专利名称：：用于改变蛋白生产速率的方法用于改变蛋白生产速率的方法发明领域本发明涉及用于改变蛋白的细胞分泌速率的方法。
背景技术：
：蛋白(例如抗体)的大规模生产，典型地依赖于来自培养的生产细胞系的蛋白的分泌。可容易地从周围细胞培养基中回收并纯化培养的细胞生产的分泌蛋白。蛋白细胞分泌速率是影响生物反应器或其他系统分泌的蛋白生产和纯化的重要参数。一般而言，当细胞分泌速率相对高时，就能获得更高的纯化蛋白收率。反之，如果细胞分泌速率太低，则蛋白纯化就无法进行。一种解决低分泌细胞难题的方法是从低分泌细胞群中分离出高分泌亚克隆的细胞。典型地，这需要数轮高劳动强度的如下过程有限连续稀释、对高分泌细胞系得筛选和选择。或者，希望所产生的生产目的蛋白的全新细胞系是高分泌系。之前产生高分泌细胞系的每种方法都有局限性。例如，从低分泌细胞群中通过亚克隆鉴定高分泌细胞系受限于细胞群中高分泌细胞相对稀少，以及鉴定任何一种高分泌细胞所需要的大量时间和劳动。此外，生产目的抗体或蛋白的新细胞系的产生受限于新细胞系不是高分泌的可能性，以及重建抗体生产细胞和鉴定高分泌细胞所需的高劳动强度。在某些情况下，由于在细胞内质网(ER)中蛋白错误折叠导致分泌速率减少，仅可获得低分泌细胞系。因此，需要改变蛋白细胞分泌速率的有效方法。附图简述图1显示的是高速率分泌mAb的细胞中UPR基因的转录本水平。图2显示的是在静止生长期细胞中UPR基因的转录本水平。图3显示的是对亲本骨髓瘤细胞系中UPR基因转录本水平的比较。图4显示的是相对于Sp2/0亲本骨髓瘤细胞系，高分泌细胞系中UPR基因的转录本水平。图5显示的是相对于FO亲本骨髓瘤细胞系，高分泌细胞系中UPR基因的转录本水平。图6显示的是相对于Ag-653亲本骨髓瘤细胞系，高分泌细胞系中UPR基因的转录本水平。图7显示的是作为UPR基因转录本水平改变的函数的抗体分泌速率的改变。图8显示的是下述骨髓瘤细胞中增加的抗体分泌速率，所述细胞是用编码CHOP-10特异性siRNA的核酸稳定转染的。发明概述本发明的一方面是一种用于改变蛋白细胞分泌速率的方法，包括调节细胞中至少一种UPR途径组分(component)的活性；和培养所述细胞的步骤。本发明的另一方面是一种具有改变的细胞分泌速率的浆细胞，这是通过改变蛋白细胞分泌速率所产生的，所述改变速率的方法包括调节细胞中至少一种未折叠蛋白应答(UPR)途经组分的活性；和培养所述细胞的步骤。本发明的另一方面是一种转基因动物，其中包含具有改变的细胞分泌速率的浆细胞，所述浆细胞是通过调节细胞中至少一种UPR途径组分的活性并培养所述细胞所产生的。本发明的另一方面是一种分离的核酸，具有SEQIDNO:15或SEQIDNO:16所示的序列。发明详述在本说明书中引用的所有出版物，包括但不限于专利和专利申请，在此通过引用并入全文，这与在本文中将其全文列出一样。在此使用的术语"抗体"在广义上意指并包括免疫球蛋白或抗体分子，包括多克隆抗体和单克隆抗体及抗体片段或变体，所述单克隆抗体包括鼠、人、人源化和嵌合单克隆抗体。抗体是由浆细胞组成型表达并分泌的分泌蛋白。通过使用标准方法(例如杂交瘤传代)永生化的浆细胞，或通过将抗体重链和/或轻链基因转染入永生的B细胞(例如骨髓瘤细胞)或其他类型细胞(例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、植物细胞和昆虫细胞)中也能产生抗体。抗体片段或变体包括模拟抗体、Fab片段、F(ab')2片段、Fc片段、重链片段、轻链片段和含有至少一条抗体肽链一部分的分子。上述部分可相应于抗体可变区、铰链区或恒定区肽链。在此使用的术语"模拟抗体"指具有通式(I)的蛋白CVa(n)-Pep(n)-Flex(n)画V2(n)-pHinge(n)画CH2(n)-CH3(n))(m)(I)这里VI是免疫球蛋白可变区N-末端的至少一部分，Pep是至少一种与表位结合的生物活性肽，Flex是通过使模拟抗体具有可选的取向和结合特性以提供结构柔性的多肽，V2是免疫球蛋白可变区C-末端的至少一部分，pHinge是免疫球蛋白铰链区的至少一部分，CH2是免疫球蛋白CH2恒定区的至少一部分以及CH3是免疫球蛋白CH3恒定区的至少一部分，这里n和m可以是l-10的整数。