专利名称：非天然活性葡聚四糖烷基苷类化合物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及非天然的、人工合成的葡聚四糖烷基苷类化合物，其制备方法以及该化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
根据目前所知，能增强动物免疫能力并具有抗肿瘤活性的糖，大多为多糖，如香菇多糖、灵芝多糖、裂裥多糖等由实用菌中提取的多糖，或中草药中提取的多糖。己研究清楚的、有明确免疫、抗肿瘤活性的寡糖并不多。研究认为，糖的抑制肿瘤作用是通过人体的免疫系统来实现的，机体中免疫活性细胞的种类主要有单核巨噬细胞系统、淋巴细胞系统和粒细胞系统等。当机体具有正常的生理功能时，这些免疫活性细胞能吞噬并清除衰亡突变细胞(如癌细胞)、各种病原体(如细菌、真菌、寄生虫)等。部分专家认为，人人体内都有癌细胞存在。带有癌细胞的健康人不患癌症主要是因为人体中的免疫活性细胞的存在使癌细胞的繁殖速度与清除衰亡细胞速度处于一个动态平衡状态，若这一动态平衡因机体免疫系统的损伤而破坏，则癌细胞的繁殖速度就会大大高于被吞噬清除的速度，表现为癌症的发作。普通的化疗药物没有专一性，在杀害肿瘤细胞的同时也将大量正常细胞杀死，对人体有较大的毒副作用，也损伤了患者的元气，增添了病人完全康复的难度。糖的抗癌作用不是通过直接杀死癌细胞，它是通过宿主中介而起作用，即刺激机体的各种免疫活性细胞的成熟、分化和繁殖，使机体免疫系统恢复平衡，由机体的本身抗体去清除、吞噬癌细胞，它对人体细胞无任何毒害作用。
最新研究表明寡糖具有与相应多糖相似或更优良的生理功能，如抗癌药物香菇多糖的核心结构片段—香菇寡糖(六糖)—具有比香菇多糖更优良的抗癌活性(Jun Ning等，Bioorg.Med.Chem.2003，11(10)2193-2203)。中国专利申请公开说明书CN 1687093A也公开了一类非天然活性寡糖化合物，优选的为六糖、七糖化合物。在此基础上，本申请的发明人设计合成了结构相对较为简单、易于生产的非天然活性葡聚四糖烷基苷类化合物，期待这类新化合物能够展现出更强的抗癌活性。
发明目的根据以上情况，本发明的目的在于提供非天然活性葡聚四糖烷基苷类化合物，该类化合物具有化学结构明确，易于大量合成，易于质量控制等多糖不可比拟的优点，具备取代某些多糖用于制药和保健品领域的良好前景。
本发明的另一个目的是提供上述非天然活性葡聚四糖烷基苷类化合物的合成方法。
本发明进一步的目的是提供上述化合物在制备抗肿瘤药物中的用途。
发明内容
本发明所述非天然活性葡聚四糖烷基苷类化合物用下述通式(I)表示
式中n为1-18的整数。
优选的本发明化合物是其中n为8、12、16的式(I)化合物，以下分别用四糖II、四糖III和四糖IV表示。
本发明还提供了上述化合物的合成方法。该合成方法先制备单糖受体V，然后以路易斯酸作催化剂，在非极性溶剂中与三糖供体(Z′L)偶联制得有保护基的寡糖VI，再去保护即得到所需要的寡糖I。
其中，Z′为带保护基的三糖，L为离去基团，Z为无保护基的三糖，R为C1-18的烷基。
所述的催化剂路易斯酸可用任一可行的路易斯酸，优选的为三甲基硅三氟甲磺酸酯、三氟化硼-乙醚等。
所述的非极性溶剂无特别限制，可选乙醚、乙腈、二氯甲烷、甲苯等。
采用现有技术的方法，也可制得本发明的化合物，但步骤较长，较为繁琐。按中国专利申请公开说明书CN 1687093A中公开的制备方法，六糖需要25步反应，七糖需要32步反应，如用该法制备本发明的四糖则需要21步反应。而本发明只用了17步反应，大大缩短了反应步骤。如用文献(Jun Ning等，Bioorg.Med.Chem.2003，11(10)2193-2203)的方法制备本发明的四糖也需要18步反应，且由带保护基的三糖与单糖连接成四糖后，还要经过7步反应才能制得本发明的不带保护基的四糖，这将消耗大量的三糖与单糖；而本发明的方法由带保护基的三糖与单糖连接成四糖后，只经过1步脱保护基反应就能制得本发明的不带保护基的四糖，因此，本发明的不带保护基的四糖用本发明的制备方法制备为佳。
