饱和度S为4.4以上的条件下，各纯度下的含有DFAIII结晶母液中，其糖膏的流动性显著降低，难以进行分蜜操作。而在过饱和度S为4.1以下的条件下，糖膏具有适度的流动性，可无阻碍地实施分蜜操作。由此可知，结晶母液pH为5以上的DFAIII工业化晶体制备条件是以结晶化终点温度为基准的过饱和度S在4.1以下。过饱和度S低于1.3则结晶率为20％以下，因此从结晶率的角度考虑，优选过饱和度为1.3以上、4.1以下，进一步优选1.5以上、4.1以下，更进一步优选2.3以上、4.1以下。(表1)各种DFAIII含有液的pH和过饱和度S对结晶率的影响DFAIII含有液A的冷却结晶率(％)DFAIII含有液B的冷却结晶率(％)A液的固体成分组成99.5％DFAIII、0.1％灰分、0.4％低聚果糖B液的固体成分组成79.7％DFAIII、0.3％灰分、18.3％低聚果糖、0.2％蔗糖、1.0％果糖表中×表示由于糖膏的流动性低，因而分蜜操作困难。保藏号FERMBP-8296保藏标记节杆菌AHU1753(Arthrobactersp.AHU1753)保藏机构名称独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心保藏机构的地址邮编305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6保藏日期2003年2月18日权利要求1.二果糖二酐III(DFAIII)晶体的制备方法，其特征在于含有二果糖二酐III(DFAIII)的溶液的pH为5以上。2.权利要求1的DFAIII晶体的制备方法，其特征在于通过碱剂添加法、色谱法、阴离子交换树脂法的至少一种方法调节并保持含有DFAIII的溶液的pH。3.权利要求1和2的DFAIII晶体的制备方法，其特征在于含有DFAIII的溶液是使果糖基转移酶与菊粉作用，将所得液体进行清洗、过滤而得到的溶液。4.权利要求3的DFAIII晶体的制备方法，其特征在于菊粉的果糖聚合度为10～60，多糖的固体成分纯度为70％以上。5.权利要求1～4中任一项的DFAIII晶体的制备方法，其特征在于在由DFAIII粗液经过粗结晶至产品结晶的将含有DFAIII的溶液清洗、过滤，然后浓缩、结晶的步骤(纯化、结晶步骤)中，至少一种含有DFAIII的溶液的pH为5以上。6.权利要求5的DFAIII晶体的制备方法，其特征在于在循环体系中进行纯化、结晶步骤。7.权利要求1～6中任一项的DFAIII晶体的制备方法，其特征在于相对于结晶母液或粗结晶母液在冷却结晶的终点温度下的溶解度，过饱和度为1.3～4.1。8.DFAIII晶体的制备方法，其特征在于含有DFAIII的结晶母液或粗结晶母液中的果糖含量按照固体成分重量计算为5％以下。9.权利要求8的DFAIII晶体的制备方法，其特征在于作为使果糖含量按照固体成分重量计算为5％以下的方法，是使用色谱法、酵母处理法的任意一种以上的方法，除去低聚果糖和/或果糖。10.DFAIII晶体，该DFAIII晶体通过权利要求1～9中任一项的方法制备。全文摘要本发明涉及二果糖二酐III(difructosedianhydrideIIIDFAIII)晶体的制备方法，其特征在于含有DFAIII，即两个分子果糖通过1，2’；2，3’结合的难消化性二糖类(二－D－呋喃果糖－1，2’；2，3’二酐)的溶液的pH为5以上、优选5～8、进一步优选6～8。根据本发明的方法，例如即使在循环体系中进行结晶，也不会使结晶率降低，可工业化生产DFAIII，此时，如果(粗)结晶母液的果糖含量合计换算成固体成分为5％以下、且果糖含量为5％以下，则效果更高。文档编号C07H3/00GK101090906SQ200480044728公开日2007年12月19日申请日期2004年12月28日优先权日2004年12月28日发明者名仓泰三,本庄克也,菊地裕人,高木纪充,有塚勉申请人:日本甜菜制糖株式会社