取决于构建物中存在的重链恒定区氨基酸序列，模拟抗体可模拟不同类型免疫球蛋白分子的特性和功能，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgD和IgE。在此使用的术语"单克隆抗体"(mAb)指从一群基本上均一的抗体中所获得的抗体(或抗体片段)，单克隆抗体是高特异性的，典型地，针对单个抗原决定簇。修饰语"单克隆，，指抗体的基本上均一的特性，且无需通过任何特殊方法来生产抗体。例如，可通过Kohler等.，Nature256:495(1975)的杂交瘤方法制备鼠单克隆抗体。可通过US4,816,567中描述的方法制备下述嵌合mAb，其中含有来自供体抗体(典型地，鼠)的轻链和重链可变区以及与之结合的来自受体抗体(典型地，另一种哺乳动物，例如人)的轻链和重链恒定区的。具有来自非人供体免疫球蛋白(典型地，鼠)的CDRs和来自一种或多种人免疫球蛋白的该分子的其他来自免疫球蛋白的部分，并且可选地，具有改变的构架支持残基以保持结合亲和力的人源化mAb，可通过Queen等.，Proc.NatlAcadSci(USA)，86:10029-10032，(1989)和Hodgso等.，Bio/Technology，9:421，(1991)中所描述的技术而获得。可通过例如Lonberg等.，Nature368:856-859，(1994);Fishwild等.，NatureBiotechnology14:845-851，(1996)和Mendez等，NatureGenetics15:146-156,(l的7)中提及的技术，从人免疫球蛋白转基因小鼠来制备不存在任何非人序列的全人mAb。也可通过例如Knappik等"J.Mol.Biol.296:57-86，(2000)和Krebs等.,J.Immunol.Meth.254:67-84，(2001)中提及的技术，从噬菌体展示文库来制备并优化人mAb。在此使用的术语"细胞分泌速率"指细胞分泌特定蛋白的速率。这样的速率可被描述为针对每次时间改变，培养基中存在的蛋白量的改变；或可归一化为细胞数量并用单位"pg/细胞/天，，表示。在此使用的术语"短干扰RNA"指调节靶基因转录本切割的核酸序列。短干扰RNAs(siRNAs)可以是双链的或短发夹型。双链siRNAs可由两条单独的、反向平行的、退火RNA链或既包含RNA又包含DNA的退火核酸链(如5'-TTTTUUUU-3'退火至5'-TTTTUUUU-3'或5'-TTTT-3'退火至5'-UUUU-3，)组成。短发夹型siRNAs可由能形成茎环结构或其他能有效作为siRNA的二级结构的单RNA链或单RNA:DNA杂交链组成。本领域技术人员应认识到，siRNAs可包含其他修饰(例如核苷类似物)、主链修饰和仍容许修饰的siRNA核酸调节靶基因转录物切割的其他修饰。在此使用的术语"小分子"指分子量小于24,000g/mol的化合物，其并不仅包含氨基酸残基或核酸残基。在此使用的术语"转录控制序列"指基因或核酸序列转录必需的核酸序列，其增加或减少基因的转录。在此和权利要求中使用的术语"UPR途径组分"指肽链或核酸序列，例如转录调控序列，其调节通过UPR途径的信号或活化UPR。本发明提供了用于通过细胞改变蛋白细胞分泌速率的方法。本发明方法的示例性用途是增加用于治疗、诊断或研究目的的蛋白(例如抗体)的分泌速率。细胞系中低蛋白分泌速率可能是由细胞内质网中错误折叠蛋白的累积，通过UPR减緩或停止了分泌过程引起的。内质网膜中应激敏感蛋白检测到过量的未折叠蛋白，触发了UPR。其后，通过复合物信号传导级联，伴侣蛋白Bip和转录因子XBP-1及CHOP被上调。伴侣蛋白结合未折叠蛋白，并参与校正折叠。转录因子CHOP通常被认为是细胞生长、分化和生存的负调节物。已观察到CHOP的上调导致细胞循环停止，因此给予细胞时间以对付造成UPR诱导的不利条件。