本发明所述的寡糖化合物在动物试验中显示对肿瘤有明显的抑制作用，可用于制备抗肿瘤的药物，使用时可注射或口服，可单独使用或与其它药物合用。
与中国专利申请公开说明书CN 1687093A中公开的化合物相比，本发明的化合物结构更简单，制备方法更为简便，化合物的抗肿瘤活性更高，易于合成，质量可控，有利于工业化大生产。
具体实施例方式
下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1四糖II的制备1、单糖受体3的制备 (1)、单糖供体1的制备在反应器中，加入D-葡萄糖(3.60g，20.0mmol)、三苯甲基氯(6.69g，24.0mmol)和吡啶40ml，加热到70℃，搅拌反应8小时，冷却到0℃，加入苯甲酰氯(10.3mL，88mmol)，室温搅拌反应24小时，加入二氯甲烷100ml，依次用水、1N HCl、饱和NaHCO3/H2O洗，无水Na2SO4干燥，旋干，加入二氯甲烷100ml、甲醇100ml、乙酰氯0.2ml，室温搅拌反应1小时，用三乙胺中和，蒸出溶剂，加入吡啶40ml、乙酸酐30ml，室温搅拌反应4小时，旋干，加入四氢呋喃90ml、甲醇60ml，通氨饱和，温搅拌反应4小时.旋干，加入二氯甲烷50ml、K2CO33g、三氯乙腈3ml，温搅拌反应12小时，过滤，滤液浓缩后上硅胶柱精制，用石油醚/乙酸乙酯(3/1)作为淋洗液，收集相立组分，得到1(7.60g)，产率56％(六步总收率)，Mp59-60℃；[α]D+45.6°(c1.0，CHCl3)；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.65(s，1H，NH)，7.97-7.28(m，15H，BzH)，6.82(d，1H，J＝3.6Hz，H-1)，6.24(t，1H，J＝10.0Hz，H-3)，5.74(t，1H.J＝9.8Hz，H-4)，5.59(dd，1H，J＝3.6，10.0Hz，H-2)，4.50(m，1H，H-5)，4.35-4.26(m，2H，H-6)，2.08(s，3H，COCH3).Anal.Calcd for C31H26Cl3NO10C，54.84.H，3.86.FoundC，54.66；H，3.98.
(2)、单糖受体3的制备在反应器中，加入1(1.29g，1.9mmol)、正辛醇(0.4ml，2.5mmol)、二氯甲烷20ml、三甲基硅三氟甲磺酸酯(TMSOTF)30μl，室温搅拌反应2小时，用三乙胺中和，浓缩后上硅胶柱精制，用石油醚/乙酸乙酯(5/1)作为淋洗液，收集相应组分，得到2(1.08g)，产率88％。
在反应器中，加入2(0.97g，1.5mmol)、二氯甲烷2ml、无水甲醇40ml、乙酰氯0.2ml，室温放置5小时，三乙胺中和，蒸出溶剂，二氯甲烷溶样上硅胶柱精制，用石油醚/乙酸乙酯(3/1)作为淋洗液，收集相应组分，得到3(0.82g)，产率90％，[α]D-10.5°(c1.0，CHCl3)；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.97-7.26(m，15H，BzH)，5.93(t，1H，J＝9.6Hz)，5.53-5.47(m，2H)，4.82(d，1H，J＝8.0Hz，H-1)，3.95(m，1H)，3.87(dd，1H，J＝1.6，12.0Hz)，3.82-3.73(m，2H)，3.54(m，1H)，2.42(s，1H，OH)，1.54-0.98(m，12H，CH2C6H12CH3)，0.81(t，3H，J＝5.8Hz，CH2CH3)；13CNMR(100MHz，CDCl3)δ165.82，165.73，164.91(3C，C(＝O)Ph)，133.48-128.14(Ph)，101.09(1C，C-1)，74.48，72.73，71.78，70.19，69.50，61.24(6C，C-2，3，4，5，6，OCH2)，31.55，29.24，29.07，28.94，25.64，22.44，13.93(7C，OCH2C6H12CH3).Anal.Calcd for C35H40O9C，69.52；H，6.67.FoundC，69.36；H，6.88.