转录因子XBP-1是产生浆细胞(分泌大量免疫球蛋白的已分化B淋巴细胞)所必需的。浆细胞显示了改变的UPR，其中，在免疫球蛋白合成前出现某些UPR基因的上调节，。这些包括XBP-1、Bip、Grp94和p50ATF6a，且它们的上调是浆细胞分化和抗体正常分泌所必须的(Gass，J.N"等"J.Biol.Chem.227,49047-49054(2002))。与此相反，在该转换过程中CHOP并不被上调，这暗示了不同类型的UPR。这些分子的上调可具有有益或有害作用，引起细胞蛋白分泌速率增加或细胞凋亡。参见Kaufman,R.J.，GenesDev.13，1211-1233(1999)和Cudna，R.E.,等.，Biotechnol.Bioeng.81，56-65(2003)。在本发明的一种方法中，通过调节细胞中至少一种UPR途径组分的活性并培养所述细胞来改变蛋白细胞分泌速率。本发明的方法提供了增加或减少例如抗体的蛋白细胞分泌速率的方法。在本发明的一个实施方案中，通过用编码UPR途径组分的核酸稳定转染细胞来增加蛋白细胞分泌速率。UPR途径组分可以是多肽或核酸序列，例如转录控制序列，其调节通过UPR途径的信号或活化UPR。UPR途径组分的例子包括BiP、XBP和CHOP及具有类似活性的变体。UPR途径组分的其他例子包括IRE1、PERK、ATF4、ATF6、elF2a、GRP78、GRP94、钩网蛋白、伴倡蛋白和具有类似活性的变体(参见如Cudna和Dickson，Biotechnol.Bioeng.，81,56-65(2002))。转录控制序列的一个例子是顺式作用UPR元件(UPRE)和ERSE，它们已在不同的UPR基因启动子中得到鉴定。本领域普通技术人员应可知道其他UPR途径组分和转录控制序列。UPR途径元件可具有SEQIDNO:2(鼠BiP)、SEQIDNO:4(鼠XBP-1，剪接型)、SEQIDNO:6(鼠XBP-1，未剪接型)、SEQIDNO:8(鼠CHOP10)、SEQIDNO:10(人BiP)、SEQIDNO:12(人XBP國l)或SEQIDNO:14(人CHOP-10)所示的氨基酸序列。UPR途径组分核酸可具有SEQIDNO:1(鼠BiPmRNA)、SEQIDNO:3(鼠XBP國1，剪接型mRNA)、SEQIDNO:5(鼠XBP-1，未剪接型mRNA)、SEQIDNO:7(鼠CHOP10mRNA)、SEQIDNO:9(人BiPmRNA)、SEQIDNO:11(人XBP-1mRNA)、SEQIDNO:13(人CHOP画IOmRNA)所示的序列。具有类似于亲本分子活性的这些序列的变体也可用于本发明的方法中。例如，与亲本分子具有至少80%同一性的变体分子应具有类似的活性。使用BLASTP算法(关掉过滤器，所有其他设置默认值未改变)可确定两种蛋白之间的同一性百分数。多肽不同的同种型(isoform)、多肽的显性失活变型(version)或多肽的共价修饰形式是亲本分子变体的某些例子。在本发明另一个实施方案中，通过减少UPR途径组分的表达可降低蛋白细胞分泌速率。UPR途径元件(例如BiP或CHOP)的基因表达可被具有短干扰RNA(siRNA)分子或反义分子的细胞减少。在本发明另一个实施方案中，通过给予小分子对UPR途径组分加以调节，来增加蛋白细胞分泌速率。小分子的例子是毒胡萝卜素，一种UPR诱导剂(Litton，J.，J.Biol.Chem.26,17067-17071(1991))。此类小分子的其他例子包括衣霉素和脂多糖。在本发明另一个实施方案中，通过使细胞处于静止生长期来增加蛋白的细胞分泌速率。可通过限制营养物质的可获得性、使细胞废物累积或改变细胞培养基pH，来使细胞处于静止生长期。本领域技术人员还将知道用于使细胞处于静止生长期的其他方法。在本发明方法中，示例性的细胞是浆细胞，即分泌抗体的已分化B-细胞。浆细胞可分离自鼠、人或其他动物来源。典型地，通过标准技术(例如使用Epstein-Barr病毒的病毒感染)或其他方法(例如放射或化学诱变)能使浆细胞永生化。永生化的浆细胞也可以具癌性的，且可通过注射矿物油或其他化合物到动物的腹膜腔中而获得。在本发明的一个实施方案中，所述永生化的融合配偶体(partner)是本领域已知的"骨髓瘤细胞，，。骨髓瘤通常由脾细胞与获得自患多发性骨髓瘤(一种骨髓癌)的生物体的永生化融合配偶体的融合形成。所述生物体可以是鸟类、鱼类、爬行动物、哺乳动物和其他动物类。骨髓瘤细胞系的例子包括SP2/0(美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Manasas，VA，CRL隱1581)、NSO(欧洲动物细胞保藏中心(ECACC)，Salisbury,Wiltshire,UK,ECACCNo.85110503)、FO(ATCCCRL-1646)和Ag653(ATCCCRL-1580)细胞系，它们获得自小鼠。获得自人的骨髓瘤细胞系的例子是U266细胞系(ATTCCRL-TIB-196)。本领域技术人员应当知道其他骨髓瘤细胞系。在本发明的一个实施方案中，骨髓瘤细胞是用DNA分子稳定转染9的。可用本领域技术人员公知的转染、筛选和选择方法来产生稳定转染的骨髓瘤细胞。用于稳定转染细胞的DNA序列可以随机整合入骨髓瘤细胞的DNA中或以位点特异性方式整合。这样的DNA序列可编码UPR途径组分。此外，稳定转染的核酸序列可使UPR组分(例如UPR基因或转录调控序列)被插入失活或缺失。在本发明另一个实施方案中，通过用编码下述siRNA的核酸序列稳定转染细胞来增加蛋白的细胞分泌速率，所述siRNA靶向编码UPR途径组分的核酸序列的转录本。这样的siRNAs可靶向编码CHOP蛋白的核酸序列的转录本。示例性的CHOP蛋白是具有SEQIDNO:8或SEQIDNO:14所示的氨基酸序列的那些。用编码下述siRNA的核酸序列进行稳定转染在本发明的方法中是有用的，所述siRNA靶向编码鼠CHOP-10的核酸序列的转录本。示例性的鼠CHOP-10基因转录本特异性siRNA包含SEQIDNO:15或SEQIDNO:16所示的核苷酸序列。本领域技术人员应当知道编码靶向UPR基因转录物的siRNAs的其他核酸。在本发明方法中有用的其他细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、昆虫细胞和植物细胞。在本发明另一个实施方案中，可产生转基因动物，相对于非转基因动物，所述转基因动物能组成型或诱导型地以提高的水平表达UPR蛋白。用于产生转基因动物的技术是本领域已知的。在本发明的方法中，细胞是培养的。细胞可被悬浮培养或贴壁培养。可在多种容器中培养细胞，所述容器包括例如生物反应器、细胞袋(cellbags)、培养平板、烧瓶和本领域普通技术人员公知的其他容器。可在任何合适的培养基中培养细胞，所述培养基包括化学上成分明确的培养基配方。适合于细胞培养的环境条件，例如温度和大气成分对于本领域技术人员也是公知的。本领域技术人员亦公知用于细胞培养的方法。本发明还提供了具有改变的细胞分泌速率的浆细胞，这是通过本发明方法产生的。可通过用编码短干扰RNA的、稳定转染的核酸去调节UPR途径组分活性来产生浆细胞。siRNA可靶向编码UPR途径组分(例如CHOP蛋白)的核酸序列的转录本。所提供的浆细胞可以是例如SP2/0衍生的细胞，如C2-8或C2-18细胞。这样的浆细胞可分泌要被纯化的抗体或其他多肽。现在将参考下列特殊且非限制性的实施例来描述本发明。实施例1高分泌细胞系中UPR基因的转录水平与以^f氐速率分泌相同mAb的细胞系相比，对以高速率分泌mAb的细胞系的UPR基因转录本水平进行了分析。所检查的细胞系包括高分泌细胞系C505B、C505C和C505D。所检查的低分泌细胞系是C505A细胞系和SP2/0，C505A、B、C和D的亲本骨髓瘤细胞系。所有的这些细胞系都用编码特异于av-整联蛋白的人IgGlmAb的重链和轻链的DNA转染过。通过顺序进行的针对mAb高速率分泌的亚克隆、筛选和选择，鉴定出C505B、C505C和C505D细胞系。通过下述方法来测定抗体分泌速率测量细胞培养基中24小时内mAb的分泌量，并对活细胞计数以产生单位为"pg/活细胞/天，，的细胞分泌速率。