2、三糖供体4的制备三糖供体4的制备，在本发明之前已有公开记载，可按公开文献(Jun Ning等，Bioorg.Med.Chem.2003，11(10)2193-2203)的方法制备。
3、四糖II的制备
在反应器中，加入4(1.57g，1.0mmol)、3(0.60g，1.0mmol)、二氯甲烷15ml、三甲基硅三氟甲磺酸酯(TMSOTF)20μl，室温搅拌反应2小时，用三乙胺中和，浓缩后上硅胶柱精制，用石油醚/乙酸乙酯(3/1)作为淋洗液，收集相应组分，得到5(1.81g)，产率90％，Mp 101-103℃；[α]D-6.2°(c1.0，CHCl3)；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.11-7.21(m，55H，BzH)，6.15(t，1H，J＝9.6Hz)，5.96-5.85(m，2H)，5.77-5.63(m，2H)，5.61-5.52(m，3H)，5.43(m，1H)，5.10(d，1H，J＝8.0Hz)，4.92(d，1H，J＝8.0Hz)，4.77(d，1H，J＝8.0Hz)，4.71-4.51(m，6H)，4.38(m，1H)，4.18-4.14(m，2H)，3.97-3.92(m，2H)，3.87-3.75(m，3H)，3.67(m，1H)，3.56(m，1H)，3.47-3.43(m，2H)，2.02(s，3H，COCH3)，1.96(s，3H，COCH3)，1.57-1.04(m，12H，CH2C2H12CH3)，0.88(t，3H，J＝6.6Hz，CH2CH3)；13CNMR(100MHz，CDCl3)δ169.38，168.02(2C，C(＝O)CH3)，166.04，165.96，165.80，165.70，165.63，165.30，165.22，165.09，165.01，164.97，164.96(11C，C(＝O)Ph)，133.40-128.11(Ph)，101.11，100.99，100.89，100.21(4C，C-1A，1B，1C，1D).Anal.Calcd for C113H106O34C，67.59；H，5.32.FoundC，67.28；H，5.60.
在反应器中，加入5(1.61g，0.8mmol)、二氯甲烷5ml、无水甲醇100ml、通氨饱和，室温放置10天，用薄层分析检测反应，反应完成后，减压浓缩后上硅胶柱精制，用无水乙醇作为淋洗液，收集相应组分，得到粉末状产物II(0.57g)，产率91％，[α]D-16.0°(c1.0，H2O)；1H NMR(400MHz，D2O)4.52-4.40(m，3H)，4.17-4.12(m，2H)，3.87-3.78(m，5H)，3.71-3.52(m，8H)，3.49-3.05(m，12H)，1.63-1.10(m，12H，CH2C6H12CH3)，0.80(t，3H，J＝6.8Hz，CH2CH3)；13C NMR(100MHz，D2O)δ103.35，103.23，103.06，102.64(4C，C-1A，1B，1C，1D).Anal.Calcd for C32H58O21C，49.35；H，7.51.FoundC，49.02；H，7.88.ESIMS for C32H58O21(778.80)777.79[M-1]+.
实施例2四糖III的制备1、单糖受体7的制备 在反应器中，加入1(1.29g，1.9mmol)、十二醇(0.50g，2.7mmol)、二氯甲烷20ml、三甲基硅三氟甲磺酸酯(TMSOTF)30μl，室温搅拌反应2小时，用三乙胺中和，浓缩后上硅胶柱精制，用石油醚/乙酸乙酯(5/1)作为淋洗液，收集相应组分，得到6(1.11g)，产率83％。
在反应器中，加入6(0.98g，1.4mmol)、二氯甲烷2ml、无水甲醇40ml、乙酰氯0.2ml，室温放置5小时，三乙胺中和，蒸出溶剂，二氯甲烷溶样上硅胶柱精制，用石油醚/乙酸乙酯(3/1)作为淋洗液，收集相应组分，得到7(0.80g)，产率86％，[α]D-9.8°(c1.0，CHCl3)；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.97-7.27(m，15H，BzH)，5.93(t，1H，J＝9.8Hz)，5.52-5.46(m，2H)，4.82(d，1H，J＝7.6Hz，H-1)，3.94(m，1H)，3.86(dd，1H，J＝2.0，12.4Hz)，3.81-3.73(m，2H)，3.53(m，1H)，1.52-1.05(m，20H，CH2C10H20CH3)，0.88(t，3H，J＝7.2Hz，CH2CH3).Anal.Calcd for C39H48O9C，70.89；H，7.32.FoundC，70.58；H，7.61.