C505a细系以5-7pg/活细胞/天的低速率分泌抗体，等同于约5-10ng/mL/7天的浓度。C505B细胞系以约15pg/活细胞/天的速率产生抗体，C505C以约13pg/活细胞/天的速率产生抗体，以及C505D以约15pg/活细胞/天的速率产生抗体。所有的mAb分泌细胞系和亲本骨髓瘤细胞系都在5%C02气氛中，在含5y。FBS、2mM谷氨酰胺和2mM丙酮酸的IMDM培养基中于37"C进行悬浮培养。含0.5mg/L霉酚酸、2.5mg/L次黄噤呤和50mg/L黄噤呤的1XMHX选择培养基也存在于培养基中。通过定量PCR(Q-PCR)，来评估高表达细胞系和低表达细胞系之间UPR基因转录本水平的差异。培养细胞进入指数生长期，用RNEasyTM系统(QiagenInc.,Valencia,CA)从5xl06个细胞分离总RNA。使用标准的两步反应进行Q-PCR。使用SuperscriptII逆转录酶(InvitrogenInc.，Carlsbad,CA)和随机六聚体引物以及厂商指出的反应条件进行cDNA合成步骤。接着，按照厂商说明，使用ABIPRISMTM7000HT或7900HT装置(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)来进4亍TaqmanTMQ國PCR(AppliedBiosystems，FosterCity,CA)。每次Q-PCR反应使用5,000pgRNA。使用PrimerExpressTM软件(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)，来设计用于Q画PCR的BiP、CHOP和XBP特异性引物和探针组合。针对甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)持家基因的转录本水平，对cDNA水平进行归一化，接着归一化为针对适当亲本细胞系的cDNA/GAPDH转录本水平值。使用ABIPRISM7000HT或7900HT装置和相关软件，进行PCR早期指数阶段的数据收集和转录物定量。结果如图l所示，其显示在高分泌细胞系中BiP和XBP-lUPR基因转录本是水平较低分泌细胞系的约3-4倍。CHOP水平的差异较不显著。实施例2静止生长期细胞中UPR基因的转录本水平和抗体分泌速率相对于指数生长期的细胞，对静止生长期细胞的UPR基因转录本水平和mAb分泌速率加以分析。C168J细胞系是从SP2/0亲本骨髄瘤细胞系获得的转染瘤，其以25-30pg/细胞/天的速率分泌IgGlmAb。C505A如上述实施例1所述。通过在T-75或T-150烧瓶中接种5xl06个细胞，并如实施例1所述进行培养，来评估C505A、C168J和SP2/0细胞系的IgGlmAb分泌速率。3天后细胞处于指数生长期，第6天时细胞处于静止生长期。在两个生长期中，对细胞测定总细胞数和活细胞数。通过标准的酶联免疫吸附测定(ELISA)，针对人IgG对两个生长期中细胞培养物加以分析。如上述实施例1所述，对指数生长期和静止生长期细胞进行BiP、CHOP和XBP-1特异性Q-PCR。表1所示结果显示，C505A和C168j细胞系具有增加的IgGlmAb分泌速率(表1)。表l:IgGl分泌速率(pg/细胞/天)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>此外，图2所示结果显示，相对于指数期生长，静止期生长时，C505A、C168j和Sp2/0中的UPR基因转录本水平增加。实施例3亲本骨髓瘤细胞系UPR基因的转录本水平检查SP2/0、NSO、FO和Ag653亲本骨髓瘤细胞系中UPR基因的转录本水平，以确定是否更高分泌的细胞系含有更高水平的UPR基因。如上述实施例所述，SP2/0、NSO、FO和Ag653细胞被培养至指数生长期，从5乂106细胞中分离总RNA。也如实施例1所述进行Q-PCR和分析。图3所示结果显示，在所有被检查的细胞中，BiP和CHOP转录本水平相当。但是，相对于被检查的其他细胞类型，FO和NSO细胞中XBP-1转录本的水平提高。实施例4高分泌细胞系和亲本骨髓瘤细胞系中UPR基因的转录本水平较之它们的亲本细胞系，对高速率分泌mAb的细胞系的UPR基因转录物水平进行了分析。图4-6中显示的细胞系被培养至指数生长期，如上述实施例1所述从5xl06细胞中分离总RNA。也如实施例1所述进行Q-PCR和分析。图4-6所示结果显示，相对于它们的SP2/0、FO和Ag653亲本骨髓瘤细胞系，高速率分泌mAb的细胞系具有更高的UPR基因转录本水平。这些结果表明，不考虑用于产生高分泌细胞的亲本骨髓瘤细胞系的种类，增加的UPR基因表达与增加的抗体分泌速率偶联。实施例5UPR诱导后UPR蛋白表达在用药物毒胡萝卜素进行UPR诱导后，相对于低分泌细胞和亲本骨髓瘤细胞系，分析高分泌细胞中的UPR蛋白表达。毒胡萝卜素是ATP酶抑制剂，其能阻断肌内质网Ca"ATP酶(SERCA)泵，并引起内质网腔钙耗竭。用100nM毒胡萝卜素处理细胞，并准备XBP-1和CHOP特异性蛋白质印迹杂交。在规定时间点，于放射免疫沉淀反应(RIPA)裂解緩冲液(1XPBS、1%N-P40、0.5%去氧胆酸钠、0.1%十二烷基硫酸钠、lmMPMSF和来自Roche的蛋白酶抑制剂(产品目录号1836153))中裂解细胞，使用标准的bicinchoninicacid(BCA)蛋白测定法(Sigma产品目录号B9643)对澄清的裂解物中的蛋白浓度加以定量。就蛋白质印迹杂交而言，每种裂解物取20吗，跑标准的SDS-PAGE凝胶，将其转印到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，并用特异于XBP-1或CHOP的抗体(SantaCruzBiotechnologyInc.，SantaCruz,CA沐探测。结果(未示出)表明相对于低分泌细胞和亲本骨髓瘤细胞系，高分泌细胞中的UPR蛋白以高水平表达。XBP-l-特异性蛋白质印迹杂交显示，在毒胡萝卜素处理过的高分泌ClMj细胞中，XBP-1蛋白表达被强烈诱导。在对UPR进行药物诱导后7小时，该XBP-1表达诱导最显著，而早在处理2小时后就可看见诱导。CHOP-特异性蛋白质印迹显示，在毒胡萝卜素处理过的高分泌C168j细胞中，CHOP蛋白表达被强烈诱导，CHOP于2小时首先出现，在4-7小时达到最大表达，在22小时才大量减少。实施例6增加UPR蛋白表达水平用BiP和XBP-1表达载体瞬时转染细胞，力图提高这些UPR蛋白的细胞表达水平。HEK293T/17(ATCCCRL-11268)细胞作为贴壁培养物在5。/。C02气氛中于37lC下生长，并在含5。/。FBS、2mM谷氨酰胺和2mM丙酮酸的Iscove氏改良的Dubelcco氏最小必需培养基(IMDM)中培养。使用标准方法，将编码XBP-1同种型1(NCBI登记号AF027963)、XBP-1同种型2(NCBI登记号AF443192)或BiP的cDNAs亚克隆入用于瞬时转染试验的载体中。载体在CMV启动子控制下表达zsGreenl蛋白，并具有多克隆位点，用于插入受CMV启动子控制的额外编码区。卡那霉素抗性基因被用来选择细菌。HEK293T/17细胞保持为未转染，或是被空白载体单独、XBP-1同种型1表达载体、XBP-1同种型2表达载体或BiP表达载体瞬时转染的。使用LipofectamineTM2000试剂(InvitrogenInc.，Carlsbad,CA)，根据厂商指导进行转染。转染后48小时，在RIPA裂解緩冲液中裂解细胞，并将等同于等量细胞的澄清裂解物上样到SDS-PAGE凝胶上。接着如上述实施例5所述制备蛋白质印迹杂交并探测。然后剥下印迹杂交膜，用肌动蛋白特异性抗体进行再探测，以确认加在每一道内的等量蛋白。结果(未示出)显示，在用编码这些XBP-1同种型的表达载体瞬14时转染的细胞中，XBP-1同种型1(标记"XBP-1"的道)和XBP-1同种型2(标记"X54"的道)表达水平提高。