2、四糖III的制备 在反应器中，加入4(1.57g，1.0mmol)、7(0.66g，1.0mmol)、二氯甲烷15ml、三甲基硅三氟甲磺酸酯(TMSOTF)20μl，室温搅拌反应2小时，用三乙胺中和，浓缩后上硅胶柱精制，用石油醚/乙酸乙酯(3/1)作为淋洗液，收集相应组分，得到8(1.77g)，产率86％，Mp72-73℃；[α]D-15.2°(c1.0，CHCl3)；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.13-7.15(m，55H，BzH)，6.07(t，1H，J＝9.6Hz)，5.88-5.77(m，2H)，5.69-5.59(m，2H)，5.55-5.44(m，3H)，5.35(m，1H)，5.01(d，1H，J＝8.0Hz)，4.83(d，1H，J＝8.0Hz)，4.68(d，1H，J＝8.0Hz)，4.63-4.55(m，3H)，4.50-4.43(m，3H)，4.28(m，1H)，4.09-4.05(m，2H)，3.90-3.84(m，2H)，3.81-3.67(m，3H)，3.59(m，1H)，3.47(m，1H)，3.39-3.35(m，2H)，1.94(s，3H，COCH3)，1.89(s，3H，COCH3)，1.49-0.99(m，20H，CH2C10H20CH3)，0.88(t，3H，J＝7.2Hz，CH2CH3)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ169.40，168.07(2C，C(＝O)CH3)，166.11，166.04，165.89，165.79，165.72，165.39，165.31，165.16，165.11，165.03，165.00(11C，C(＝O)Ph)，133.63，128.18(Ph)，101.21，101.10，100.94，100.30(4C，C-1A，1B，1C，1D).Anal.Calcd for C117H114O34C，68.08；H，5.57.FoundC，67.79；H，5.78.
在反应器中，加入8(1.44g，0.7mmol)、二氯甲烷5ml、无水甲醇100ml、通氨饱和，室温放置10天，用薄层分析检测反应，反应完成后，减压浓缩后上硅胶柱精制，用无水乙醇作为淋洗液，收集相应组分，得到粉末状产物III(0.50g)，产率85％，[α]D-32.2°(c1.0，H2O)；1H NMR(400MHz，D2O)4.62-4.55(m，4H)，4.54-4.51(m，3H)，4.31-3.95(m，2H)，3.80-3.62(m，4H)，3.61-3.48(m，3H)，3.47-3.10(m，14H)，1.43-0.97(m，20H，CH2C10H20CH3)，0.70(t，3H，J＝5.6Hz，CH2CH3).13C NMR(100MHz，D2O)δ103.48，103.35，103.16，102.79(4C，C-1A，1B，1C，1D).Anal.Calcd for C36H66O21C，51.79；H，7.97.FoundC，51.87；H，7.86.ESIMS for C36H66O21(834.91)833.89[M-1]+.
实施例3四糖IV的制备
1、单糖受体10的制备 在反应器中，加入1(1.29g，1.9mmol)、十六醇(0.61g，2.5mmol)、二氯甲烷20ml、三氟化硼-乙醚0.5ml，室温搅拌反应2小时，用三乙胺中和，浓缩后上硅胶柱精制，用石油醚/乙酸乙酯(6/1)作为淋洗液，收集相应组分，得到9(1.20g)，产率83％。
在反应器中，加入9(1.06g，1.4mmol)、二氯甲烷2ml、无水甲醇40ml、乙酰氯0.2ml，室温放置5小时，三乙胺中和，蒸出溶剂，二氯甲烷溶样上硅胶柱精制，用石油醚/乙酸乙酯(4/1)作为淋洗液，收集相应组分，得到10(0.90g)，产率90％，[α]D.-2.0°(c1.0，CHCl3)；1H NMR(400MHz，CDCl3)7.99-7.27(m，15H，BzH)，5.93(t，1H，J＝9.8Hz)，5.52-5.43(m，2H)，4.81(d，1H，J＝8.0Hz，H-1)，3.94(m，1H)，3.86(dd，1H，J＝2.0，12.4Hz)，3.81-3.73(m，2H)，3.53(m，1H)，1.54-1.06(m，28H，CH2C14H28CH3)，0.88(t，3H，J＝7.0Hz，CH2CH3).Anal.Calcd for C43H56O9C，72.04；H，7.87.FoundC，71.86；H，7.98.