此外，数据(未示出)表明，在用编码Bip的表达载体瞬时转染的细胞中，BiP表达水平提高，而在留下的未转染或用空白载体单独转染的细胞中，没有检测到BiP表达。实施例7UPR基因转录本水平对抗体分泌速率的影响分析了UPR基因转录本水平对抗体分泌速率的影响。使用Ambion的基于互联网的siRNATargetFinderTool(www.ambion.com/techlib/misc/siRNA—finder.html)，来设计乾向BiP、CHOP和XBP-1基因转录本的双链siRNA分子，并使用SilencersiRNAConstructionKit(AmbionInc.，Woodward,TX，产品目录号11620)合成上述分子。针对每种耙转录本，设计两条siRNAs。通过电穿孔，用3ng如图10所示的每种双链siRNAs来转染标准条件下培养的3xl06个C168J细胞。将电穿孔的细胞悬浮在2ml如上述实施例1所述的IMDM培养基中，然后在T-12培养板上培养。8天后测定活细胞浓度。8天后还使用标准的浊度测定技术，来测定IgGlmAb浓度。图7的结果显示，通过改变针对抗体分泌速率的UPR基因转录本水平，可调节抗体分泌速率。用能阻止UPR基因BiP、CHOP和XBP-l同种型从RNA转录本表达的短干扰RNAs(siRNA)去转染高分泌C168J细胞，会降低减少了C168J细胞的IgGl分泌速率。实施例8通过增加UPR基因转录本和表达水平提高抗体分泌速率UPR蛋白的过表达能增加蛋白(例如mAb)的细胞分泌速率。用编码BiP、CHOP、XBP-1和其他UPR相关蛋白的表达载体构建体，去转染蛋白分泌细胞系(例如mAb分泌细胞系)，以实现这些蛋白的过表达。用这些表达载体构建体单独或组合转染细胞。于使用标准技术转染后的第2、4和6天，确定合适的蛋白分泌速率，例如抗体分泌速率。比较转染细胞和未转染对照细胞的蛋白分泌速率。预计在过表达一种或多种UPR蛋白的细胞中，蛋白分泌速率更高。在Bip或Xbp-l的组成型过表达会最终诱导这些细胞凋亡的情况下，可将这些基因置于诱导型启动子下游并仅在需要时才激活。实施例9用CHOP-10编码siRNA稳定转染的骨髓瘤细胞中抗体分泌速率增加用产生CHOP-10特异性siRNAs的DNA构建体对C465A骨髓瘤细胞进行稳定转染，增加了抗体分泌速率(图8)。使用Ambion基于互联网的siRNATargetFinderTool(www.ambion.com/techlib/misc/siRNA—finder,html)i殳i十出两种不同的耙向CHOP-10基因转录本的siRNA分子。设计的siRNA分子为短发夹型。合成编码这些siRNAs的核酸(SEQIDNO:15和SEQIDNO:16)，使用标准方法将它们克隆进pSILENCER4.1-neo载体(AmbionInc.，Woodward,TX)的BamHI和HindIII位点。将SEQIDNO:15所示的核苷酸序列克隆入pSILENCER4.1-neo，产生Pch叩l，而将SEQIDNO:16所示的序列克隆入该载体，却产生pCHOP2。然后通过电穿孔，将pCHOPl、pCHOP2和pSILENCER4.1國neo质粒DNAs分别转染入C465A骨髓瘤细胞中。接着，在5%C02气氛下，于371C，在含10%FBS和300Ag/mlG418的SFM8培养基中选出含有这些载体的稳定转染的骨髓瘤细胞。该选择培养基也包含1XMHX选择培养基，该1XMHX选择培养基含0.5mg/L霉酚酸、2.5mg/L次黄噤呤和50mg/L黄噤呤，以保持C465A细胞的稳定抗体表达。图8中所示的每种细胞系在含10%FBS、IXMHX和300ng/mlG418的SFM8培养基中悬浮培养6天。在这6天中每天测定活细胞密度和抗体滴度。通过标准的染料排除测定法来测定活细胞密度，并通过标准浊度测定技术来测定培养基中的抗体滴度。C465A骨髓瘤细胞系来自SP2/0骨髓瘤细胞系，其能稳定表达IgGlK同种型的人TNF-a特异性鼠mAb。C2-8骨髓瘤细胞系是用pCHOP2稳定转染的、从C465A获得的细胞系。C2-18骨髓瘤细胞系是用pCHOP2稳定转染的、从C465A获得的细胞系。Vll和V12细胞系是单独用pSILENCER4.1-neo稳定转染的、从C465A获得的细胞系；两种细胞系是独立产生的。所获得的数据表明，相对于对照C465A、Vll和V12细胞系，pCHOPl和pCHOP2编码的CHOP-10特异性siRNAs使抗体比生产率增加(图8)。本发明现已被完全描述，可进行不背离附加权利要求的精神和范围的许多改变和修饰，这对于本领域普通技术人员而言是显而易见的。权利要求1.一种用于改变蛋白细胞分泌速率的方法，包括步骤a)调节细胞中至少一种未折叠蛋白应答(UPR)途径组分的活性；和b)培养所述细胞。2.权利要求l的方法，其中所述细胞分泌速率被增加。3.权利要求2的方法，其中通过用编码UPR途径组分的核酸稳定转染所述细胞，来调节所述UPR途径组分。4.权利要求3的方法，其中所述UPR途径组分核酸编码具有SEQIDNO:l、3、5、7、9、11或13所示氨基酸序列的蛋白。5.权利要求4的方法，其中所述UPR途径组分核酸具有SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14所示的序列。6.权利要求3的方法，其中所述UPR途径组分是转录控制序列。7.权利要求2的方法，其中通过给予小分子来调节所述UPR途径组分。8.权利要求7的方法，其中所述小分子是毒胡萝卜素、衣霉素或脂多糖。9.权利要求3的方法，其中所述UPR途径组分是BiP、XBP或CHOP。10.权利要求2的方法，其中通过使所述细胞处于静止生长期来调节所述UPR途径组分。11.权利要求l的方法，其中所述细胞是骨髓瘤细胞。12.权利要求ll的方法，其中所述骨髓瘤细胞是Sp2/0、NS0、F0orAg653。13.权利要求ll的方法，其中所述骨髓瘤细胞是Sp2/0、NS0、F0或Ag653的亚克隆。14.权利要求l的方法，其中所述蛋白是抗体。15.权利要求l的方法，其中所述细胞分泌速率被减少。16.权利要求15的方法，其中通过用编码下述短干扰RNA(siRNA)的核酸稳定所述转染细胞，来调节UPR途径元件，所述短干扰RNA靶向编码UPR途径组分的核酸的转录本。17.权利要求2的方法，其中通过用编码下述siRNA的核酸稳定转染所述细胞，来调节UPR途径元件，所述siRNA靶向编码UPR途径组分的核酸序列的转录本。18.权利要求17的方法，其中所述siRNA靶向编码CHOP蛋白的核酸序列的转录本。19.权利要求18的方法，其中所述CHOP蛋白具有SEQIDNO:8或SEQIDNO:14所示的氨基酸序列。20.权利要求18的方法，其中所述核酸包含SEQIDNO:15或SEQIDNO:16所示的核酸序列。21.—种具有改变的细胞分泌速率的浆细胞，产生自如下步骤a)调节细胞中至少一种UPR途径组分活性；和b)培养所述细胞。22.权利要求21的浆细胞，是通过下述方法产生的用编码下述siRNA的核酸稳定转染所述细胞，来调节UPR途径元件活性，所述siRNA耙向编码UPR途径组分的核酸序列的转录本。23.权利要求22的浆细胞，其是SP2/0衍生的细胞，包含稳定转染的、编码下述siRNA的核酸，所述siRNA靶向编码CHOP蛋白的核酸序列的转录本。24.权利要求23的浆细胞，其分泌抗体。25.权利要求23的浆细胞，其是C2-8或C2-18细胞。26.—种转基因动物，包含权利要求21的浆细胞。27.—种分离的核酸序列，包含SEQIDNO:15所示的核酸序列。28.—种分离的核酸序列，包含SEQIDNO:16所示的核酸序列。全文摘要本发明公开了用于改变蛋白(例如抗体)的细胞分泌速率的方法，以及通过该方法产生的改变的细胞。所述方法和改变的细胞可用于产生高水平的用于治疗、诊断或研究目的的蛋白。文档编号C07K16/28GK101426812SQ200580017676公开日2009年5月6日申请日期2005年3月31日优先权日2004年3月31日发明者G·班尼什,J·吉尔斯-科马,M·里茨琴申请人:森托科尔公司