2、四糖IV的制备
在反应器中，加入4(1.57g，1.0mmol)、10(0.72g，1.0mmol)、无水乙醚25ml、三甲基硅三氟甲磺酸酯(TMSOTF)20μl，室温搅拌反应2小时，用三乙胺中和，浓缩后上硅胶柱精制，用石油醚/乙酸乙酯(4/1)作为淋洗液，收集相应组分，得到11(1.80g)，产率85％，Mp 66-68℃，[α]D-17.5°(c1.0，CHCl3)；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.12-7.18(m，55H，BzH)，6.02(t，1H，J＝9.6Hz)，5.79-5.67(m，2H)，5.62-5.50(m，2H)，5.46-5.33(m，3H)，5.27(m，1H)，5.00(d，1H，J＝8.0Hz)，4.75(d，1H，J＝8.0Hz)，4.57(d，1H，J＝8.0Hz)，4.56-4.48(m，3H)，4.38-4.34(m，3H)，4.21(m，1H)，4.02-4.01(m，2H)，3.82-3.75(m，2H)，3.68-3.58(m，3H)，3.49(m，1H)，3.38(m，1H)，3.30-3.26(m，2H)，1.87(s，3H，COCH3)，1.81(s，3H，COCH3)，1.43-0.87(m，28H，CH2C14H28CH3)，0.85(t，3H，J＝7.0Hz，CH2CH3)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ169.36，168.03(2C，C(＝O)CH3)，166.08，166.00，165.94，165.82，165.77，165.45，165.34，165.21，165.16，165.06，165.02(11C，C(＝O)Ph)，133.68，128.23(Ph)，101.16，101.04，100.86，100.23(4C，C-1A，1B，1C，1D).Anal.Calcd for C121H122O34C，68.54；H，5.80.FoundC，68.29；H，5.97.
在反应器中，加入11(1.70g，0.8mmol)、二氯甲烷1ml、无水甲醇100ml、通氨饱和，室温放置10天，用薄层分析检测反应，反应完成后，减压浓缩后上硅胶柱精制，用无水乙醇作为淋洗液，收集相应组分，得到粉末状产物IV(0.59g)，产率83％，[α]D-34.5°(c1.0，H2O)；1H NMR(400MHz，D2O)13CNMR(100MHz，D2O)δ102.69，102.54，102.43，101.96(4C，C-1A，1B，1C，1D).Anal.Calcd for C40H74O21C，53.92；H，8.37.FoundC，53.53；H，8.64.ESIMS forC40H74O21(891.01)890.00[M-1]+.
实施例4动物抑瘤试验取昆明小鼠120只、体重18-22g、雌雄兼用。取接种7-8天之腹水瘤按1∶15稀释计数、使终浓度为1000万个S180瘤细胞/ml；每鼠腋下接种0.2ml。(含200万个S180瘤细胞)，次日随机均分11组实施例制备的化合物II、III、IV 4mg/kg、2mg/kg、1mg/kg、空白对照组及环磷酰胺(CY)40mg/kg组，药物组每天给药一次(尾静脉注射iv)，连续给药10天，对照组则给予相应体积的生理盐水(NS)液，CY组间日给药一次。末次给药后停药一天，脱颈处死动物，称体重，剖瘤称重，按下公式计算肿瘤抑制率并用t检验比较组间差异。
试验结果见表1、2和表3。
表1 实施例1制备的化合物II对S180小鼠的抗肿瘤作用
以上试验结果显示，实施例1制备的化合物II对荷S180小鼠肿瘤有明显抑制作用(P＜0.01)。
表2 实施例2制备的化合物III对S180小鼠的抗肿瘤作用
以上试验结果显示，实施例2制备的化合物III对荷S180小鼠肿瘤有明显抑制作用(P＜0.001)。
表3 实施例3制备的化合物IV对S180小鼠的抗肿瘤作用
以上试验结果显示，实施例3制备的化合物IV对荷S180小鼠肿瘤有明显抑制作用(P＜0.001)。
权利要求
1.一类非天然活性葡聚四糖烷基苷类化合物，具有如下结构 其中n为1-18的整数。
2.按照权利要求1所述的化合物，其中n为8。
3.按照权利要求1所述的化合物，其中n为12。
4.按照权利要求1所述的化合物，其中n为16。
5.权利要求1所述非天然活性葡聚四糖烷基苷类化合物的制备方法，其特征在于先制备单糖受体V，然后以路易斯酸作催化剂，在非极性溶剂中与三糖供体(Z′L)偶联制得有保护基的寡糖VI，再去保护即得到所需要的寡糖I； 其中，Z′为带保护基的三糖，L为离去基团，Z为无保护基的三糖，R为C1-18的烷基；所述的催化剂选自路易斯酸中的三甲基硅三氟甲磺酸酯、三氟化硼-乙醚；所述的非极性溶剂选自乙醚、乙腈、二氯甲烷、甲苯。
6.权利要求1～4中任一化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及非天然活性葡聚四糖烷基苷类化合物，其结构如通式I所示。本发明还涉及该化合物的制备方法以及在制备抗肿瘤药物中的应用。
文档编号C07H3/06GK1931867SQ20061009515
公开日2007年3月21日 申请日期2006年9月26日 优先权日2006年9月26日
发明者衡林森 申请人:重庆邮电大学